Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. S. cerevisiae как возможная модель для исследования процессов старения на клеточном уровне 11
1.2. Регуляция гликолиза и метаболизма запасных углеводов в дрожжах S. cerevisiae 24
1.3. Регуляция ключевых ферментов цикла Кребса в клетках дрожжей S. cerevisiae 29
1.4. Полифосфаты. Строение, локализация, функции в клетках дрожжей S. cerevisiae 33
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 37
2.1. Объект исследования и условия его культивирования 37
2.2. Методы контроля роста и определение интенсивности дыхания 37
2.3. Определение жизнеспособности клеток и моделирование хронологического старения 38
2.4. Разрушение клеток и получение грубого гомогената 39
2.5. Определение потребления глюкозы 39
2.6. Определение активности ферментов 40
2.7. Определение ТБК-активных продуктов 42
2.8. Определение гликогена и трегалозы 42
2.9. Определение полифосфатов 43
2.9.1. Определение аккумуляции в клетках ВХКД 45
2.9.2. Определение карбонильных групп белков 45
2.9.3. Статистическая обработка данных 46
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение 47
3.1. Исследование влияния замены среды на исследуемые параметры 47
3.2. Определение маркеров старения в клетках дрожжей S. cerevisiae 48
3.3. Исследование метаболических изменений в стареющих дрожжах S. cerevisiae с анаэробным типом метаболизма 50
3.4. Исследование метаболических изменений в стареющих дрожжах S. cerevisiae с аэробным типом метаболизма 56
3.5. Динамика содержания неорганических полифосфатов в клетках стареющей культуры S. cerevisiae 67
Заключение 71
Выводы 75
Список использованной литературы 76
Приложение 96
- S. cerevisiae как возможная модель для исследования процессов старения на клеточном уровне
- Полифосфаты. Строение, локализация, функции в клетках дрожжей S. cerevisiae
- Исследование метаболических изменений в стареющих дрожжах S. cerevisiae с анаэробным типом метаболизма
- Динамика содержания неорганических полифосфатов в клетках стареющей культуры S. cerevisiae
Введение к работе
Актуальность проблемы
Стремительное развитие геронтологии в последнее время, привлекает к себе внимание все большего количества специалистов из разных областей науки. Долгое время геронтология была сугубо физиологической наукой, не использующей весь арсенал биохимических и молекулярно-биологических методов. Основным затруднением здесь является тот факт, что в большей части исследований эксперименты ставились, в основном, либо на животных, либо на культуре животных клеток in vitro (Adams, 1997). Использование животных и линии клеток создает ряд затруднений, поскольку жизненный цикл животных очень продолжителен, а для линии клеток млекопитающих также свойственны трудности в их культивировании и невозможности моделирования ряда физиологических ситуаций. Наиболее важным препятствием для использования в качестве модели животных и культуры клеток in vitro является крайне ограниченное применение методов молекулярной биологии, невозможность получения мутантов клеточных линий по определенному признаку.
В последнее время в качестве модели для исследования биохимических аспектов старения, экспериментаторы всего мира интенсивно используют дрожжи Saccharomyces cerevisiae (Austriaco and Guarente, 1999). Было показано, что старение дрожжей S. cerevisiae на клеточном уровне очень сходно с таковым для клеток высших эукариот (Gershon and Gershon, 2000). Арсенал средств молекулярный биологии, применимый к исследованию дрожжей, очень обширен. Достаточно сказать, что весь геном этих дрожжей не только расшифрован, но и частично функционально охарактеризован (Austriaco and Guarente, 1999). Получены мутанты этих клеток, как долгожителей, так и наоборот, живущих ограниченное количество генераций (Bonhivers et al., 1989). Помимо этого, благодаря пластичности своего метаболизма, возможности четкого контроля условий культивирования,
5 дрожжевые клетки являются удобным и функциональным объектом для решения многих задач биохимической геронтологии.
Последние годы ознаменовали собой развитие нового направления в геронтологии - концепции метаболического контроля старения (Jazwinski, 1999). Основу этой концепции составляет исследование роли метаболических реакций, их регуляции в развитии молекулярных основ старения. Был выявлен и охарактеризован ряд генов, принимающих участие в регуляции процессов старения. Тот факт, что эти гены также участвуют в регуляции некоторых биохимических реакций, дает основания полагать, что метаболический контроль старения является комплексным процессом, вовлекающим многие стороны клеточной физиологии. Вместе с тем негативной является тенденция исследования молекулярно-генетических основ старения в полном отрыве от клеточной физиологии, в частности биоэнергетики.
Немногочисленные физиологические исследования процессов старения на клеточном уровне позволили выявить некоторые интересные закономерности. Так, открытие эффекта «ограничения калорий», согласно которому продолжительность жизни индивидуума зависит от количества потребляемых им калорий, является важным экспериментальным подтверждением роли метаболического контроля в старении клеток (Black et al., 2001). Дальнейшие исследования в этой области позволили выявить, что эффект «ограничения калорий» характерен не только для клеток высших эукариот, но также для дрожжей (Jazwinski, 1999).
