Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 10
2.1. Функции и молекулярные механизмы действия интерферонов 10
2.1.1. Классификация и структура интерферонов (IFN) 10
2.1.2. Действие IFN на клетки 11
2.1.2.1. Антивирусная активность IFN 11
2.1.2.2. Антибактериальная активность IFN 12
2.1.2.3. Противоопухолевая активность IFN 12
2.1.2.4. Иммуномодулирующая активность IFN 13
2.1.3. Молекулярный механизм передачи сигнала IFN 14
2.1.4. IFN-индуцируемые белки 16
2.2.7.1. 2,-5'-олигоаденилат-синтетаза (2-5AS) и РНКаза L 16
2.2.7.3. Индоламин-2,3-диоксигеназа (IDO) 18
2.2. Триптофанил-трнк-синтетазa (WRS) 19
2.2.1. Структура WRS млекопитающих 19
2.2.2. Каноническая активность WRS - синтез триптофанил-тРНК 22
2.2.3. Неканонические активности WRS 23
2.2.4. Ген WRS человека и регуляция его экспрессии под действием интерферона 25
2.2.5. Способность WRS к синтезу Ар3А и роль АрзА в клеточном ответе на IFN 29
2.3. Регуляция клеточного цикла З О
2.3.1. Циклин-зависимые киназы (CDK) - основные регуляторы клеточного цикла 30
2.3.2. Фосфорилирование CDK 34
2.3.3. Субстраты CDK 3 5
2.3.4. Ингибиторы циклин-зависимых киназ (СКІ) 37
2.3.5. Контроль клеточного цикла и онкогенез 42
2.3.6. Молекулярные механизмы влияния IFN на клеточный цикл 43
3. Материалы и методы 49
3.1. Реагенты 49
3.2. Проверка чистоты используемых материалов 49
3.3. Определение концентрации белка 49
3.4. Аналитическая гель-фильтрация и ионообменная хроматография 50
3.5. Электрофорез 50
3.6. Определение активности WRS в реакции аминоацилирования тРНК 51
3.7. Выделение рекомбинантного WRS человека 51
3.8. Антитела и антисыворотки, очистка поликлональных антител (пАТ) 52
3.9. Иммуноблотгинг 53
3.10. Иммунопреципитация белков 53
3.11. Ингибирование киназной активности CDK 54
3.12. Клеточные культуры 55
3.13. Получение клеточных экстрактов 55
3.14. Конструкция антисмысловой WRS и трансфекция клеток человека 55
3.15. Анализ пролиферативной активности клеток с помощью изотопного мечения 56
3.16. Анализ мРНК методом Нозерн-гибридизации 56
4. Результаты и их обсуждение 58
4.1. Влияние модуляторов активности протеинкиназ на экспрессию гена wrs человека 58
4.1.1. Влияние IFNy и активатора протеинкиназы С (РКС) на содержание WRS в клетках человека 58
4.1.2. Влияние ингибиторов РКС на экспрессию WRS 63
4.1.3. Возможные механизмы активации экспрессии гена WRS человека протеинкиназой С 68
4.1.4. Индукция WRS протеинкиназой С объясняет повышение уровня АрзА в ответ на РМА 70
4.1.5. Взаимосвязь некоторых РКС- и IFN-регулируемых белков 71
4.2. Исследование механизмов взаимодействия wrs с cdk в ходе клеточного ответа на IFNy 75
4.2.1. Изучение влияния WRS человека на активность протеинкиназ 75
4.2.2. Исследование механизма ингибирования киназ семейства CDK 79
4.2.3. Влияние WRS на связывание CDK с циклинами 83
4.3. Исследование роли WRS в антипролиферативной активности IFNy 87
4.3.1. Возможная роль WRS в регуляции клеточного цикла интерфероном 87
4.3.2. Влияние WRS на антипролиферативное действие IFNy 89
4.3.3. Роль различных ингибиторов CDK в антипролиферативной активности IFNy 95
5. Выводы 101
6. Список литературы 102
- Ген WRS человека и регуляция его экспрессии под действием интерферона
- Ингибиторы циклин-зависимых киназ (СКІ)
- Анализ мРНК методом Нозерн-гибридизации
- Взаимосвязь некоторых РКС- и IFN-регулируемых белков
Введение к работе
Актуальность работы
Илтерфероны (IFN), главные цитокины врожденного иммунного ответа, играют ключевую роль в регуляции антивирусной и противоопухолевой защиты организма. Врожденный иммунный ответ особенно важен на ранней стадии защиты организма от биологической агрессии, до того как развивается антиген-специфический адаптивный иммунный ответ. Это приводит к формированию защитного состояния в инфицированном организме, позволяя снизить интенсивность инфекционного процесса и давая достаточное время для формирования адаптивного иммунного ответа. IFN организуют этот «первый рубеж» защиты от чужеродных агентов, повышая (или снижая) экспрессию целого ряда генов. Несмотря на то, что роль некоторых из IFN-индицируемых белков в защитных реакциях хорошо известна (таких, например, как компоненты главного комплекса гистосовместимости, протеинкиназа R, 2'-5'-юлигоаденилат-синтетаза (2-5AS) или РНКаза L), другие IFN-индуцируемые белки требуют более глубокого исследования для понимания широкого спектра эффектов, вызываемых IFN.
Одним из таких белков является трилтофанил-тРНК-синтетаза (WRS, К.Ф. 6.1.1.2) человека. Известно, что WRS вовлечен в различные защитные реакции организма. Помимо индукции различными IFN, экспрессия WRS повышается в ходе кожной реакции гиперчувствительности замедленного типа [Yang et al., 2001] и на последних стадиях созревания мононуклеарных фагоцитов [Krause et al., 1996]. Недавно было обнаружено, что WRS человека обладает выраженной антиангиогенной активностью, являясь, таким образом, цитокином [Wakasugj et al., 2002; Otani et al., 2002], в связи с чем было предложено использовать WRS человека для лечения гипоксических и других пролиферативных ретинопатии. Помимо так называемой «канонической» активности WRS (активация триптофана для последующего его использования в биосинтезе белка путем связывания его со специфической тРНК), которая была подробно охарактеризована, WRS обладает рядом «неканонических» активностей, являясь, таким образом, полифункциональным белком. В частности, ранее нами было показано, что N-домен WRS быка (но не человека) ІО&лаяат ЩНВ1**АММВгаЙ
1 sr&SMA
активностью [Елизаров и соавт., 1997]. Однако, с момента неожиданного открытия IFN-индуцируемости WRS человека, более десятилетия роль WRS в ответе клетки на IFN остается не до конца понятной и вызывает большой интерес исследователей.
Исследование механизмов действия интерферонов является актуальной для современной иммунологии и биохимии проблемой. Возрастающий интерес исследователей и практических врачей к этой проблеме обусловлен не только высокой эффективностью применения препаратов интерферона при таких патологических состояниях, как вирусные и онкологические заболевания, болезни крови, но и неуклонным ростом числа больных, страдающих вышеперечисленными заболеваниями, что придает исследованию особенную актуальность.
Цель исследования: изучение путей регуляции и механизмов действия IFNy-индуцируемой WRS человека как части IFNy-зависимой защитной системы организма.
Задачи исследования:
изучение влияния модуляторов активности протеинкиназы С на экспрессию
IFNY-индуцируемого гена WRS в культуре клеток человека HeLa и НЕК293;
изучение влияния IFNy-индуцируемого WRS человека на активность киназ
семейства CDK человека;
исследование механизмов взаимодействия WRS с CDK в ходе клеточного
ответа на IFNy;
исследование роли IFN-индуцируемого WRS человека в развитии
антипролиферативного действия IFNy.
Научная новизна работы
Показано, что ген WRS индуцируется IFNy в эмбриональной почечной линии клеток человека НЕК293. Показано, что протеинкиназа С положительно регулирует экспрессию гена WRS человека. На основе полученных данных была предложена гипотетическая схема участия протеинкиназы С в согласованной
регуляции ряда IFN-индуцируемых ферментов, связанных с метаболизмом триптофана и 5'5"'-диаденозинтрифосфата (АрзА), и обладающих противовирусной и противоопухолевой активностью.
Установлена ранее неизвестная CDK-ингибирующая активность WRS человека и показана ее роль в антипролиферативном действии IFNy. Продемонстрировано, что рекомбинантный WRS человека ингибирует киназную активность CDK in vitro, и EFNy-инцуцированный WRS человека ингибирует активность CDK в культуре клеток человека. Обнаружено, что индукция WRS в ответ на IFNy вызывает образование комплекса WRS с cdc2 и CDK2 в клетках HeLa, что- сопровождается высвобождением активирующей субъединицы циклина из комплекса с cdc2 и CDK2. Доказано, что WRS непосредственно вовлечен в развитие антипролиферативного действия IFNy в культуре клеток человека. Эти данные демонстрируют ранее неизвестные механизмы воздействия IFNy на клетки человека.
Практическая значимость работы
Полученные новые данные о механизмах действия IFNy на клетки человека важны дня понимания патогенеза вирусных и онкологических заболеваний и могут послужить для прогнозирования течения этих заболеваний и разработки новых подходов их лечения. Кроме того, эти данные могут помочь более эффективно использовать IFNy для лечения онкологических и инфекционных заболеваний.
Положения, выносимые на защиту
-
Протеинкиназа С активирует экспрессию гена WRS в клетках человека HeLa и НЕК293.
-
WRS человека специфически ингибирует активность cdc2 и CDK2 человека in vitro.
-
В ходе ответа клетки на IFNy WRS человека образует комплекс с cdc2 и CDK2 в клетках человека, что сопровождается высвобождением активирующей субъединицы циклина из комплекса с cdc2 и CDK2.
4.WRS непосредственно вовлечен в развитие антяпролиферативного действия IFNy в клетках НЕК293 и HeLa.
Апробация работы
Материалы работы были представлены на международной конференции The cell cycle and its checkpoints Jacques Monod Conference CNRS (RoscofiE France, 2002).
Публикации-
По материалам диссертации опубликовано 2 печатных работы, 1 работа подана в печать.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 117 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы (224 наименования). Диссертация содержит 19 рисунков и 3 таблицы.
Ген WRS человека и регуляция его экспрессии под действием интерферона
В начале 90-х годов совершенно неожиданно выяснилось, что аминокислотная последовательность одного из белков, индуцируемых IFNy и а в культурах клеток человека [Fleckner et al., 1991; Rubin et al., 1991], совпадает с известной последовательностью WRS человека [Frolova et ah, 1991]. Более того, оказалось, что стимуляция клеток IFN приводит к индукции и активации WRS [Fleckner et ah, 1991; Rubin et a!., 1991; Buwitt et ah, 1992; Bange et al., 1992]. Экспрессия гена WRS сильно индуцируется IFNy и несколько меньшей степени IFNa в различных клеточных линиях [Fleckner et ah, 1995]. Трансформирующий фактор роста р (TGFp), подавляющий многие IFN-индуцируемые клеточные процессы, снимает IFNy-стимуляцию экспрессии WRS [Yuan et ah, 1998].
Помимо индукции под действием IFN, экспрессия WRS повышается также под действием поли{І)-поли(С) в различных человеческих клеточных линиях [Fleckner et al., 1995], на последних стадиях созревания мононуклеарных фагоцитов [Krause et al., 1996] и при созревании под действием липополисахарида незрелых дендритных клеток [Matsunaga et al., 2002]. Кроме того, экспрессия WRS повышается под действием эритропоэтина в человеческих эндотелиальных клетках [Fodinger et al., 2000] и в ходе кожной реакции гиперчувствителыюсти замедленного типа у морской свинки [Yang et al., 2001]. В данной работе рассматриваются только ферменты млекопитающих, однако стоит заметить, что в ходе онтогенеза дрозофилы наблюдается высокий уровень экспрессии WRS в слюнных железах [Seshaiah & Andrew, 1999].
Таким образом, экспрессия гена WRS регулируется рядом цитокинов и в ходе различных важных событий. Вовлеченность WRS в столь различные и значительные клеточные события предполагает важную роль этого многофункционального белка в регуляции ключевых функций клетки, по-видимому связанных с регуляцией дифференцировки и неспецифических защитных реакций.
Феномен сильной регуляции, например интерфероном, ответственным за антивирусную и антипролиферативную реакции клеток [см. Stark et al., 1998; Sangfelt et al., 2000], синтеза такого конститутивного белка, как WRS, является весьма необычным. В самом деле, сильную индукцию WRS под действием IFN трудно связать с канонической функцией WRS — синтезом триптофанил-тРНК, поскольку известно, что IFN подавляют интенсивность биосинтеза белка в клетках человека [Jagus et al., 1999]. В связи с этим, наибольший интерес исследователей в последнее десятилетие привлекают неканонические активности WRS.
Установлены экзон-интронная структура, структура промоторной области, содержащей ряд элементов IFN ответа (Рис. 2) [Frolova et al., 1993 с], и хромосомная локализация [Graphodatsky et al., 1993; Borglum et al., 1996] гена WRS человека. Единственная копия гена WRS человека располагается на длинном плече хромосомы 14, локус q32.2 - q32.32, и состоит из 12 экзонов, 10 из которых являются транслируемыми (П-ХГ) и 2 - нетранслируемыми (1а и lb) (Рис. 2 А) . Кодирующая область гена начинается в середине II экзона.
Промоторная область гена WRS человека содержит сайт GAS (IFN -активируемый сайт). Этот элемент ДНК связывает IFNx-активируемый фактор (GAF), димер STAT1 (известного также как р91) [Strehlow et al., 1993]. В этой работе ни один из потенциальных элементов IFN-стимулируемого ответа (ISRE) в промоторной области гена WRS человека не функционировал как активатор транскрипции; центральная роль в IFNy-индуцированной транскрипции гена WRS приписывалась ближайшему к старту транскрипции элементу GAS, так называемому IFP53 GAS [Strehlow et al., 1993], Та же группа исследователей идентифицировала GAS-ассоциированный индуцируемый дифференцировкой фактор (DIF), не содержащий STAT1, и показала, что этот фактор связывается с IFP53 GAS [Eilers et al., 1994]. Позднее было показано, что STAT5 также способен специфически связываться с IFP53 GAS и активировать контролируюмую им транскрипцию [Mellitzer et al., 1996]. Однако поскольку было показано, что IFN-индуцированная транскрипция WR.S подавляется ингибитором белкового синтеза циклогексимидом [Fleckner et al., 1995], представляется невероятным, что главную роль в индукции WRS человека играет STAT1 (р91), находящийся в латентной нефосфорилированной форме в цитоплазме. Это позволило предположить, что регуляция гена WRS происходит не с IFP53 GAS.
