Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы: Амилоидные белки 9
1. Амилоиды — структура и механизм формирования 9
2. Характерные особенности структуры амилоидов и теоретические основы подходов, применяемых при их изучении
2.1. Выявления потенциально амилоидогенных последовательностей в составе полипептидной цепи белка in silica 14
2.2. Экспериментальные подходы, применяемые при изучении структуры амилоидных фибрилл 3. Распространенность амилоидов в природе 36
4. Внеклеточные и поверхностные амилоиды микроорганизмов
4.1. Амилоиды, формирующие фимбрии (пили) бактерий 45
4.2. Амилоиды, обеспечивающие гидрофобность поверхностей микроорганизмов...46
4.3. Цитотоксичные белки, формирующие амилоиды 49
4.4. Амилоидные белки бактериальных биопленок 50
4.5. Амилоидный адгезии КС дрожжей Candida albicans 51
4.6. Амилоиды микроорганизмов и болезни 53
5. Заключение и постановка задач исследования 57
Материалы и методы 58
1. Используемые в работе реактивы 58
2. Штаммы микроорганизмов и условия их выращивания 58
3. Электрофорез в денатурирующих условиях 59
4. Вестерн-блот-анализ 60
5. Выделение клеточных стенок дрожжей 60
6. Частичная депротеинизация клеточных стенок 61
7. Экстракция белков из предварительно биотинилированных клеточных стенок дрожжей (Mrsa et al., 1997) 62
8. Выделение глюкантрансферазы Bgl2p из клеточных стенок дрожжей 63
9. Флуоресценция тиофлавинаТ
10. Спектроскопия кругового дихроизма 64
11. MALDIOF масс-спектрометрия 65
12. Микроскопические методы анализа 65
13. Определение глюкантрансферазной активности Bgl2p 66
14. Компьютерный анализ структуры белков 67
15. Эксперименты над лабораторными мышами
15.1. Введение мышам препаратов КС 68
15.2. Изучение двигательной активности и ориентировочно-исследовательского поведения подопытных мышей 68
15.3. Гистологические методы исследования 69
Результаты и их обсуждение 71
1. Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей белков КС дрожжей S. cerevisiae 71
2. Экспериментальное выявление белков КС, обладающих свойствами амилоидов 78
3. Краткий обзор литературы: глюкантрансфераза Bgl2p из КС дрожжей S. cerevisiae. 83
4. Подбор условий выделения глюкантрансферазы Bgl2p из КС дрожжей S. cerevisiae 87
5. Характеристика свойств глюкантрансферазы Bgl2p 90
5.1. Компьютерный анализ последовательности Bgl2p 90
5.2. Экспериментальная характеристика свойств Bgl2p 95
5.3. Определение глюкантрансферазной активности Bgl2p 100
5.4. Изменения в белковом составе КС, происходящие при делении renaBGL2 106
6. Исследование влияния инъекций суспензии КС на организм мышей 110
Выводы 117
Список цитируемой литературы
- Выявления потенциально амилоидогенных последовательностей в составе полипептидной цепи белка in silica
- Цитотоксичные белки, формирующие амилоиды
- Электрофорез в денатурирующих условиях
- Экспериментальное выявление белков КС, обладающих свойствами амилоидов
Выявления потенциально амилоидогенных последовательностей в составе полипептидной цепи белка in silica
Основную роль при формировании кросс-р-структуры играют взаимодействия между главными цепями белковых мономеров. Некоторые исследователи полагают, что формирование амилоидной структуры присуще для полипептидной цепи вне зависимости от ее состава (Chiti and Dobson, 2006). Однако с практической точки зрения, состав боковых цепей полипептида весьма важен, поскольку внутримолекулярные и межмолекулярные взаимодействия остатков боковых цепей могут как стабилизировать, так и дестабилизировать амилоидные фибриллы. Дестабилизация может приводить к тому, что условия, в которых будет наблюдаться образование амилоида данным полипептидом (рН, ионная сила раствора, присутствие денатурирующих агентов и т.д.) будут значительно отличаться от условий, которые являются для него естественными. Образование амилоидов такими белками может представлять лишь фундаментальный научный интерес (Bouchard et al, 2000; Chow et al., 2004; Soldi et al., 2005).