Было обнаружено, что продукция митохондриями эукариотических клеток активных форм кислорода является важным условием инициации старения клеток (Harman, 1999). Усиленная экспрессия в клетках дрожжей ферментов, участвующих в антиоксидантной защите, позволила значительно продлить их жизнь (Jakubowski et al., 2000). Результатом продолжения этих работ является обнаружение важной роли АФК-зависимого апоптоза в регуляции старения клеток дрожжей. Было показано, что старение дрожжей
сопровождается усилением образования в них АФК, которые, в свою очередь, активируют апоптические пути, приводящие к гибели старых клеток.
Вместе с этим полученные экспериментальные данные о роли метаболического контроля в реализации процессов старения являются ничтожно малыми по сравнению с еще невыясненными. Так, например, совершенно неисследованными остаются изменения в цикле Кребса и гликолизе, хотя эти метаболические пути являются основными энергетическими и биосинтетическими путями во всех эукариотических клетках. Нарушения в функционировании этих метаболических путей могут приводить к значительному изменению метаболического профиля клеток, в общем, и развитию многих клеточных болезней, в частности.
Благодаря работам Кулаева, была показана важнейшая роль неорганических полифосфатов в функционировании эукариотических клеток (Kulaev et а/., 1999). Недавно обнаружена важная роль полифосфатов в поддержании жизнеспособности клеток S. cerevisiae в условиях стационарной фазы, что дает основание предполагать их участие в процессах старения (Kulaev and Vagabov, 1983). В связи с этим возникает необходимость разностороннего исследования изменений в метаболизме стареющих эукариотических клеток с использованием S. cerevisiae как модели.
Целью настоящей работы было выяснение роли некоторых метаболических путей в регуляции процессов хронологического старения дрожжей S. cerevisiae. В соответствии с этим в данной работе были сформулированы следующие задачи:
1. Разработать экспериментальную модель для исследования
хронологического старения дрожжей S. cerevisiae.
2. Исследовать функциональные изменения стареющих клеток, а также
обнаружить в них маркеры старения, таких, как размер клеток и аккумуляция
в них ВХД.
Изучить роль ключевых ферментов гликолиза, а также гликогена и трегалозы в поддержании жизнеспособности дрожжей S. cerevi.siae в процессе хронологического старения.
Исследовать изменения в функциональной активности митохондрий, а также основных окислительных метаболических путей (цикл Кребса, глиоксалатный цикл) в хронологически стареющих дрожжах S. cerevisiae.
Изучить изменения в полифосфатном метаболизме хронологически стареющих дрожжей S. cerevisiae.
Научная новизна работы
Впервые проведено разностороннее исследование изменений в основных метаболических путях дрожжей S. cerevisiae в условиях их старения. Было показано, что в условиях роста на глюкозе старение клеток приводит к снижению активности ключевых ферментов гликолиза, потребления глюкозы и неспособности аккумулировать гликоген и трегалозу. Исследование экспрессии ГС и ТС в стареющих клетках показало, что именно снижение экспрессии этих ферментов и являлось непосредственной причиной неспособности стареющих клеток аккумулировать запасные углеводы. Потеря способности стареющих клеток накапливать запасные углеводы, приводило к снижению их жизнесопособности.
Нами впервые было выяснено, что старение клеток в аэробных условиях приводит к резкому снижению функциональной активности митохондрий и основных дегидрогеназ цикла Кребса. На этом фоне для клеток стареющей культуры было характерно резкое усиление сукцинат-зависимых путей метаболизма. Резкое усиление окисления сукцината было возможно, поскольку в клетках стареющей культуры происходило усиленное образование этого метаболита в ГЛЦ. Предполагается, что усиление функциональной значимости этого метаболического пути является адаптационной мерой, направленной на поддержание жизнеспособности
8 стареющих клеток. Вероятно, этот механизм развился в клетках в результате внутрипопуляционного отбора. Эксперименты, проведенные на стареющих клетках S. cerevisiae в присутствии 1 мМ сукцината, позволили выявить мощный геропротекторный потенциал у этого метаболита.
Исследование полифосфатного обмена показало, что процесс старения клеток сопровождается усиленным потреблением третьей фракции полиР, биогенез которой сопряжен с синтезом ДНК и аккумуляцией пятой фракции, функции которой остаются неизвестными до настоящего времени. На основании этих данных можно предполагать, что старение клеток приводит к переходу запасания макроэргических связей с АТФ на полиР. Подобный механизм является эволюционно очень древним, и его активация характерна для продолжительного действия мощных стресс-факторов (Kulaev et al., 1999).
Научно-практическая значимость
Полученные в работе новые данные о механизмах метаболического контроля старения S. cerevisiae расширяют представления о развитии процессов старения, их связи с определенными метаболическими реакциями не только для этого организма, но и для клеток высших эукариот.