На самом деле промоторная область гена WRS человека содержит три потенциальных сайта GAS, два потенциальных элемента ISRE (interferon-stimulated response element, элемент IFN-стимулируемого ответа) и два мотива "Y-box" (Рис. 2 Б) [Frolova et al., 1993 с; Tolstrup et al., 1995]. Анализ транскрибируемой и промоторной областей мРНК WRS с помощью обратной цепной полимеразной реакции и реакции расширения праймера показал существование двух вариантов альтернативного сплайсинга в кодирующей области гена и нескольких вариантов сплайсинга некодирую щей области [Frolova ct al., 1991; Tolstrup et al., 1995]. Используя для траисфекции клеток человека серию конструкций, в которых различные участки промотора гена WRS человека контролировали экспрессию репортерного гена секретируемой щелочной фосфатазы, авторы определяли роль разных элементов промотора гена WRS в регуляции активности гена под действием IFNa и у. В НТ1080 и HeLa клетках наибольшая индуцируемость в ответ на IFNa и IFNy была обнаружена для конструкций, захватывающих 0,4 и 0,8 тыс. пар нуклеотидов выше старта транскрипции и содержащих один GAS, оба ISRE и один Y-Ьох. В то же время, конструкция, захватывающая 0,15 тыс. пар нуклеотидов выше старта транскрипции и содержащая один GAS и один ISRE, слабо отвечала лишь на обработку IFNy в НТ1080, но не давала ответа ни на IFNy в HeLa, ни на IFNa в обеих клеточных линиях. Эти данные [Tolstrup et al., 1995] опровергают утверждения [Strehlow et al., 1993] о том, что синтез мРНК WRS контролируется исключительно IFP53 GAS. Конструкции, включавшие в себя два удаленные GAS, не давали никакого эффекта в ответ на IFNa и лишь слабый ответ на IFNy, и только в НТ1080. Таким образом, было показано, что ни один из трех находящиеся в промоторной области гена WRS элементов GAS не играет значительной роли в индукции белка в ответ на IFNa и у, ведущая роль принадлежит ISRE.
Анализ последовательностей клонов кДНК, кодирующих WRS человека, показал, что существуют три изоформы кДНК WRS: 1) содержащая экзоны 1а и II-XI, 2) содержащая экзоны lb и ІГ-ХІ [Frolova et al., 1991] и 3) содержащая экзон 1а и Ш-ХІ [Tolstrup et al., 1995]. Последняя изоформа кДНК содержит в рамке считывания два кодона ATG, принадлежащие экзону III. Более подробный анализ мРНК WRS после индукции IFNy показал существование четырех изоформ, содержащих: 1. экзоны 1а и II-XI, 2. экзоны 1а и ІІ-ХІ, 3. экзоны la, lb и II-XI и 4. экзоны 1а и III-XI, см. Рис. 2 В [Turpaev et al., 1996]. Изоформа 1 отличается тем, что старт ее транскрипции находится на 90 пар ігуклеотидов выше, чем старт транскрипции остальных трех изоформ. Изоформы 3 и 4 по-видимому образуются из изоформы 2 путем альтернативного процессинга. И, поскольку изоформы 1 и 2 отличаются только разницей в старте транскрипции, было сделано заключение, что фрагмент между двумя стартами транскрипции регулирует процесс альтернативного процессинга мРНК WRS [Turpaev et al., 1996].
Ингибиторы циклин-зависимых киназ (СКІ)
IFN вызывает арест клеток человека в G0-G1 фазе [Creasey et al., 1980] и несколько реже при переходе G2-M [Николаева и соавт., 1984]. IFNcc-индуцированный арест В-клеточной линии Daudi сопровождается снижением фосфорилирования cdc2 и уровня мРНК cdc2 [Thomas, 1989] и подавлением синтеза циклина A [Bybee & Thomas, 1992]. Идентифицирована область промотора гена cdc2, ответственная за подавление его экспрессии в кератиноцитах человека [Dahler et al., 1998]. Кроме того, IFNy может значительно снижать уровень мРНК E2F1 в клетках человека [Saunders et al., 1994]. В клетках Daudi IFNa (как экзогенный, так и аутокринный) вызывает индукцию мРНК и белка Rb. Индуцированный Rb находится преимущественно в гипофосфорилированной форме, способной подавлять прохождение клеточного цикла. Антипролиферативное действие IFNa в этих клетках коррелирует с индукцией Rb в ответ на IFNa [Kumar & Atlas, 1992]. IFN способны изменять состояние Rb: из неактивной гиперфосфорилрованной формы Rb переходит под действием IFN в активную гипофосфорилированную, способную подавлять рост клеток [Resnitzky et al., 1992].