Первоначально, амилоиды привлекли внимание исследователей из-за того, что с их образованием ассоциированы болезни человека и животных, включая болезни Альцгеймера и Паркинсона, диабет второго типа, старческий амилоидоз и трансмиссивные губчатые энцефалопатии, в том числе коровье бешенство и скрэппи овец. На данный момент таких болезней насчитывается более 25 (Westermark et al., 2007). Долгое время бытовало мнение, что амилоидная структура — прискорбная ошибка природы. Однако в течение последнего десятилетия было показано, что целый ряд белков выполняет свою функцию in vivo в амилоидной форме. Примерами могут служить белки адгезивной бахромки (фимбрий) грамотрицательных бактерий Escherichia coli курлины (Chapman et al., 2002), поверхностные амилоиды чаплины грамположительных бактерий Streptomyces coelicolor (Claessen et al., 2003), белок меланосом человека Pmell7 (Fowler et al., 2006) и ряд других. Причиной распространенности в природе амилоидов являются уникальные свойства, которыми обладают фибриллы с кросс-Р-структурой. Амилоидные фибриллы чрезвычайно устойчивы к внешним воздействиям, что обусловлено большим числом взаимодействий, вовлеченных в стабилизацию структуры. В них принимают участие как основные цепи полипептидов, так и их боковые группы. Важную роль при формировании кора амилоидных фибрилл играет образование водородных связей вдоль всего Р-листа, а также полностью обезвоженного пространства между прилегающими Р-листами за счет формирования т.н. "стерической застежки": боковые группы полипептидов из одного Р-листа укладываются в пространство между боковыми группами другого (рис. 1 Б) (Sawaya et al., 2007). Функциональные групп краевых Р-тяжей в каждый момент времени формируют лишь часть потенциально возможных водородных связей, что весьма энергетически не выгодно. Это обуславливает неотъемлемое свойство амилоидных фибрилл - их чрезвычайно высокую склонность к р-агрегации. Центрами полимеризации являются концы амилоидных фибрилл. Сегментов длиной 4-7 аминокислотных остатков достаточно для формирования фибриллы, по крайней мере, в случае десятка ассоциированных с болезнями белков (Sawaya et al., 2007; Ivanova et al., 2004; Fandrich et al., 2003; Jones et al., 2003; Reches et al., 2002; von Bergen et al., 2001; 2000; Krebs et al., 2000; Tenidis et al., 2000; Reches and Gazit, 2004). В фибриллах, сформированных из больших полноразмерных белков, лежащие вне кора области мономеров белка могут сохранять неамилоидную (глобулярную) конформацию (Ваха et al., 2003; Sambashivan et al., 2005). Ряду исследователей удалось получить слитые белки, в состав которых входили полноразмерные функционально активные полипептиды (барназа, карбоангидраза, глутатион S-трансфераза, зеленый флуоресцентный белок и цитохром bsei) и амилоидогенные области (Ваха et al., 2002; Baldwin et al., 2006). Было установлено, что полученные белки не теряли своей активности, а также приобретали способность формировать амилоидные фибриллы. Наличие активности свидетельствует о том, что только амилоидогенная последовательность была вовлечена в формирование амилоида. Следовательно, формирование амилоидной фибриллы в некоторых случаях может не нарушать функцию белка.
Процесс формирования амилоидных фибрилл, по всей видимости, начинается с экспонирования участка, способного формировать "стерическую застежку", который расположен в склонной к амилоидообразованию области. Данный процесс должен затронуть несколько идентичных белковых молекул, что позволит им сформировать р-слои, а этим слоям - установить взаимодействия между собой. Привлечение мономеров в предварительно сформированную фибриллу, вероятно, значительно более быстрый процесс, чем нуклеация (образование "затравки"), т.к. для этого необходимо, чтобы всего лишь одна молекула экспонировала свой амилоидогенную последовательность (Sawaya et al., 2007). Указанная закономерность хорошо соотносится с кинетикой образования амилоидов, а именно с медленной нуклеацией и быстрым ростом фибрилл (Harper et al., 1997).