Данная работа является фундаментальным исследованием, однако, полученные результаты могут использоваться для метаболической коррекции старения эукариотических клеток и соотвественно, иметь практическое значение для клинической геронтологии и биотехнологии.
Апробация работы
Материалы исследований, изложенные в диссертации, были представлены на 5-м симпозиуме «Свободные радикалы в биологии и медицине» (Лодзь, Польша, 2000), конференции «Окислительный стресс:
9 биохимия и патофизиология» (Валенсия, Испания, 2000), 1-й Конгресс ФЕМО (Любляна,. Словения), 5-й съезд биохимиков Испании (Мадрид, Испания, 2002), 12-й съезд биохимиков Франции (Париж, Франция, 2003).
Диссертация представлялась и получила одобрение на заседании лаборатории метаболической биофизики Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино.
Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании кафедры биохимии и биофизики Саратовского госуниверситета 9 октября 2003 года.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 9 работ в зарубежных и отечественных изданиях.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Запасным углеводам принадлежит основная роль в поддержании
жизнеспособности хронологически стареющих клеток в анаэробных
условиях.
В хронологически стареющих клетках в аэробных условиях происходит усиление сукцинатной ветви окисления. Экзогенный сукцинат в концентрации 1 мМ обладает геропротекторным потенциалом
Разработанная модель хронологического старения позволяет исследовать изменения в метаболизме, специфически сопряженные со старением.
Работа выполнена на кафедре биохимии и биофизики Саратовского государственного университета; лаборатории биохимии микроорганизмов Университета Комплутенсиа (Мадрид, Испания); лаборатории «Молекулярной биохимии» (Тулуза, Франция); лаборатории «Регуляции
10 биохимических процессов» ИБФМ РАН (Пущино, Россия); лаборатории «Метаболической биофизики» (ИТЭБ РАН, Пущино, Россия).
Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, описывающей материалы и методы исследования, полученные результаты и их обсуждение, заключения и выводов. Список цитируемой литературы содержит 191 источников, в том числе 183 зарубежных. Работа изложена на 126 листах машинописного текста, содержит 20 рисунков и 10 таблиц.
S. cerevisiae как возможная модель для исследования процессов старения на клеточном уровне
Обоснование выбора модели: 1. Дрожжи представляют собой одноклеточный организм с коротким и хорошо изученным жизненным циклом (Austriaco and Guarente, 1997); 2. Дрожжи имеют небольшой геном (порядка 6 000 генов), который был полностью расшифрован (Afshar and Murnane, 1999); 3. Хорошо изученные физиологические характеристики этого организма позволяют успешно применять методы молекулярной биологии, способствующие лучшему пониманию его клеточной биологии (Blomberg, 2000); 4. Множество генов S. cerevisiae имеют гомологи в геноме человека, включая некоторые гены, обуславливающие возникновение патологий. Некоторые гены человека успешно экспрессируются в дрожжах, что позволяет точно выявить их роль в том или ином физиологическом процессе. Поскольку у дрожжей получено множество самых разнообразных мутантов, это позволяет легко выявить роль отдельного гена в различных физиологических ситуациях, например при старении (Afshar and Murnane, 1999); 5. Дрожжи являются недорогим экспериментальным объектом, способным расти на самых разнообразных питательных средах. Выращивание их на твердых агаровых средах дает возможность с помощью микроманипуляторов отделять каждую почку от материнской клетки, тем самым, позволяя напрямую исследовать их жизненный цикл. Все. вышеперечисленное сделало дрожжи S. cerevisiae популярной моделью, позволяющий исследовать развитие и регуляцию процессов старения в эукариотических клетках. Исследование биологии старения дрожжей S. cerevisiae позволило разделить этот процесс на два основных типа: репликативное и хронологическое. Репликативное старение дрожжей представляет собой способность клеток к почкованию. Обычно материнская клетка осуществляет 30-40 генераций, после чего переходит в митотически неактивное состояние. Каждое почкование оставляет на клеточной стенке материнской клетки так называемый «родильный рубец». Репликативное старение характерно и для клеток млекопитающих, т.е пролиферативная жизнь или эффект Хейфлика. Еще в 1961 году Хейфлик и Мурхед представили данные о том, что даже в идеальных условиях культивирования фибробласты эмбриона человека способны делиться ограниченное число раз (около 50) (Hayflich L and Moorhcad D, 1961). В повторных опытах это наблюдение было многократно воспроизведено, а сам феномен получил по имени автора название «предела Хефлика». Интересно отметить, что репликативный потенциал дрожжей крайне сходен с таковым для высших эукариот. В обеих случая, клетки способны максимум на 50 генераций. В 1971 году Оловников на основании появившихся к тому времени данных о принципах синтеза ДНК в клетках предложил гипотезу маргинотомии, объясняющую механизм работы такого счетчика (Оловников A.M., 1971). По мнению автора гипотезы, при матричном синтезе полинуклеотидов ДНК-полимераза не в состоянии полностью воспроизвести линейную матрицу, реплика всегда получается короче в ее начальной части. Таким образом, при каждом делении клетки ее ДНК укорачивается, что ограничивает пролиферативный потенциал. В дрожжах количество теломер намного больше, чем в клетках высших эукариот, поэтому, они, очевидно, не лимитирует количество генераций в этих организмах. В отличие от клеток высших эукариот, в дрожжах репликативную активность лимитирует накопление ВХКД (Sinclair, 1999). В противоположность репликативному старению, хронологическое отражает время существования митотически неактивных клеток. В процессе такого существования, в клетках происходит накопление повреждений клеточных полимеров (ДНК, РНК, белки), инактивация ферментов. Накопление повреждений в митотически неактивных клетках, происходит гораздо интенсивнее, чем в активно реплицирующихся, поскольку в последнем случае в клетках происходит интенсивное образование новых молекул необходимых для роста и образования дочерних клеток (Longo, 1999). Важная роль в развитии повреждений клеточных структур отводится АФК, генерация которых значительно интенсивнее в старых клетках, чем в молодых (Nichols D, 2001). Практически аналогичный тип старения присущ и клеткам высших эукариот, например, при достижении монослоя в условиях in vitro, жизни митотически неактивных фибробластов в многоклеточном организме, а также неоплодотворенной яйцеклетки в яичниках (Gershon and Gershon, 2000). Вместе с тем, существование митотически неактивных клеток, характерно и для стационарной фазы роста культуры микроорганизмов. Можно ли принять это за хронологическое старение? Конечно, в стационарной фазе, клетки митотически неактивны, их метаболизм снижается, тогда как интенсивность генерации АФК, напротив усиливается, приводя к возникновению окислительных повреждений клеточных структур. Тем не менее, основной причиной этих негативных процессов служит истощение среды выращивания и накопления в ней токсических продуктов метаболизма. В этом случае гибель клеточной популяции наступает в течение нескольких дней. В другом случае, в условиях стационарной фазы, некоторые микроорганизмы могут жить продолжительное время, переходя при этом в покоящиеся состояние. Наиболее ярким представителем является М. luteus (Mukamolova GV et al, 1999). В работе Ashfari (Ashfari et al., 1999), была предпринята попытка выяснить, как функциональную связь между репликативным и хронологическим старением. Автором было показано, что репликативная активность клеток напрямую зависит от времени их хронологического старения. Автор предполагает, что во время хронологического старения клеток, в них накапливается некий фактор, лимитирующий пролиферативную активность клеток.
Выбор экспериментальной модели для исследования старения во многом определяет характер полученных результатов. Именно поэтому совершенно необходимо дать краткое описание основных методических приемов, наиболее широко используемых для исследования старения у дрожжей.
Если для экспериментального исследования репликативного старения дрожжей метод с использованием микроманипуляторов (Werner-Washburne М, 1996) является общепризнанным и не вызывающим сомнений, то для хронологического старения не все так однозначно.
Для исследования хронологического старения в настоящее время используются две экспериментальные модели (Longo, 1999).
Первая из них основана на пролонгированной стационарной фазе. В этой модели клетки находятся в истощаемой с течением времени среде роста. В таких условиях жизнеспособность резко падает уже после 5-го дня выращивания клеток. Помимо этого в этой модели клетки не переходят в постмитотическое состояние и не синхронизированы. И, наконец, в данных условиях клетки испытывают перекрестное влияние факторов истощения среды и накопления токсических продуктов метаболизма. В конечном счете, основной причиной гибели клеток является окислительный стресс за счет усиления продукции активных форм кислорода митохондриями. Еще в 1959 году Mortimer и Johnston предостерегали от возможности влияния факторов истощения среды и накопления в ней токсических продуктов метаболизма на стареющие клетки (Mortimer and Johnston, 1959).
Полифосфаты. Строение, локализация, функции в клетках дрожжей S. cerevisiae
Цикл Кребса во всех эукариотических клетках объединяет конечные этапы окисления белков, жиров, углеводов. Реакции цикла Кребса принципиально одинаковы во всех эукариотических клетках. Различия проявляются только на уровне регуляции этих реакций. В отличие от цикла Кребса у млекопитающих, у дрожжей он исследован гораздо хуже, хотя и не отличается принципиально от такового в клетках млекопитающих (рис. 7, приложение). Очевидно, это связано с трудностью разрушения клеточной стенки дрожжей, большей лабильности ферментов цикла Кребса, ограниченностью применения методов иммуноанализа. В задачи данной работы не входит детальное описание функционирования цикла Кребса в дрожжах. Здесь будет дано краткое описание механизмов регуляции ключевых ферментов цикла Кребса у дрожжей S. cerevisiae.
Фермент, который, возможно, контролирует прохождение потока метаболитов через цикл Кребса, является митохондриальная ЦС (Srere, 1962). Известно, что фермент из S. cerevisiae регулируется несколькими эффекторами, в частности, адениновыми нуклеотидами (Bartels and Jensen, 1954). Было выяснено, что ЦС из дрожжей S. cerevisiae, в основном, регулируется концентрацией субстрата - оксалоацетата (Cleland and Johnson, 1989).
Ферментом, катализирующим вторую реакцию цикла Кребса, является аконитаза. Насколько известно, этот фермент у дрожжей S. cerevisiae не регулируется какими-либо метаболическими эффекторами. Равновесие аконитазной реакции сильно сдвинуто в сторону образования цитрата, поэтому в метаболически активных митохондриях дрожжей можно обнаружить лишь небольшое количество изоцитрата. Маловероятно, чтобы этот фермент принимал участие в регуляции цикла Кребса (Neilson, 1986). Так, мутантный штамм S. cerevisiae, синтезирующий преимущественно цитрат, обладал пониженной активностью аконитазы, тогда как мутантный штамм, накапливающий изоцитрат, характеризовался повышенной активностью данного фермента (Evans et al., 1981).
В клетках животных, растений, грибов, а также дрожжей обнаружено два типа ИЦДГ, которые отличаются по коэнзимной специфичности, субклеточной локализации, физико-химическим и кинетическим свойствам (Hathway and Atkinson, 1963). НАД-ИЦДГ локализована в митохондриях, локализация НАДФ-зависимого фермента определяется видом организма (Barnes et aL, 1972). НАДФ-ИЦДГ дрожжей S. cerevisiae подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен, не активируется АМФ и ингибируется смесью оксалоацетата и глиоксилата. Вместе с тем она не регулируется по механизму фосфорилирования/дефосфорилирования в отличие от фермента из бактерий, у которых фосфорилирование НАДФ-ИЦДГ инактивирует фермент и переключает обмен с окислительного на глиоксилатный, анаплеротический путь. Полагают, что одна из функций НАДФ-ИЦДГ заключается в образовании НАДФН, необходимого для процессов биосинтеза (Bruinenberg et aL, 1983). НАД-ИЦДГ является одним из ключевых регуляторных ферментов цикла Кребса. Кинетика фермента имеет сложную S-образную зависимость, характерную для аллостерических ферментов. Считается, что в цикле Кребса преимущественно участвует НАД-ИЦДГ (Chan et aL, 1985). НАД-ИЦДГ из S. cerevisiae состоит из двух неидентичных субъединиц (38 кДа и 40 кДа), объединенных в октамерный комплекс (Chan et aL, 1985). Фермент требует наличия в реакционной смеси ионов Мп2+, необходимых для его активации (Bowes and Mattey, 1979). У дрожжей из S. cerevisiae фермент имеет большее сродство к изоцитрату (Км=109 мкМ), нежели к НАД (Км=365 мкМ) (Barnes etaL, 1972).
Известно, что АМФ является аллостерическим активатором НАД-ИЦДГ микроорганизмов, тогда как в животных клетках эта роль принадлежит АДФ (Bartels and Jensen, 1954). АМФ повышает сродство фермента к изоцитрату, но не влияет на максимальную скорость реакции.
Роль КГД в регуляции цикла Кребса в дрожжах до настоящего времени не установлена. Связано это очевидно с тем, что и по сегодняшний день методов мягкой дезинтеграции дрожжевой клетки не предложено. КГД же является крайне лабильным, мультиферментным комплексом, легко инактивирующимся при разрушении клеток (Mexincr-Minori et aL, 1985). Вероятно, наиболее интересным ферментом, все более и более привлекающим внимание исследователей, является СДГ. Остановимся более подробно на этом ферменте.
СДГ S. cerevisiae представляет собой гетеротетрамер, сходный по своей структуре с СДГ из сердца млекопитающих. Каждая субъединица дополнительно, путем ограниченного протеолиза, подвергается посттрансляционной модификации и уже только после этого транспортируется в митохондрии (Lemire and Oyedotun, 2002). Субъединицы Sdhl и Sdh2 формируют каталитичекий димер фермента, который содержит активный сайт, флавиндинуклеотид и три железосодержащих кластера. Субъединицы Sdh3 и Sdh4 являются димером, который содержит гем и участок, необходимый для связывания с убихиноном (Lemire and Oyedotun, 2002).
В дрожжах S. cerevisiae экспрессия СДГ репрессируется глюкозой. Так, было выяснено, что промотор Sdh2-cyбъeдиницы более чем в 4 раза активен в отсутствие глюкозы в среде роста, чем в ее присутствии. Сходные результаты были получены для Sdh4-cyбъeдиницы. Выращивание дрожжей S. cerevisiae на среде, содержащей галактозу (несбраживаемый углевод), приводило к возрастанию в клетках уровня мРНК субъединицы Sdh4. Добавление глюкозы в течение 5 мин в среду, содержащую несбраживаемый углевод, приводит практически к полному исчезновению мРНК субъединиц Sdhl и Sdh4. Механизм этого явления на сегодняшний день не ясен (Lemire and Oyedotun, 2002).
Загадочной остается роль гема в регуляции активности СДГ. Эксперименты, проведенные в этом направлении, дают основания полагать, что гем может участвовать в сигнальных функциях между митохондриями и ядром. В клетках S. cerevisiae СДГ может являться источником свободных радикалов, запускающих развитие окислительного стресса (Lemire and Oyedotun, 2002). Наконец, нами было показано, что хронологическое старение дрожжей S. cerevisiae приводит к усилению сукцинатной ветви метаболизма. Предполагается, что усиление сукцинатной ветви метаболизма, позволяет стареющим клеткам максимально эффективно поддерживать свою жизнеспособность (Samokhvalov et al., 2003).
Было показано, что цикл Кребса не только является основным механизмом, интегрирующим биоэнергетические пути. Так, в работе Hamel показано, что именно цикл Кребса является основным механизмом, формирующим резистентность клеток Pseudomonas fluorescens к действию ионов тяжелых металлов (Hamel and Appanna, 2001). Этот эффект был подтвержден в отношении токсического действия арсенита (Самохвалов и др., 2003).
Исследование метаболических изменений в стареющих дрожжах S. cerevisiae с анаэробным типом метаболизма
Как показано на (рис. 10, приложение), до конца второй недели эксперимента снижение жизнеспособности клеток культуры с анаэробным типом метаболизма (в присутствии 2 % глюкозы) было практически неизменным.
Тем не менее, с конца второй недели старения происходило резкое снижение жизнеспособности клеток, достигающее 44 % в конце третьей недели старения. В дальнейшем снижение жизнеспособности происходило гораздо более медленными темпами. К концу эксперимента жизнеспособность снижалась до 36 % по сравнению с исходным уровнем. Подобная же закономерность была обнаружена нами при анализе динамики оптической плотности культуры (рис. 11, приложение). На протяжении всего периода старения культуры мы обнаружили увеличение размера клеток. Вплоть до конца эксперимента мы не наблюдали почкующихся клеток (данные не представлены).
Нами была обнаружена интересная закономерность - хронологическое старение культуры в течение первой недели приводило к резкому увеличению содержания как гликогена, так и трегалозы в клетках, выходящее на плато в течение второй недели старения культуры. Тем не менее, с третьей недели старения содержание запасных углеводов в клетках резко падало и не обнаруживалось вплоть до конца эксперимента (рис. 12, приложение). Интересным является тот факт, что, несмотря на отсутствие в клетках после третьей недели старения и гликогена, и трегалозы, их жизнеспособность сохранялась на уровне 36 %. Известно, что метаболизм запасных углеводов в дрожжевой клетке тесно связан с гликолитическим потоком (Rosenzweig, 1992). В связи с этим было бы интересно проследить изменения в активности основных ферментов гликолиза в стареющих клетках. Полученные нами результаты представлены в (табл. 3, приложение). Мы выяснили, что к концу первой недели старения культуры активность исследуемых ферментов в клетках повышалась, оставаясь практически на том же уровне в течение второй недели. После второй недели старения культуры активность ферментов резко снижалась, практически неизменясь после этого вплоть до конца эксперимента. Таким образом, мы выяснили, что активность гликолиза, по крайней мере, его верхней ветви, в стареющих клетках снижается. В любом случае снижение прохождения метаболитов через верхнюю ветвь будет лимитировать их превращения в нижней ветви гликолиза.
В настоящее время является доказанным, что процесс свободно-радикального окисления является одной из главных причин старения клеток (Jakubowski et al., 2000; Harman, 1998). Было важным определить их вклад в старение клеток в наших условиях. Так как в процессе старения культуры уровень ТБК-активных продуктов (маркер интенсивности процессов свободно-радикального окисления (Steels, 1994) в клетках не изменялся, мы полагаем, что участие процессов свободно-радикального окисления в развитии деградационных процессов в клетках стареющей культуры было несущественно (табл. 4, приложение). Определение карбонильных групп белков (маркер окислительных повреждений биополимеров) также подтверждает это (рис. 13, приложение). Известно, что генерация активных форм кислорода происходит в основном в дыхательной цепи митохондрий. Присутсвие глюкозы в среде старения дрожжей инициирует в них развитие эффекта Крэбтри (анаэробный тип метаболизма), приводящего к подавлению образования митохондрий. Именно поэтому, дрожжи с анаэробным типом метаболизма неспособны, продуцировать активные формы кислорода. Наблюдаемые нами изменения в жизнеспособности клеток в стареющей культуре, содержании в них запасных углеводов и активности гликолитических ферментов объединяет общая закономерность - их двухфазный характер. На представленных рисунках и таблицах заметно, что резкие изменения в наблюдаемых параметрах были характерны для первой и третьей недели старения. Именно в этих периодах старения в клетках происходили, очевидно, наиболее кардинальные изменения в их метаболическом статусе.