В клетках Daudi IFNa ингибирует аістивность CDK2, но не cdc2, циклин Е- и циклин D1-зависимым образом, что снижает фосфорилирование Rb [Zhang & Kumar, 1994]. Показана способность IFNa подавлять фосфорилирование родственных Rb белков р107 и р130. Кроме того, IFNa снижает уровень этих белков в клетке [Thomas et al., 1998; Sangfelt et al., 1999]. Подавление фосфорилирования Rb под действием IFNa вызывает формирование E2F4/Rb и E2F4/pl30 комплексов, связывающихся с промотором гена E2FI и подавляющих его транскрипцию [Furukawa et al., 1999].
IFNa подавляет также транскрипцию генов циклина D3 и cdc25, что снижает активность CDK4 и б (и, как следствие, подавляет фосфорилирование Rb), и, наконец, вызывает обратимый арест в GO-фазе [Tiefenbrun et ah, 1996]. Впрочем, в большинстве случаев IFN не вызывает заметных колебаний содержания CDK и циклинов (мРНК и белков) в клетках, несмотря на ярко выраженный антипролиферативный эффект и подавление активности CDK.
Важнейшим механизмом развития IFN-индуцирусмого клеточного ареста считается активация CKI-белков Ink4 (р15 и р19), Сірі и Kipl. Повышение экспрессии Ink4 и Kipl, по-видимому, зависит от клеточной линии, в то время как индукция СІрІ показана для клеточных линий самого разного происхождения [см. Nakayama & Nakayama, 1998; Sangfelt et al., 2000].
IFNy вызывает р53-независимую индукцию Сірі, сопровождающуюся подавлением клеточного роста [Jiang et al., 1994]. Индукция Сірі под действием эпидермального фактора роста EGF и IFNy опосредована STAT1, который специфически связывается с GAS промотор ной области гена Сірі и активирует его транскрипцию. IFNy не тормозит рост дефицитных по STAT1 клеток U3A, но подавляет рост этих клеток после восстановления в них экспрессии белка STAT1 [Chin et al., 1996]. р53-независимая индукция Сірі в ответ на IFNy коррелирует с подавлением клеточного роста и дифференцировкой моноцитов человека в макрофаги [Zhang et al., 1995]. IFNy ингибирует рост клеток глиобластомы человека (клеточные линии T98G, SNB-19 и U-373), что сопровождается задержкой клеточного цикла при переходе G1/S. Степень и стадия ингибирования клеточной пролиферации при этом коррелировали со степенью индукции Сірі под действием IFN и степенью ингибирования CDK2 этим белком [Kominsky et al., 1998]. Сірі индуцируется в ответ на IFN всех типов в ряде клеточных линий, что позволило некоторым исследователям считать индукцию Сірі универсальным механизмом антипролиферативной активности IFN [см. Sangfelt et al., 2000].
Показано повышение уровня белка Kipl в клетке в ответ на IFNa [Yamada et а]., 1995], IFNp [Kuniyasu et al., 1997] и IFNy [Harvat ct al,, 1997]. IFNcc-индуцированный арест клеток Daudi в Gl фазе сопровождается изменениями уровня транскрипции ряда генов, ответственных за регуляцию клеточного цикла. Содержание мРНК положительных регуляторов клеточного роста CDK2, CDK4, CDK6 и циклина Е заметно снижалось в клетках Daudi в ответ на IFNa. В то же время уровень мРНК отрицательных регуляторов клеточного роста pl8Ink4 и Kipl повышался. При этом не изменялся уровень мРНК других CKI - Ink4 (р15 и р16) и Cipl [Yamada et al., 1995]. IFNp-индуцированный Kipl преимущественно связывался с CDK6, что коррелировало с развитием апоптоза и антипролиферативным действием IFNp [Kuniyasu et al., 1997]. IFNy вызывает Gl-арест клеток МЕС, что сопровождается подавлением активности CDK2, CDK4 и CDK6 в течение 24 ч после воздействия. При этом не изменяются уровни циклина Dl, CDK2 и CDK4. Уровень CDK6 и циклина Е несколько снижался только через 48 ч после воздействия IFN. В то же время значительно повышалось содержание белка Kipl и pl5kk4 (через 16 ч после обработки). При этом уровень мРНК Kipl и ріб11 4 заметно не менялся. Значительно возрастало количество Kipl в комплексе с CDK2. Резистентность некоторых клеточных линий к IFNy может быть связана с отсутствием индукции Kipl в ответ на IFNy в этих клеточных линиях [Harvat et al., 1997]. Kipl считают ключевым медиатором IFNa-индуцированного подавления роста мелкоклеточного рака легких [Мого et al., 1998]. Папилломавирус человека HPV-16-E7 может влиять на индуцируемость Kipl, приводя к формированию IFNa-резистентных клеток [Мого et аі., 1998].
Таким образом, IFN регулирует ряд генов, кодирующих белки, участвующие в регуляции клеточного цикла, на транскрипционном уровне. Было показано, что IFN подавляют также посттрансляционную активацию CDK. Помимо вышеупомянутого подавления CDK-активирующей фосфатазы CDC25 [Tiefenbrun et аі., 1996], IFN также подавляют активацию CDK протеинкиназой САК: IFNy индуцирует экспрессию Сірі и Kipl в клетках человека, что сопровождается подавлением активирующего фосфорилирования CDK2 и CDK4 протеинкиназой САК и ингибированием активностей CDK2 и CDK4. Можно отметить, что в той же работе IFNa индуцировал экспрессию белка Сірі, но не влиял на уровень Kipl [Mandal et al., 1998].
В последнее время, однако, стало понятно, что индукция белков Сірі и Kipl не является универсальным механизмом ареста клеток в ответ на IFN. Так, в некоторых клеточных системах экспрессия Сірі не индуцируется IFNy [Arany et al., 1997], или даже снижается под действием IFNy в клетках МЕС несмотря на наблюдавшийся G1-арест [Harvat & Jetten, 1996]. Более того, IFNy может вызывать G2/M- и G1-специфический клеточный арест посредством неизвестного СІрІ- и Kipl-независимого механизма. Этому событию сопутствует снижение гистон Ш-киназной активности циклин B-cdc2, но содержание Cipl, Kipl, р53 и циклинов А, В1 и Е не меняется [Vivo et al., 2001]. Описание ареста клеток в М-фазе в ответ на IFNy не очень часто встречается в научной литературе (возможно благодаря тому, что механизм этого явления неизвестен), однако он был показан, например, для кератиноцитов человека [Grousson et al., 2000]. Последний факт интересен тем, что именно в кератиноцитах человека наблюдается очень высокий уровень индукции WRS в ответ на IFNy [Reano et al., 1993].
Таким образом, к началу нашего исследования было известно, что WRS млекопитающих, кроме первичной функции аминоацилирования родственной тРНК, обладает рядом неканонических функций, вовлеченных в важные для клетки и организма процессы. Обнаружение антиангиогенной активности N-укороченного WRS человека и предложение использовать WRS человека для лечения нарушений васкуляризации [Wakasugi et al., 2002; Otani et al., 2002] делает WRS человека перспективным объектом биотехнологии.
Анализ мРНК методом Нозерн-гибридизации
Форбол 12-миристат 13-ацетат (РМА) известен как специфический активатор протеинкиназы С (РКС) [Castagna et al., 1982], РКС является посредником передачи сигнала многочисленных реакций клеток, в том числе иммунологических [Ройт и соавт., 2000]. РМА широко используется для изучения путей передачи сигнала с участием системы РКС (см. например [Chang et al., 1992, Yu & Floyd-Smith, 1997]). Ранее было показано, что РМА повышает индукцию интерфероном 2 -5 -олигоаденилат синтетазы (2-5AS) [Chang et al., 1992]. 2-5AS - ключевой фермент противовирусной системы организма, известной как система 2-5А; синтезируемые этим ферментом 2 -5 -олигоаденилаты (2-5А) активируют другой lFN-индуцируемый фермент РНКазу L, разрушающий вирусную РНК в клетке.
В то же время, РМА увеличивает концентрацию 5 ,5 "-диаденозинтрифосфата (АрзА) в культурах клеток [Vartanian et al., 1997]. Поскольку известно, что WRS непосредственно вовлечен в синтез Ар3А [Merkulova et al., 1994], a ApjA может активировать 2-5AS [Turpaev et al. 1997; Kisselev et al., 1998; Turpaev ct al., 1999], можно предположить, что содержание WRS может быть каким-то образом связано с активностью РКС.
Для того, чтоб проверить это предположение, мы исследовали действие РМА и ингибиторов РКС на экспрессию гена WRS в клетках человека: эпителиальных HeLa (рак шейки матки [Gey et al., 1952]) и эмбриональных почечных НЕК293 (от human embryonic kidney, клетки эмбриональной почки человека, трансформированные ДНК аденовируса типа 5 [Graham et al., 1977]). Клетки обрабатывали 0,1 мкМ РМА и/или 100 Ш/мл IFNy в течение 16 ч, после чего клетки лизировали и в лизатах определяли концентрацию общего белка. На электрофорез в Ds-Na-ПААГ наносили количества лизатов эквивалентные 5 мкг общего белка. После электрофоретического разделения белки переносились на мембрану и анализировались методом иммуноблоттинга с использованием соответствующих антител, как указано в разделе «Материалы и методы».