Образование амилоидной фибриллы происходит в несколько этапов. Согласно модели, имеющей экспериментальные подтверждения, сначала образуются маленькие растворимые олигомеры, которые затем собираются в сферические высшие олигомерные интермедиаты (ВОИ) (рис. 2) (Kumar and Udgaonkar, 2009). Далее ВОИ ассоциируются с образованием протофибрилл, которые трансформируются в фибриллы. Такой механизм, по-видимому, является общим для образования амилоидных протофибрилл и фибрилл (Serio et al., 2000; Xu et al., 2001; Modler et al, 2003; Hurshman et al., 2004; Carrotta et al, 2005). Стадия, на которой происходит обогащение структуры р-слоями, может варьировать. Обогащение может происходить на этапе ВОИ, что приведет к образованию фибриллярных олигомеров, либо на стадии удлиненных протофибрилл, при этом образуются префибриллярные олигомеры (Hamley, 2007; Kumar and Udgaonkar, 2009). В результате зрелые амилоидные фибриллы будут иметь различающиеся морфологии. С этим связывают свойство, присущее амилоидным фибриллам — их гетерогенность (Kumar and Udgaonkar, 2009).
Цитотоксичные белки, формирующие амилоиды
Существуют методики детекции амилоидов, используемые на протяжении долгого времени благодаря своей экспериментальной простоте и удовлетворительной надежности. Эти методики основаны на использовании амилоид-специфичных красителей. В первую очередь необходимо упомянуть окрашивание КК, т.к. для патологов по определению "амилоид - это материал, образующий отложения in vivo, который можно отличить от неамилоидных отложений по характеристическому внешнему виду с помощью , электронной микроскопии, типичной картине дифракции рентгеновских лучей и гистологическому окрашиванию, в частности, афинности к КК, приводящей к f возникновения., зеленого двулучепреломления (Westermark et al., 2007). КК был синтезирован в 1884 году немецким химиком Полом Бетигером (Bottiger, Paul. Deutsches Reichs Patent 28753, August 20, 1884). В качестве гистологического красителя КК был i применен в 1927 бельгийским нейропатологом Полем Диври, который изучал дегенеративные изменения в тканях стареющего мозга, наблюдаемые в поляризовнном свете (Divry, 1927; Steensma, 2001). С тех пор и до наших дней КК является основным детектором амилоидных изменений в тканях (Frid et al., 2007). Конго красный (C32H22N606S2 2Na, Mw-696.7), чье химическое название 3,3 -[(1,Г-бифенил)-4,4 диилбис(азо)] бис-(4-амино-1-нафталиновая кислота) динатриевая соль, является ) симметричной линейной молекулой (рис. 3) (Frid et al., 2007). Гидрофобный центр составляют два фенильных кольца, соединенных через диазо-связь с двумя заряженными нафталиновыми кольцами. Эти терминальные части КК содержат группы сульфоновой кислоты и аминогруппы. Длина молекулы составляет приблизительно 21 A (Romhanyi, 1971). При взаимодействии с амилоидными фибриллами, в спектре поглощения молекулы наблюдается сдвиг пика с 490 на 540 нм. Кроме того, наблюдается зеленое двулучепреломелние в поляризованном свете и индукция кругового дихроизма в области 300 - 600 нм (Klunk et al., 1999; Khurana et al., 2001). Механизм взаимодействия КК с амилоидными фибриллами до конца не изучен. Считается, что связывание КК зависит от вторичной структуры фибрилл, представляющей собой кросс-Р-структуру (DeLellis et al., 1968; Glenner et al., 1972; Klunk et al., 1989). Связывание КК может происходить как за счет гидрофобных взаимодействий би-бензидинового центра, так и за счет электростатических взаимодействий терминальных заряженных групп. Вероятно, отрицательно заряженные группы взаимодействуют с