Основываясь на полученных нами данных, мы полагаем, что резкое увеличение в клетках (в течение первой недели старения) активности ферментов гликолиза и накопления запасных углеводов является адаптационным механизмом, позволяющим клеткам поддерживать свою жизнеспособность.
Первым этапом в реализации этих механизмов является увеличение активности ферментов верхней ветви гликолиза, что способствует усилению утилизации глюкозы. Усиленное образование гликолитических интермедиатов и их включение в различные биосинтетические реакции является вторым этапом. Наконец, как следствие всего этого, происходит накопление в клетках запасных углеводов. Так, вплоть до конца второй недели это позволяет клеткам эффективно поддерживать свою жизнеспособность.
Дальнейшее старение культуры, сопровождающееся снижением активности гликолитических ферментов и потерей способности клеток накапливать гликоген и трегалозу, приводит к снижению интенсивности их адаптационных механизмов. Именно это, очевидно, и являлось непосредственной причиной снижения жизнеспособности клеток стареющей популяции. Подобная закономерность изначально резкого увеличения содержания трегалозы, а затем стремительного падения ее содержания в клетках Escherichia coli, подвергнутых действию холодового шока, описана в работе Lillie (Lillie and Pringle, 1980). Несомненно, интересным представляетсяся тот факт, что клетки в наших условиях поддерживали жизнеспособность после четвертой недели старения, когда они уже были неспособны накапливать запасные углеводы. Между тем из работы Lillie известно, что клетки дрожжей, теряющие способность накапливать резервные углеводы, быстро гибнут (Lillie and Pringle., 1980). Подобные противоречия можно объяснить следующим образом. Если в работах Lillie была использована модель стационарной фазы, где клетки находятся в условиях истощенной по источнику углерода среды, что резко усиливает процент гибели клеток, то в наших условиях стареющая культура поддерживалась на регулярно обновляемой среде. Старение клеток в условиях регулярно заменяемой среды выращивания не только избавляет от перекрестного влияния эффекта истощения среды выращивания и воздействия токсических продуктов метаболизма, но и в то же время способствует развитию адаптационных механизмов в стареющих клетках. Старение культуры сопровождается непрерывным отбором, где наиболее приспособленные клетки выживают, а наименее - гибнут или дезактивируется. В конечном счете, это приводит к возникновению клеток-долгожителей, развивающие компенсаторные метаболические пути, не проявляющиеся у «юных» клеток, которые позволяют им наиболее эффективно поддерживать свою жизнеспособность. Все это дает нам основания полагать, что именно отбор клеток с развитием каких-то обходных метаболических путей, позволяющих им выживать без накопления резервных углеводов, и являлся основной причиной их выживания.
Динамика содержания неорганических полифосфатов в клетках стареющей культуры S. cerevisiae
Мы показали также одновременное возрастание чувствительности роста и устойчивости S. cerevisiae к АОА и малонату в условиях их аэробного выращивания с этанолом (Samokhvalov el al., 2003). АОА оказывал значительно меньшее тормозящее действие на дрожжи, выращиваемые на глюкозе. Разница в чувствительности дрожжей к АОА с аэробным и анаэробным типом обмена свидетельствует о том, что его действие направлено, главным образом, на процессы окисления, а не обмена аминокислот. На это же указывает полная корреляция с чувствительностью к малонату. Общим условием их возникновения можно считать воздействие факторов, активирующих физиологические функции или даже стрессовые реакции. Обнаружение реципрокного изменения интенсивности окисления сукцината и НАД-зависимых субстратов на разных объектах позволяет заключить, что это переключение является широко распространенным механизмом.
Таким образом, активация в стареющих клетках гл и оксалати о го цикла, а также, очевидно, процессов переаминирования приводит к мощному образованию сукцината за счет усечения цикла Кребса. Такое мощное образование сукцината в стареющих клетках должно привести к адекватной активации путей, его окисляющих.
Действительно, обнаруженный нами эффект увеличения активности сукцинатдегидрогеназы (ключевого фермента окисления сукцината) и доли малонат-чувствительного дыхания дает основания полагать об усилении окисления сукцината комплексом II в клетках стареющей культуры.
Среди преимуществ, которые может дать усиление окисления сукцината в стареющих клетках, следует отметить возрастание мощности образования АТФ и генерации потенциала на внутренней мембране митохондрий. Более того, усиление путей метаболизма сукцината в клетках стареющей культуры может подавлять процессы свободнорадикального окисления. Хорошо известным является тот факт, что мощное окисление сукцината способствует поддержанию НАДФ в его восстановленной форме. Восстановленная форма является кофактором некоторых ферментов антиоксидантной защиты клеток. Названные преимущества усиления сукцинат-зависимых путей могут быть особенно важны для поддержания жизнеспособности клеток.
