Введение к работе
Актуальность проблемы:
В настоящее время проводятся интенсивные исследования по разработке и созданию лекарственных препаратов на основе супероксиддисмутазы (СОД)- ферментного препарата, обладающего широким спектром терапевтического действия (артриты, циститы, заболевания легких, печени, ишемия миокарда, лучевые поражения и т.д.).
Биологическая функция СОД связана с детокснкацией организма от потенциально опасных супероксндных радикалов, образующихся в норме и при различных патологических процессах. В состав лекарственных препаратов входит СОД из различных источников: эритроцитов печени быка, СОД, выделенная из бактерий, а также растительная СОД. Наиболее известыи препаратом является Пероксинорм (Германия), содержащий СОД из печени быка. Применение его в клинике показало, на фоне несомненного терапевтического эффекта, наличие побочных аллергических реакций, что в нескольких случаях привело к анафилактическому шоку. Поэтому применение СОД, выделенной из эритроцитов человека, а также рекомбинантной СОД человека позволит существенно расширить терапевтическое применение лекарственных препаратов на их основе.
Противовоспалительная активность различных препаратов СОД отличается друг от друга и причины этих различий не ясны. Возможно, это связано с повреждающим действием активных форм кислорода, таких как гидроксильиый радикал, гипохлорит, присутствующих в области воспаления. Эти молекулы могут атаковать и разрушать структуру экзогенной СОД, изменять ее активность и, соответственно, фармакологическую эффективность. Поэтому представляет несомненный интерес оценить причины различной окислительной устойчивости СОД, выделенных из разных источников.
Задачи исследования. Целью настоящей работы является разработка технологии выделения и очистки рекомбинантной СОД человека из дрожжей S.cerevisiae и изучение свойств полученной СОД. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Разработка препаративного метода выделения и очистки супероксиддисмутазы человека из рекомбинантного штамма дрожжей Saccharomegces cerevsiae Y2134.
2. Изучение ее физико- химических свойств.
-
Изучение окислительной инактивации СОД из различных источи иков под действием гипохлорита.
-
Обоснование возможности использования выделенной СОД
для повышения лечебной ценности кисломолочных продуктов.
Научная новизна. Предложена схема выделения и очистки Cu^Zn-СОД человека из биомассы рехомбинантного штамма дрожжей Saccha-romyces cerevisiae (разработан в институте Генетики микроорганизмов) на отечественных сорбентах (производство ГосНИИ ОЧБ), позволяющая достичь не только эффективного фракционирования и высокой степени очистки, но и обеспечить высокие выходы целевого продукта.
Изучен механизм инактивации рекомбинантной и эригроцитарной СОД человека гипохлоригом. Показано, что относительная устойчивость СОД к действию гипохлорита, по сравнению с другими ферментами антиокислительной системы клеток, связана с тем, что окислению подвергаются аминокислоты, не входящие в состав активного центра, а лишь опосредованно влияющие на активность СОД. Определены причины различий окислительной инактивации СОД человека и быка гипохлоритом. Установлена взаимосвязь между количеством цистеиновых остатков в молекуле СОД и ее устойчивостью к действию физиологических концентраций гипохлорита.
Практическое значение,
-
В работе экспериментально показано, что выход высокоочнщенной рекомбинантной СОД человека с единицы биомассы дрожжей S.oerevisiae штамм Y2134 более, чем на порядок превышает выход СОД с единицы эрнтромассы крови человека, что позволяет рассматривать указанный микроорганизм, как подходящий объект для создания на его основе технологического штамма СОД человека.
-
Указан подход к оценке терапевтической эффективности СОД из различных источников, основанный на сравнительном изучении инактивирующего действия физиологических концентраций гипохлорита на препараты СОД.
-
На примере разработанной рецептуры кисломолочного напитка, включающей рекомбинантную СОД человека, показана возможность использования СОД в молочной промышленности.
Апробация работы. Результаты исследований доложены на международной конференции по свободным радикалам (Турция, Стамбул, 1995г.); на 8-й конффенции международного общества по изучению свободных радикалов (Испания, Барселона, 1996г.); на международном конгрессе по охислительному стрессу и восстановительной регуляции (Франция, Париж, 1996г.); на мемориальной научно-практической конференции памяти проф. Р.И .Лившица (Челябинск, 1996г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание
