Содержание к диссертации
Введение
1. Цитокины, их значение и применение. 10
1.1. Интерфероны: биологическое значение и применение . 11
1.2.Строение молекулы (3-ИФН. 12
2.Механизм действия р - интерферона. 15
2.1. JAK-STAT путь- главный путь передачи сигнала цитокинов. 15
2.2. Рецептор fl-ИФН, передача сигнала по JAK-STAT пути. 17
2.3. Факторы, активируемые ИФН. 21
3. Применение (3-ифн в клинике. 22
3.1. Механизм действия [3-ИФН при рассеянном склерозе . 22
3.1.1. Влияние на презентацию антигена :/3-ИФН- иммуномодулятор. 23
3.1.2. Роль (3-ИФН в развитии иммунного ответа, влияние на продукцию цитокинов различными клетками иммунной системы. 25
3.1.3. Влияние /3-ИФН на инфильтрацию лимфоцитов ЦНС. 26
4. Использование методов генной инженерии для получения новых иммунно-биологических препаратов . 28
5. Регуляция биосинтеза КФ2. 34
5.1. Транскрипционный активатор, кодируемый геном PHQ4 . 35
5.2. Транскрипционный активатор, кодируемый геном PHQ2. 36
5.3. Белки-регуляторы, кодируемые генами РНО80 и PHQ85. 37
5.4. Белок, кодируемый геном PHQ81. 38
6. Секреция белков у дрожжей saccharomyces serevisiae . 40
6.1. Гликозилирование секреторных белков. 41
6.2. Роль протеолиза в секреции чужеродных белков. 44
7. Экспрессия чужеродных генов в метилотрофных дрожжах рісша pastoris . 46
Материалы и методы. 55
1. МАТЕРИАЛЫ 55
1.1. Список сокращений. 55
1.2. Штаммы. 55
1.3. Плазмиды. 57 1 АУсловия культивирования штаммов. 58
2. МЕТОДЫ. 60
2.1. Трансформация бактерий E.coli. 60
2.2 Трансформация дрожжей плазмидной ДНК. 61
2.3 Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coll. 61
2.4. Методы молекулярного клонирования. 62
2.5 Электрофорез фрагментов ДНК. 62
2.6. Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей. 62
2.7. Выделение хромосомной ДНК из дрожжей. 62
2.8. Количественное определение активности кислых фосфатаз. 63
2.9. Определение концентрации белка. 63
2.10. Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии додецилсулъфата натрия. 64
2.11. Иммуноблотинг. 64
2.12. Гель-фильтрация на сефакриле S(300) и сефарозе 6В. 65
2.13. Определение биологической активности (3-ИФН. 65
2.14. Определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) молекул ДНК. 66
2.15. Полимеразная цепная реакция. 66
2.16. Количественное определение активности р^-галактозидазы 67
2.77. Определение удельной активности цитохром-С-оксидазы. 61
2.18 Выделение митохондрий из дрожжей. 68
Результаты. 69
1 .Получение рекомбинантной плазмиды PHBI. 69
2.Создание штамма дрожжей saccharomyces cerevisiae - продуцента р-интерферона человека. 74
2.1. Характеристика штаммов реципиентов. 74
2.2. Измерение удельной активности КФ штаммов-реципиентов. 76
2.3. Получение штаммов-продуцентов и определение синтеза
В-ИФН человека клетками S.cerevisiae. 77
2.4. Анализ частоты потери плазмиды рНВІ штаммами-продуцентами В-ИФН человека. 78
2.5. Сравнение кривых роста штаммов-реципиетов и продуцентов. 79
2.6. Сравнение диплоидного и гаплоидного штаммов-продуцентов. 79
З.Влияние синтеза в-интерферона на метаболизм клетки S.Cerevisiae. 83
3.1. Сравнение уровня экспрессии гена HSP82 у исходного штамма и штамма-продуцента В-ИФН. 84
3.1.1. Получение плазмиды pRS426-beta . 84
3.1.2. Измерение активности В-галактозидазы у штамма-реципиента и штамма, несущего плазмиду pRS426-beta. 87
4. Разработка схемы очистки рекомбинантного интерферона-в, синтезированного в дрожжах S.Cerevisiae. 89
5.Создание рекомбинантной плазмиды phif, обеспечивающей экспрессию гена в-ифн человека и секрецию рекомбинантного белка дрожжами рісша pastoris. 95
5.1. Создание вектора экспрессии pHIF. 95
5.2. Определение нуклеотидной последовательности амплифицированного гена (3-ИФН человека. 98