положительно заряженными аминокислотными остатками (3-тяжей. Характеристическое расстояние между Р-тяжами в амилоидах составляет 4.75 А, соответственно тяжи пи п+4 разделяют примерно 19 А, что близко к расстоянию между сульфоновыми группами КК, которое составляет 19.3 А (Klunk et al., 1989; Klunk et al., 1995) (рис. 3). Согласно предложенной модели, молекулы КК укладываются параллельно оси амилоидной фибриллы перпендикулярно р-тяжам (Romhanyi, 1971; Klunk et al., 1989; Jin et al., 2003). Параллельная ориентация КК и физические ограничения, накладываемые взаимодействием с полипептидными цепями, объясняют возникновение двулучепреломления, т.е. расщепления луча света на два (Romhanyi, 1971; Krebs et al., 2005). Согласно другой модели, молекулы КК укладываются параллельно полипептидным цепям, перпендикулярно оси фибриллы (Carter and Chou, 1998) в каналы, сформированные боковыми цепями соседних тяжей, ширина которых оценивается в 6.5-6.95 A (Salemme, 1983), что позволяет молекуле КК в них внедриться (Cooper, 1974). Таким образом, интеркаляция КК между р-тяжами может быть альтернативным путем взаимодействия КК с амилоидами (Turnell and Finch, 1992). Долгое время считалось, что КК взаимодействует исключительно с амилоидами. Однако, ряд недавних исследований показал, что КК способен формировать комплексы с белками, обладающими разнообразной вторичной структурой. КК связывается с нативными белками, такими как IL-2, апомиоглобин и полилизин, гормон роста человека, обладающими а-структурой (Khurana et al., 2001; Sereikaite and Bumelis, 2006), и малат дегидрогеназой, обладающей а- и Р-структурами (Glenner et al., 1972; Khurana et al., 2001). Предполагается, что связывание КК с такими белками осуществляется через повороты а-структуры, которые разделяет расстояние приблизительно 5 А, что близко к расстоянию между тяжами в амилоидах. Физическая природа цвета, наблюдаемого в поляризованном свете при взаимодействии КК с амилоидами ("зеленое двулучепреломление") объясняется аномальной дисперсией показателя преломления (Howie et al., 2008). Помимо указанных методик, существуют тесты на формирование внеклеточных амилоидов микроорганизмами, такими как Е. coli, основанные на афинности КК к амилоидам. В этих методах содержащие КК твердые среды используются для выращивания колоний микроорганизмов, которые окрашиваются в красный цвет если микроорганизм формирует внеклеточные амилоиды (Collinson et al., 1993; Hammar et al., 1995; Castonguay et al., 2006; Larsen et al., 2007).
Химическая структура Конго красного. Диаметр молекулы оценивается в 21 А. Структура молекулы может рассматриваться как две терминальные группы, соединенные через азо-связи с центральной частью. Адаптировано из Frid et al., 2007.
Другим широко используемым амилоид-специфичным красителем является Тиофлавин Т (ТТ). ТТ (C17H19CIN2S, Mw-318.9), чье химическое название 4-(3,б-диметил-1,3-бензотиазол-3-иум-2-ил)-М,г [-диметиланилин хлорид (производное бензотиазола) (рис. 4) (LeVine, 1999). Изначально ТТ использовался в качестве гистохимического красителя для окраски амилоидных отложений в тканях (Vassar and Culling, 1959; Kelenyi, 1967), позже стал применяться для оценки количества амилоидных фибрилл in vitro в присутствии белков-предшественников, находящихся в неамилоидной конформации, и аморфных агрегатов (LeVine, 1993; LeVine, 1999). В присутствии амилоидов в спектре поглощения ТТ появляется дополнительный пик при 450 нм, ТТ начинает интенсивно флуоресцировать, максимум флуоресценции находится при 480 - 490 нм (Hawe et al., 2007).
Молекула ТТ состоит из пары бензотиазольного и бензаминового колец, свободно вращающихся вокруг С-С связи. Было сделано предположение, что в свободной молекуле ТТ вращательная безызлучательная релаксация снижает квантовый выход флуоресценции (Stsiapura et al., 2007). В связанной с фибриллой форме ТТ вращение затруднено, что приводит к возрастанию квантового выхода флуоресценции. Согласно другому предположению, возрастание квантового выхода флуоресценции ТТ связано с образованием возбужденного димера (эксимера) (Groenning et al., 2007а; Raj and Ramaraj, 2001). Полемику вызывают также локализация сайтов связывания ТТ и вид, в котором ТТ формирует комплекс с амилоидами. Ряд групп предложили механизмы этих взаимодействий (Groenning et al., 2007а; Khurana et al., 2005; Krebs et al., 2005). Кребс с соавторами предположили, что ТТ может связываться вдоль длинной оси фибриллы в "каналах", формируемых боковыми группами остатков п и п+2 р-тяжей в кросс-Р-структуре амилоидов (Krebs et al., 2005). Эта модель привлекательна своей простотой и тем, что объясняет наблюдение, что ТТ не препятствует полимеризации амилоидов в отличие от КК, который может связываться между мономерами. Также эта модель находится в соответствии с тем, что связывание ТТ мало зависит от первичной структуры полипептида. Хурана с соавторами предположили, что ТТ связывается с амилоидными фибриллами в виде мицелл диаметром примерно 3 нм (Khurana et al., 2005). Грэйнинг с соавторами предположили, что возрастание флуоресценции ТТ происходит из-за связывания ТТ с амилоидом в виде эксимера, которое может происходить в центральной поре фибриллы или вдоль фибриллы, как предположили Кребс с соавторами (Groenning et al., 2007а). Наконец, теми же авторами предложена альтернативная модель, согласно которой связывание может происходить между протофиламентами, составляющими зрелую фибриллу (Groenning et al., 2007b). Эти исследования не согласуются между собой ни в том, в каком виде ТТ связывается с амилоидами (мономер, димер или мицелла), ни в. том, в где происходит это связывание (центральная пора, латеральные каналы либо-интерфейс между протофибриллами), ни в том, чем обусловлено возрастание квантового выхода флуоресценции (формирование эксимера, снижение уровня вращательной релаксации). Эти противоречивые данные иллюстрируют факт, что дополнительные исследования- необходимы- для того, чтобы лучше понять каким образом происходит взаимодействие ТТ с амилоидами. Не смотря на широкое применение ТТ в качестве амилоид-специфичного красителя, очень мало работ посвящено изучению физико-химических основ данного взаимодействия. Одной из последних является работа Сабатэ с соавторами, в которой было установлено, что взаимодействие ТТ/амилоид происходит при концентрациях ниже критической концентрации мицеллообразования, при этом ТТ принимает скрученную конформацию, что свидетельствует о закрученной конформации амилоидов (Sabate et al., 2008). Этот факт согласуется с множеством экспериментальных данных (Aggeli et al., 2001; Jimenez et al., 2002; Nyrkova et al, 2000; Sabate et al., 2007) и хорошо объясняется в рамках модели, предложенной Кребс с соавторами (Krebs et al., 2005). Следует отметить, что стехиометрия связывания ТТ с амилоидными фибриллами свидетельствует о том, что лишь часть гидрофобных каналов, расположенных вдоль фибриллы (Krebs et al., 2005), доступна для связывания ТТ, что обусловлено электростатическим отталкиванием положительно заряженной молекулы ТТ с боковыми цепями основных аминокислот (лизина, аргинина и гистидина). Необходимо отметить, что ТТ связывается не только с амилоидами: его флуоресценция может быть индуцирована в присутствии не содержащих Р-слоев полостей, присутствием которых характеризуются ацетилхолинэстераза и у-циклодекстрин, в то время как не все амилоиды индуцируют флуоресценцию ТТ, как например транстиретин (Groenning et al., 2007а). Во всех случаях исследования, основанные на применении амилоид-специфичных красителей, должны быть сопряжены с использованием других физико-химических методов.