Обработка клеток IFNy сопровождалась 5,5-кратным повышением содержания WRS в клетках HeLa по сравнению с необработанными клетками (Рис. 6, А и В), в то время как содержание контрольных белков глутамил-пролил-тРНК-синтетазы (EPRS), метионил-тРНК-синтетазы (MRS), глутаминил-тРНК-синтетазы (QRS) (Рис. 6) и тирозил-тРНК-синтетазы (YRS) (данные не представлены) оставалось неизменным. Наши результаты подтверждают данные о том, что IFNy индуцирует WRS в клетках HeLa [Buwitt et al., 1992; Fleckner et al., 1995; Tolstrup et aL, 1995; Shaw et al., 1999].
IFNy вызвал 2,9-кратное увеличение содержания WRS в клетках НЕК293 (Рис. 6, Б и В). Известно, что не во всех клеточных линиях WRS индуцируется под действием IFNy [Fleckner et al., 1995]. В нашей работе впервые показано, что IFNy индуцирует WRS в культуре клеток эмбриональной почки человека НЕК293.
РМА в отсутствие IFNy увеличивал экспрессию WRS в HeLa и НЕК293 соответственно в 2 и 1,6 раз (Рис. 6). Мы не наблюдали достоверных изменений содержания других аминоацил-тРНК-синтетаз, включая EPRS, MRS, QRS (Рис. 6) и YRS (данные не представлены) в ответ на РМА. РМА усиливал индукцию WRS под действием IFNy в обеих клеточных линиях (Рис. 6), в то время как содержание EPRS, MRS, QRS (Рис. 6) и YRS (данные не
Влияние IFNy и модуляторов активности РКС на содержание WRS в клетках человека. Содержание белков WRS, MRS, EPRS и QRS анализировали с помощью иммуноблоттинга в клетках HeLa (А) и WRS - в клетках НЕК293 (Б) после обработки 0,1 мкМ РМА, 100 Ш/мл IFNy и стауроспорином (St) в различных комбинациях в течение 16 ч. В -Гистограмма содержания белков после указанных обработок: пятна на рентгеновских пленках, соответствующие белкам (на врезках), количественно определяли с помощью денситометра, и относительные плотности были нормализованы относительно плотностей белков в необработанных клетках. представлены) оставалось неизменным. После 16-ч инкубации с IFNy и РМА, содержание WRS увеличилось в 2 раза в HeLa и в 2,6 раза в HEFC293 сравнительно с клетками, обработанными только IFNy. Максимальное влияние РМА на содержание WRS наблюдали после 16 ч обработки (приводятся данные только для 16ч).
Чтобы выяснить, отражают ли изменения содержания белка WRS, вызываемые обработкой РМА, соответствующие изменения уровня мРНК WRS, мы исследовали влияние обработки клеток РМА в течение различных интервалов времени на содержание мРНК WRS в клетках HeLa.
Для этого клетки HeLa обрабатывали 0,1 мкМ РМА в течение различных интервалов времени, после чего из них выделяли суммарную РНК. По 15 мкг суммарной РНК фракционировали электрофорезом, переносили материал на нейлоновую мембрану и гибридизовали с 32Р-мечеными фрагментами кДНК WRS человека и GAPDH человека (Рис. 7). Относительное количество мРНК WRS определяли по интенсивности гибридизационных сигналов, которую нормировали относительно интенсивности гибридизационных сигналов мРНК GAPDH. Результаты представлены на Рис. 7.
Уровень мРНК WRS достигал максимума после 4 — 8 ч обработки (после 8 ч обработки - в 16 раз выше, чем в необработанных клетках) и возвращался к норме после 16 ч обработки (Рис. 7). Следует заметить, что уровень индукции мРНК WRS заметно превышает уровень индукции белка WRS в ответ на РМА. Поскольку РМА повышает не только уровень белка WRS в клетках человека, но и содержание мРНК WRS, можно заключить, что РМА активирует транскрипцию гена WRS в клетках человека HeLa и НЕК293.
Обработка клеток НЕК.293 100 Ш/мл IFNy в течение 8 ч вызывала повышение содержания в них мРНК WRS, определяемое Нозерн-гибридизацией, в 5 раз, что свидетельствует о том, что IFNy активирует транскрипцию гена WRS.
Взаимосвязь некоторых РКС- и IFN-регулируемых белков
Активирующее действие РМА на экспрессию WRS отличает WRS от ряда IFN-индуцируемых белков, экспрессия которых подавляется РМА и его эффектором РКС. Так, было показано, что РКС подавляет IFNy-индуцированную экспрессию активатора апоптоза Fas и компонента главного комплекса гистосовместимости HLA-DR [De Saint Jean et al., 1999] и индукцию ISG54, ISG15, 9-27 и IFN-2 в ответ на IFNcc [Akai & Larner, 1989]. В первичных моноцитах человека РМА ингибирует передачу сигнала IFNa (но не IFNy) посредством подавления фосфорилирования TYK1, STAT1, STAT2 и STAT3 [Petricoin et al., 1996]. Таким образом РМА ингибирует IFNa-стимулированную экспрессию таких IFNa-индуцированных мРНК, как ISG54, ISG15, 9-27 и IFN-2, но не оказывает влияния на IFNy-стимулированную экспрессию мРНК FcyRl [Petricoin et al., 1996].