5.3. Создание вектора экспрессии, обеспечивающего синтез нативного [3-ИФН человека (pHIF2). 102
6. Создание штаммов дрожжей pichia pastoris- продуцентов р-ифн человека . 105
6.1. Трансформация штамма GS115 генетическими конструкциями, содержащими ген (3-ИФН и селекция трансформантов. 105
6.2. Подбор условий культивирования трансформантов, индукции синтеза и секреции рекомбинантного (3-ИФН человека. 107
6.3. Определение наличия углеводного компонента в составе молекулы Р-ИФН человека, секретируемого клетками P. pas tor is. 109
6.4. Определение уровня продукции (3-ИФН человека штаммом дрожжей P.pastoris. Ill
7. Разработка схемы очистки рекомбинантного р-ифн человека, секретируемого клетками дрожжей pichia pastoris. 111
Оценка влияния замен АК в последовательности Б-ИФН человека на биологические функции рекомбинантного белка. 115
8. Получение штамма продуцента дрожжей p.pastoris обеспечивающего внутриклеточный синтез рекомбинантного р-ифн человека . 116
8.1. Создание вектора экспрессии рЬПУВ и получение штамма продуцента, обеспечивающего внутриклеточный синтез 3-ИФН. 116
8.2. Оценка уровня продукции рекомбинантного (З-ИФН человека штаммом GS115/рШУВ. 118
Обсуждение. 121
Выводы. 138
Список литературы
- Интерфероны: биологическое значение и применение
- Механизм действия [3-ИФН при рассеянном склерозе
- Транскрипционный активатор, кодируемый геном PHQ4
- Экспрессия чужеродных генов в метилотрофных дрожжах рісша pastoris
Введение к работе
Актуальность проблемы. Открытие и изучение цитокинов позволило установить, что иммунный ответ подчиняется тем же закономерностям, что и процессы с участием классических гормонов и их рецепторов.
Цитокины являются не только регуляторами иммунных реакций, но и ключевыми факторами, инициирующими воспалительную реакцию, участвующими в элиминации опухолевых клеток, модифицирующими функциональные состояния нервной и эндокринной системы. Изучение цитокинов имеет не только теоретическое, но и прикладное значение.
Использование белков-иммуномодуляторов человека для лечения заболеваний различной этиологии имеет существенные преимущества по сравнению с традиционными химиотерапевтическими методами лечения за счет широкого спектра действия, обусловленного активацией иммунной системы, и из-за отсутствия побочных эффектов. Применение непатогенных микроорганизмов (дрожжей), не содержащих токсических и пирогенных факторов, в качестве продуцентов рекомбинантных белков человека позволяет использовать рекомбинантные белки в клинической практике.
Целью данной работы является получение с помощью методов генной инженерии штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris- продуцентов биологически активного (3- интерферона человека.
В задачи исследования входит:
получение векторов экспрессии, обеспечивающих синтез рекомбинантного р1- интерферона человека
получение штаммов-продуцентов, подбор условий культивирования, выращивания штаммов-продуцентов и индукции синтеза рекомбинантного белка
разработка схем очистки Р-интерферона человека, синтезированного в клетках дрожжей
сравнение на примере Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris-систем «гетерологичный белок- клетка продуцент»
Научная новизна исследования. Впервые в России и в мире получены штаммы-продуценты рекомбинатного Р- интерферона человека, обладающего биологической активностью, на основе дрожжей Pichia pastoris. Впервые в мире показано, что токсичный эффект синтеза (3-интерферона человека в клетках Saccharomyces cerevisiae может быть обусловлен негативным воздействием на функции митохондрий. Установлено, что Pichia pastoris являются более предпочтительным продуцентом рекомбинатного |3- интерферона человека, по сравнению с Saccharomyces cerevisiae.