Вместе с тем, эффект увеличения активности сукцинатдегидрогеназы является неожиданным, поскольку в литературе имеются данные, что старение клеток высших эукариот приводит к снижению активности сукцинатдегидрогеназы по двум основным механизмам: повреждение фермента свободными радикалами и накопление в стареющих клетках гидрофобных ингибиторов этого фермента (Nickols, 2002). Мы можем объяснить это нижеследующим.
Мы уже упоминали выше о роли внутрипопуляционного отбора в появлении клеток-долгожителей. Это дает нам основания полагать, что именно отбор клеток с увеличенной активностью сукцинатдегидрогеназы происходил в стареющей культуре S. cerevisiae в наших условиях.
Непосредственной причиной гибели части популяции стареющих клеток может быть усиление в них процессов свободнорадикального окисления. Увеличение в стареющих клетках ТБК-активных продуктов подтверждает это предположение. Повреждающее действие процессов свободно-радикального окисления являлось также наиболее вероятной причиной снижения активности дегидрогеназ цикла Кребса в клетках стареющей культуры. Действительно, было показано, что активность аконитазы и кетоглутаратдегидрогеназы может сильно ингибироваться при активации процессов свободнорадикального окисления (Humphries and Szweda, 1998). Причиной гибели клеток может быть также увеличивающаяся активность алкогольдегидрогеназы, приводящая к накоплению в клетках токсического продукта реакции - ацетальдегида. Тем не менее, обнаруженное нами увеличение активности ацетальдегиддегидрогеназы параллельно с активностью алкогольдегидрогеназы, делает это предположение маловероятным.
Таким образом, мы можем сделать два важных вывода. В стареющих клетках глиоксилатный цикл функционирует не только как шунт, позволяющий обеспечить развитие анаплеротических реакций, но и так же, как механизм, способный обходить наиболее медленные или поврежденные реакции цикла Кребса. Вероятным биологическим смыслом этого является возможность интенсивного образования сукцината. Очевидно, в стареющих клетках глиоксилатный цикл становится своего рода циклом «янтарной кислоты». Преимущества мощного окисления сукцината были показаны нами выше.
Выполнение глиоксилатным циклом некоторых функций цикла Кребса в стареющих клетках является, вероятно, важным биологическим механизмом, позволяющим наиболее эффективно адаптироваться к условиям окружающей среды. Так, в работе Hamel было показано, что стрессорное воздействие, вызванное обработкой Pseiidomonas fluorescens солями алюминия, приводит к снижению активности цикла Кребса и сопутствующему усилению функционирования глиоксалатного цикла (Hamel and Appanna, 2001). Вероятным биологическим смыслом этого явления может быть возможность быстрого и мощного образования сукцината.
Принимая вышеизложенное во внимание, мы считаем перспективными дальнейшие исследования, направленные на выяснение роли сукцинат-зависимых путей метаболизма в реализации метаболического контроля старения эукариотических клеток.
Добавление сукцината до конечной концентрации 1 мМ в среду старения клеток в значительной степени воздействовало на процесс старения культуры. Ниже проиллюстрировано (рис 19, приложение), что жизнеспособность клеток, стареющих в присутствии сукцината, значительно выше, чем в его отсутствие. Этот факт дает основание предполагать наличие у сукцината выраженного геропротекторного потенциала. Дальнейшие эксперименты подтвердили справедливость этого утверждения. Представленные данные (табл. 5, приложение) показывают, что старение культуры приводит к значительному подавлению функциональной активности митохондрий клеток. Добавление сукцината к стареющей культуре значительно нивелировало этот негативный эффект старения. Хорошо заметно, что энергетический контроль дыхательной цепи (FCCP/олигомицин) и процент стимуляции окислительного фосфорилирования митохондрий клеток (общее-олигомицин)/(РССР-олигомицин), стареющих в присутствии сукцината гораздо выше, чем в его отсутствие. Из (табл. 8, приложение) видно, что доля олигомицин-чувствительного дыхания у клеток стареющих в присутствии экзогенного сукцината, в 3 раза выше, чем у клеток, стареющих в его отсутствие. Этот факт свидетельствует в пользу того, что присутствие сукцината стимулирует потребление кислорода, сопряженного с образованием АТФ на внутренней мембране митохондрий. На 17 % выше было малонат-чувствительное дыхание клеток, стареющих в присутствии экзогенного сукцината.
Существенным было влияние экзогенного сукцината на активность ферментов цикла Кребса. Хорошо заметно, что присутствие сукцината в процессе старения клеток оказывает выраженный протекторный эффект на активность ферментов цикла Кребса (табл. 9, приложение). Так, активность НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ была значительно выше в клетках, стареющих в присутствии сукцината, чем в его отсутствие. Активность НАД-ИЦДГ определялась вплоть до конца эксперимента. Активность ЦС и АЦДГ также была значительно выше в присутствии сукцината. Присутсвие сукцината приводило к резкому увеличению активности алкогольдегидрогеназы. Вместе с этим мы обнаружили, что малатдегидрогеназная активность стареющих клеток значительно снижалась в присутствии экзогенного сукцината.