Вместе с тем, обнаруженный эффект сближает WRS с такими IFN-индуцибельными белками, как индоламин-2,3-диоксигеназа (ШО) и 2-5AS. Известно, что WRS и IDO — ключевой фермент деградации триптофана — совместно индуцируются IFNy и с меньшей интенсивностью IFNa в одних и тех же клеточных линиях [Fleckner et al., 1995]. Трансформирующий фактор роста В (TGFp) избирательно ингибирует IFNy-стимулированную экспрессию WRS и ШО в фибробластах человека [Yuan et al., 1998]. Подобно показанному нами для WRS, РМА потенцирует индукцию IDO в ответ на IFNy [Edelstein et al., 1989; Holmes, 1998]. Истощение в клетке триптофана как результат индукции IDO играет существенную роль в механизмах действия IFNy: истощение триптофана вовлечено в развитие апоптоза в ответ на IFNy [Gupta et al., 1994], а также в антибактериальное и антипротозойное действие IFNy, направленное против внутриклеточных инфекций, вызываемых Chlamydia psitiaci, Toxoplasma gondii, стрептококками группы В и другими возбудителями [Gupta et al., 1994, Fujigaki et al., 2001]. Из полученных нами данных следует, что экспрессия WRS и IDO совместно активируется РМА (Рис. 10). Причины этой совместной регуляции не вполне ясны, однако тот очевидный факт, что оба эти фермента используют триптофан в качестве субстрата (a WRS и в качестве кофактора) предполагает наличие функциональной взаимосвязи между WRS и IDO,
Также было показано, что РМА примерно в 2 раза повышает индукцию 2-5AS в ответ IFNa [Chang et al., 1992; Yu & Floyd-Smith, 1997; Yu et al., 1999; Yu & Floyd-Smith, 1999] в клетках человека, в том числе в клетках HL60 и HeLa [Chang et al., 1992]. Было доказано, что этот эффект опосредован активацией РКС [Yu & Floyd-Smith, 1997].
Ранее была предложена схема, согласно которой АрзА, синтезируемый IFN-индуцируемой WRS, может служить праймером для 2-5AS и активировать таким образом IFN-индуцированную систему 2-5А, членом которой 2-5AS является [Turpaev et al., 1997; Kisselev et al., 1998]. Позднее были получены некоторые экспериментальные подтверждения этой гипотезы [Turpaev et al., 1999]. Важность IFN-индуцируемой системы 2-5А для организма определяется тем, что система 2-5А является ключевым компонентом защиты клетки от вирусов, обеспечивающим разрушение РНК вирусов в инфицированной клетке. В последнее время наше представление о важности системы 2-5А для организма возросло, поскольку, как оказалось, она обладает не только противовирусной, но и противоопухолевой активностью. Так, недавно было показано, что ген РНКазы L, кодирующий эффекторный фермент системы 2-5А, является кандидатом на роль опухолевого супрессора, поскольку этот ген мутирован в семьях с повышенным риском развития рака простаты [Carpten et al., 2002].
Как было показано в нашей работе, в клетках человека РКС может активировать экспрессию гена WRS (Рис. 6 - 8), и, одновременно, как было показано ранее, активировать IFN-индукцию генов ШО и 2-5AS [Yu & Floyd-Smith, 1997; Holmes, 1998]. Более того, РМА вызывает посттранскрипционную активацию другого члена системы 2-5А, IFN-индуцируемой 2-5А-зависимой латентной рибонуклеазы L (РНКаза L): кратковременная обработка РМА полностью удаляет РНКазу L из неактивной и нерастворимой формы, связанной с белками цитоскелета в клетках HeLa [Tnani et ah, 1998]. Таким образом, РКС может совместно активировать WRS и ферменты системы 2-5А, что может обеспечивать в живой клетке полный путь активации этого антивирусного и противоопухолевого каскада (Рис. 10).
Существуют и другие свидетельства того, что РКС связан с системой метаболизма АрзА. Фермент, ответственный за разрушение АрзА а клетке, специфическая АрзА-гидролаза FHIT (fragile hjstidine triad protein, белок несущий гистидиновую триаду), гомологична белку PKCI (ингибитор РКС) и является членом одного с ней белкового семейства HIT [Klein et al., 1998] (Рис. 10).
Таким образом, можно утверждать, что сходства механизмов индукции WRS, IDO и системы 2-5А предполагают существование комплексных взаимодействий между контролируемыми IFN и РКС путями метаболизма триптофана и Ар3А, На Рис. 10 представлена предложенная нами схема взаимодействия и взаимной регуляции этих ферментов.