Практическая ценность. В настоящее время р-интерферон человека является эффективным препаратом для лечения и увеличения периода ремиссии рассеянного склероза, а также вирусных и онкологических заболеваний. Существующие на рынке России зарубежные препараты рекомбинантного Р-интерферона получены на основе условно-патогенных бактерий, поэтому их применение характеризуется рядом побочных эффектов. Созданные в настоящей работе на основе дрожжей штаммы-продуценты рекомбинантного Р-интерферона человека ВКПМ Y-2286 и ВКПМ Y-2470 представляют уникальные разработки, защищены патентом Российской Федерации и могут быть использованы для производства отечественного препарата рекомбинантного Р-интерферона человека.
Интерфероны: биологическое значение и применение
Впервые белок, названный интерфероном, был обнаружен в 1957 году Исааксом и Линденманом и охарактеризован как гликопротеин, вырабатываемый клетками в ответ на вирусную инфекцию и обладающий способностью подавлять репликацию вирусов (Isaacs, Lindenmann, 1957).
Система интерферонов возникла в филогенезе у позвоночных. Ее действие направлено прежде всего на распознавание и элиминацию чужеродной генетической информации. Многообразие обнаруживаемых и изученных к настоящему времени физиологических функций ИФН, несомненно, указывает на их контрольно-регуляторную роль в сохранении гомеостаза (Ершов и др., 1980). Основные эффекты ИФН можно подразделить на противовирусные, антимикробные, антипролиферативные (в том числе антитуморогенные), иммуномодулирующие, радиопротективные и др. (Ершов , 1996).
В настоящее время известно более 20 видов ИФН, сгруппированных в три класса: лейкоцитарный или а-интерферон (ИФН-а); фибробластный или (3-интерферон (ИФН-Р); иммунный или у-интерферон (ИФН-у). Первые два класса, в свою очередь, объединены в одно семейство благодаря схожим последовательностям и функциям, тогда как ИФН-у выделяют в отдельное семейство (Pestka et al., 1987).
Формирование молекул ИФН в клетках инициируется различными биологическими и химическими агентами, основными из которых являются вирусы, микроорганизмы, природные и синтетические полирибонуклеотиды, митогены, некоторые ингибиторы синтеза макромолекул и экзогенный ИФН. Основными продуцентами эндогенного интерферона являются иммунокомпетентные клетки (лимфоциты, макрофаги), а также фибробласты, эпителиальные и эндотелиальные клетки.
ИФН-а, лейкоцитарный, синтезируется лейкоцитами (В-, Т-лимфоцитами, макрофагами) после воздействия на них митогенов, вирусов, чужеродных и опухолевых клеток. Известно более 20 представителей этого класса, различающихся по молекулярным массам и аминокислотным последовательностям.
ИФН-у, иммунный, синтезируется, главным образом, Т-лимфоцитами после стимуляции их митогенами, специфическими антителами, интерлейкином-2 (ИЛ-2). Этот белок оказывает антипролиферативное и иммуномодулирующее действие.
ИФН-(3, фибробластный, продуцируется эпителиальными клетками и фибробластами и обладает выраженным местным действием.
Строение молекулы (3-ИФН. (3-ИФН синтезируется в фибробластах и эпителиальных клетках в виде предшественника, состоящего из 187 аминокислотных остатков, 21 из которых, являются сигнальной последовательностью (Дебабов, 1985). Секретируемый (3-ИФН представляет собой белок, состоящий из 166 аминокислотных (АК) остатков (18 кДа) и содержащий одну внутримолекулярную дисульфидную связь между цистеинами в положении 31 и 141. Эта связь играет важную роль в поддержании биологически активной конформации молекулы, так как восстановление в денатурирующих условиях или искусственная замена 141 цистеина на серии приводит к потере биологической активности (Shepard et al., 1981). Помимо этих двух цистеинов в молекуле (3-ИФН обнаруживается третий -в положении 17, который участвует в образовании межмолекулярной дисульфидной связи (Mark et al., 1984).
Кристаллографический анализ молекулы р-ИФН показал, что данный белок состоит из 5 а- спиральных участков: А (2-22 АК остатки), В (51-71 АК остатки), С (80-107 АК остатки), D (118-136 АК остатки) и Е (139-162 АК остатки). В пространстве а- спирали расположены параллельно друг другу, и соединены гибкими участками (петлями) в совокупности образуя форму цилиндра. Кор молекулы поддерживается за счет гидрофобных взаимодействий между остатками фенилаланина (положения 70, 154) и триптофана (положения 79, 143), а также за счет дополнительных водородных связей (глицин 10-глицин 94 и серии 118-треонин 58) (Karpusas et al., 1997).
(3-ИФН способен к димеризации не только за счет дисульфидной связи между цистеинами двух молекул, но также и за счет координационной связи через ион цинка. Как показал кристаллографический анализ, образование связи происходит с участием остатка гистидина 121 одной молекулы и остатков гистидинов 93 и 97 другой молекулы. Молекула воды занимает четвертый координационный сайт. Большинство исследователей полагают, что подобная димеризация может происходить в норме в организме человека, а не только in vitro, поскольку данный вид димеризации характерен для большинства молекул интерферонов (Karpusas et al., 1997).
Механизм действия [3-ИФН при рассеянном склерозе
В настоящее время Р-ИФН применяют при лечении очень многих заболеваний.
Во-первых, благодаря своему местному антивирусному действию Р ИФН используют при лечении различных вирусных инфекций, таких как гепатиты В и С, генитальные поражения вирусом папилломы (Rockley, Tyring, 1995; Rusconi et al., 1994; Guidotti et al., 1994; Ikeda et al., 2000). Кроме того, исследователи выдвигают именно этот цитокин в качестве медицинского препарата для лечения ВИЧ-инфекции типа 1, так как было показано in vivo и in vitro, что р-ИФН полностью подавляет репликацию и развитие данного вируса в моноцитах и макрофагах (Gessani et al., 1994).
Во-вторых, за счет способности усиливать пролиферацию и активность естественных киллеров (основных клеток, уничтожающих опухолевые клетки) Р-ИФН отдельно или совместно с другими цитокинами (ИЛ-2) широко используется при терапии различных раковых заболеваний (главным образом лейкемии) (De Bround et al., 1994; Malto et al., 1994; Liberati et al., 1994). Получены обнадеживающие результаты в возможности использования данного цитокина в лечении меланомы и карциномы желудка (Nagatani et al., 1998; Kuniyasi et al., 1997)
Помимо этого в данный момент стало окончательно ясно, что именно Р-ИФН является мощным препаратом при лечении рассеянного склероза (Denning, 1994; Knobler et al., 1994).
Применение Р-ИФН при лечении рассеянного склероза (PC) началось в 1989, а в 1993 году ИФН-P-lb- рекомбинантная форма цитокина, производимая фирмой "Shering AG", с использованием системы экспрессии E.coli, был признан во всем мире как единственный препарат, способный эффективно действовать против развития PC (Yong et al., 1998). В 1996 году был утвержден к применению препарат ИФН-р-1а, полученный из клеток яичников китайского хомячка (разработка фирмы "Avonex"). Исследования по терапии PC активно ведутся во многих клиниках мира, где отмечают положительный эффект данных препаратов и заметное улучшение нейропсихологического состояния пациентов (Goodin , 2000).
Несмотря на успехи клинического применения (3-ИФН, механизмы действия данного цитокина, способствующие ремиссии PC до сих пор не известны. Однако в последнее время, благодаря совершенствованию иммунологических и молекулярных методов, появились некоторые данные о возможных механизмах действия [3-ИФН.
Большинство исследователей выделяют три направления действия р-ИФН: 1. Влияние на презентацию антигена: Р-ИФН-имму номо дулятор. 2. Роль Р-ИФН в развитии иммунного ответа, влияние на продукцию цитокинов различными клетками иммунной системы. 3. Влияние р-ИФН на инфильтрацию лейкоцитов в ЦНС при PC. Ниже мы рассмотрим подробнее механизмы действия Р-ИФН .
Несмотря на то что этиология PC до конца не изучена, ясно одно-данное заболевание опосредовано нарушениями в имммунной системе, а именно: основной миелиновый белок (ОМБ) воспринимается реактивными клетками иммунной системы как антигенная детерминанта.
В связи с этим мы остановимся на механизмах презентации антигена (ПА), включающих в себя взаимодействие определенных молекул адгезии на поверхности антиген презентирующих клеток (АПК) с соответствующими поверхностными рецепторами Т-лимфоцитов. В таблице 1 перечислены все известные сегодня молекулы адгезии АПК и соответствующие им рецепторы и молекулы на поверхности Т-лимфоцитов.
Транскрипционный активатор, кодируемый геном PHQ4
Синтез репрессибельной кислой фосфатазы 2 дрожжей находится под контролем позитивных и негативных белков-регуляторов и подавляется неорганическим фосфатом. В системе существует три позитивных регулятора транскрипции: белок Pho4, отвечающий за базальный уровень экспрессии гена, белок Pho2, усиливающий действие Pho4, и белок Pho81- ингибитор негативных регуляторов и белок медиатор передачи сигнала о наличии неорганического фосфата в среде. Негативные регуляторы - это циклинзависимая протеинкиназа Pho85 и связанный с ней циклин-белок Pho80, которые при наличии в среде фосфата препятствуют проникновению белка Pho4 в ядро и связыванию его с промотором гена РН05 (рис.2).
Белок Pho4 имеет молекулярную массу 34кДа и состоит из 309 аминокислот (Legrain et al., 1986). В N-концевой области расположен активирующий домен, в центральной части - участки взаимодействия с белком активатором Pho2 и с негативным регулятором Pho80. ДНК-связывающий домен, содержащий спираль-виток-спиральную структуру, находится в С-концевой области (Ogawa et al., 1990). Обнаружена значительная степень гомологии ДНК-связывающих доменов белка Pho4 и транскрипционных факторов млекопитающих (семейство Мус белков, MyoD, El2, Е47), которые связываются с ДНК в виде димера и узнают палиндромную последовательность CANNTG (E-box). Pho4 белок также взаимодействует с промотором гена РН05 в виде гомодимера, в образовании которого участвует цистеин, находящийся в 300 положении (ShaoetaL, 1998).
Делеционный анализ промотора гена РН05 выявил два сайта связывания белка, кодируемого геном РН04: UAS1 и UAS2 (Bergman, 1986; Vogel et al., 1989). Изучение структуры хроматина промотора гена РН05 показало, что в неактивном состоянии (в условиях репрессии) регуляторная область гена содержит 4 нуклеосомы, которые закрывают UAS2, сайты связывания белка Pho2 и TATA бокс. UAS1 находится в коротком гиперчувствительном к действию нуклеаз участке и доступен для связывания белка Pho4 (Svaren et al., 1997). В условиях дерепрессии синтеза КФ2 белок Pho4 транспортируется из цитоплазмы в ядро (O Neill et al., 1996), связывается с UAS1 при помощи С-концевого кислого домена, при этом активирующий домен белка Pho4 разрушает нуклеосомную структуру промотора гена РН05. После этого происходит взаимодействие белка Pho4 с UAS2, а также белка-активатора Pho2 с собственными сайтами связывания (Svaren et al., 1997).
Белок Pho2, также известный, как Bas2 и GrflO, состоит из 408 аминокислот и имеет молекулярный вес 44 кДа (Sengstag et al., 1988). Белок Pho2 обладает доменной организацией и относится к гомеодоменным белкам (Burglin, 1988). Гомеодомен представляет собой консервативный ДЬЖ-связывающий домен, найденный у большого числа эукариотических транскрипционных факторов (Affolter et al., 1990). Специфичность связывания с ДНК определяется последовательностью аминокислот в N-коцевом фрагменте гомеодомена (Justice et al., 1997). За связывание с белком Pho4 ответственен С-концевой домен молекулы (Schao et al., 1996). Характерной особенностью гомеодоменных белков является их способность к взаимодействию с другими транскрипционными факторами и кооперативному связыванию с ДНК. При этом один и тот же гомеодоменный белок может выступать в качестве коактиватора транскрипции различных генов.
Белок Pho2 является плейотропным активатором. Совместно с белком Swi5 он регулирует экспрессию гена НО (Brazas et al., 1995). В комплексе с белком Basl белок Pho2 активирует транскрипцию некоторых генов биосинтеза пуринов (Daignan-Fornier et al., 1992; Rolfes et al., 1997) и обеспечивает базальный уровень транскрипции гена HIS4 (Arndt et al., 1987). Белок Pho2 принимает участие в регуляции экспрессии генов TRP4 (Braus et al., 1989), CYC1 (Sengstag et al., 1988). Оба белка-активатора биосинтеза кислых фосфатаз, Pho2 и Pho4, способны предотвращать репрессию транскрипции гена СІТІ (Padkina et al., 1996).
Синтез репрессибельных КФ зависит от совместного действия белков Pho2 и Pho4. Белок Pho4 является основным активатором биосинтеза КФ, определяет базальный уровень транскрипции гена РН05. Функция белка Pho2 до конца не выяснена. Дрожжи, несущие мутацию в гене РН04, не способны синтезировать КФ при увеличении дозы гена PH02. В то же время отсутствие белка Pho2 может быть в значительной степени компенсировано белком Gcn4, активатором общего контроля биосинтеза аминокислот (Белова и др., 1992), или супер продукцией белка Pho4 (Berben et al., 1988). При помощи дигибридной системы было обнаружено взаимодействие белков Pho2 и Pho4 in vivo и показано, что за связывание отвечает участок белка Pho4, расположенный между 200 и 247 аминокислотами (Hirst et al., 1994). Белок Pho4, лишенный этого фрагмента (Pho4A), не взаимодействует с белком Pho2 и не способен связываться с UAS1 промотора гена РН05. В то же время укороченный белок Pho4 взаимодействует с UAS2 и активирует транскрипцию гена бета-галактозидазы, клонированного под контролем данной регуляторной области (Barbaric et al., 1998). Возможно, одна из функций белка Pho2 состоит в том, чтобы обеспечить связывание белка Pho4 с UAS1. При трансформации мутанта pho2pho4 плазмидами, несущими нативный ген РН04 и ген РН04А, было показано, что у второго трансформанта активность КФ в 2,5 раза выше (Barbaric et al., 1998). Подобные результаты позволяют предположить, что белок Pho4 содержит домен, репрессирующий его активность. У белка Pho4A этот домен, возможно, удален. Не исключено, что в физиологических условиях белок Pho2 снимает негативное влияние этого домена и активирует белок Pho4 (Shao etal., 1996).
Экспрессия чужеродных генов в метилотрофных дрожжах рісша pastoris
За последние несколько лет метилотрофные дрожжи Pichia pastoris получили широкое распространение в качестве продуцентов чужеродных белков. Интерес к данному микроорганизму возрос с тех пор, как стало известно, что эти дрожжи способны к быстрому росту и накоплению большой биомассы на недорогих стандартных средах и обеспечивают высокую продукцию чужеродного белка по сравнению с другими микроорганизмами .
Высокий уровень экспрессии чужеродных генов достигается прежде всего за счет использования сильного индуцируемого промотора структурного гена алкогольоксидазы 1 (АОХ1), катализирующей первую реакцию ассимиляции метанола. Транскрипция гена АОХ1 регулируется изменением источника углерода в культуральной среде. На среде с глюкозой или глицерином синтеза алкогольоксидазы 1 не происходит, тогда как при переносе клеток в среду с метанолом достигается максимальная транскрипционная активность гена АОХ1, и алкогольоксидаза составляет 30% от общего клеточного белка (Couderc et al., 1980).
P.pastoris не имеет собственных плазмид, аналогичных 2 мкм ДНК S.cerevisiae, поэтому не существует автономно реплицирующихся векторов экспрессии. Для клонирования ДНК в P.pastoris используют только интегративные плазмиды. В качестве селективных маркеров используются гены синтеза аминокислот, пуринов и пиримидинов (HIS4, ARG4, ADE1, URA3) (Cereghino et al., 1999), а также ген инвертазы SUC2 S.cerevisiae в качестве доминантного маркера (Sreekrishna et al., 1987). Как известно, интегративные векторы обеспечивают стабильное поддержание чужеродного гена в составе генома клетки-хозяина, поэтому в процессе ферментации можно использовать полные среды для роста биомассы и обеспечивать высокую продукцию гетерологичного белка.
Существует два способа интеграции чужеродного гена в хромосомную ДНК P.pastoris (рис.4). От способа интеграции, в свою очередь, зависит селекция трансформантов и способ ферментации штамма-продуцента.
В первом случае (рис.4 А) экспрессионная кассета (рР1СЗ-х), содержащая чужеродный ген, промотор и терминатор гена АОХ1, встраивается в локус АОХ1. За счет процессов гомологичной рекомбинации между 5 и З -фланкирующими областями гена АОХ1 хромосомной ДНК P.pastoris и аналогичными последовательностями в составе вектора экспрессии происходит замещение гена АОХ1 на клонированный чужеродный ген. (рис.5) (Romanos et al., 1992).
Селекцию трансформантов осуществляют по способности расти на среде без гистидина и по слабому росту на среде с метанолом в качестве единственного источника углерода (фенотип Mut-). Частичный рост на среде с метанолом обеспечивается благодаря активности минорного изозима алкогольоксидазы 2 (АОХ2) (Cregg et al., 1987) Для достижения высокого уровня экспрессии гетерологичного белка, штаммы- продуценты с фенотипом Mut- выращивают в две стадии: в начале на среде с глицерином до достижения стационарной фазы роста, а затем клетки переносят в среду с метанолом. Первая стадия- стадия накопления биомассы: синтез чужеродного белка подавлен за счет присутствия в культуральной среде глицерола, и клетки активно растут, не испытывая дополнительной метаболической нагрузки. На второй стадии на среде с метанолом происходит дерепрессия синтеза гетерологичного белка.
Ферментация в две стадии обеспечивает высокую продукцию даже тех белков, которые считаются высокотоксичными для клетки-продуцента: поверхностный антиген гепатата В (Cregg et al., 1987), стрептокиназа (Hagenson et al., 1989) и др. Это достигается прежде всего заВо втором случае (рис.4 В,С) экспрессионную кассету встраивают в локус HIS4. Трансформанты способны усваивать метанол, так как сохраняется нативный ген А0Х1 (фенотип Mut+). Наращивание биомассы и индукцию экспрессии клонированного гена осуществляют одновременно, культивируя клетки в среде с метанолом и глицерином в низкой концентрации.
Для многих белков показано, что уровень экспрессии не зависит от того, в какой локус произошло встраивание чужеродного гена. Однако, преимуществом Mut- штаммов является их стабильность, в то время как штаммы Mut+ способны терять чужеродный ген (Romanos et al., 1992).
Несмотря на то, что для P.pastoris нет высококопийных эписомальных плазмид, существуют способы получения штаммов-мультикопийных интегрантов. Sreekrishna с соавторами на примере фактора некроза опухоли (ФНО) показал, что уровень экспрессии гена ФНО прямо пропорционален количеству копий гена на клетку. С повышением копийности процентное содержание ФНО к общему клеточному белку росло от 1% до 30% (Sreekrishna et al., 1988). Получение мультикопийных транс.формантов возможно несколькими способами:
1. Дуплицирование экспрессионной кассеты в интегративном векторе.
2. Введение дополнительных маркеров (маркеры устойчивости к антибиотикам) в интегративный вектор и последующая селекция мультикопийных интегрантов по устойчивости к антибиотику (например G418) (Romanos et al., 1992). Очевидно, что на селективной среде будут расти только интегранты, содержащие несколько копий экспрессионной кассеты.
Помимо того, что P.pastoris могут экспрессировать и накапливать большое количество чужеродного белка внутри клетки, эти дрожжи способны к высокоэффективной секреции. Впервые это было показано для инвертазы S.cerevisiae, уровень секреции которой составил 2-5 г на литр среды (Tschopp et al., 1987). Механизмы секреции P.pastoris не изучены, однако, можно говорить о значительном сходстве этих процессов у P.pastoris и S.cerevisiae. счет четкой регуляции транскрипции клонированного гена под контролем А0Х1.