Электрофорез в денатурирующих условиях
Фенотип [PSI+] является результатом формирования амилоида белком Sup35p (eRF3), который в норме является фактором терминации трансляции. При этом количество свободного функционального белка уменьшается, что вызывает проскакивание стоп-кодонов и удлинение С-конца белков, ведущее к возникновению нового фенотипа за счет изменения белкового состава клетки (True and Lindquist, 2000). Фенотип [URE3] возникает из-за перехода в амилоидное состояние белка Ure2p, который в норме регулирует метаболизм азота (обзоры Shkundina and Ter-Avanesyan, 2006; Tuite and Lindquist, 1996; Wickner et al., 2000; Галкин с соавт., 2006). В растворимой форме Ure2p репрессирует транскрипционный фактор Gln3p, который контролирует экспрессию транспортера уреидосукцината и аллантоата Dal5p (Chien et al., 2004). Dal5p в обычных условиях экспрессируется только когда доступны хорошие источники азота, однако когда Ure2p агрегирован, Gln3p становится конститутивно активным и количество Dal5p возрастает. Агрегация как Ure2p, так и Sup35p приводит к формированию фенотипа, связанного с потерей белками функции, т.к. белки не могут связываться со своими функциональными партнерами в агрегированном состоянии. В случае другого фенотипа, [PIN+], формирующегося в результате образования амилоида белком Rnqlp (Derkatch et al., 2001; Osherovich and Weissman, 2001), функция растворимой формы белка не установлена. [PIN+] был выявлен как фактор, необходимый для возникновения фенотипа [PSI+] в клетках с сверхпродукцией Sup35p (Derkatch et al., 2000). Индукция [URE3] происходит более эффективно в присутствии [PIN+]. В отличие от индукции, наследование фенотипов [PSI+] и [URE3] не зависит от присутствия [PIN+].
Некоторые другие цитоплазматически наследуемые дрожжевые фенотипы, такие как [KIL-d] и [ISP+] в S. cerevisiae и [cif] в Schizosaccharomyces pombe, возможно, основаны на формировании амилоидных прионов. Цитоплазматически наследуемый детерминант [KIL-d] участвует в эпигенетическом контроле экспрессии генов (Talloczy et al., 2000). [ISP+] был обнаружен в дрожжах S. cerevisiae, несущих две супрессорные мутации гена SUP35 (Volkov et al., 2002). Он действует как антисупрессор этих мутаций, [cif] обеспечивает жизнеспособность клеток S. pombe в отсутствие кальнексина (Cnxlp), жизненно важного шаперона цитоплазматического ретикулума (Collin et al., 2004). В настоящее время ведется поиск белков, агрегация которых вызывает указанные фенотипы.
Все три хорошо охарактеризованные прионные белка S. cerevisiae (Sup35p, Ure2p и Rnqlp) имеют в своем составе Asn/Gln богатые последовательности. В геноме данного организма обнаруживается 107 открытых рамок считывания (примерно 1.7 % от всех открытых рамок считывания), кодирующих Asn/Gln богатые области (Michelitsch and Weissman, 2000). Аналогичная картина наблюдается и для других организмов. Возможно, это свидетельствует о широком распространении амилоидных прионов в природе.
Прион [Het-s] регулирует гетерокарионную несовместимость и функционирует как направляющий мейоз элемент в P. anserina (Coustou et al., 1997; Dalstra et al., 2005). Когда гифы из соседних колоний встречаются, они могут сливаться и образовывать многоядерные клетки, называемые гетерокарионами, которые важны для спаривания и вегетативного роста. Локус het-s имеет два аллеля - het-s and het-S. Белок HET-s существует либо в растворимой, либо в амилоидной форме, в то время как HET-S — только, в растворимой. Когда гифы, содержащие агрегированный HET-s, сливаются с гифами, содержащими HET-S, происходит реакция гетерокарионной несовместимости, которая убивает гетерокарион и создает барьер между двумя колониями, предотвращающий последующее слияние. Возможно, смерть гетерокариона могут вызывать токсичные олигомеры. Слияние может происходить между генетически идентичными колониями (HET-S-HET-S или HET-s-HET-s), а также между теми, в которых HET-s находится в растворимой форме, и синтезирующими HET-S.
Прионный домен Sup35p подвергается положительной селекции и. является консервативным для многих Saccharomyces spp. (Jensen et al., 2001). К тому же, популяции дрожжей, несущие агрегировнный Sup35p, имеют селективные преимущества при определенных условиях выращивания (Uptain and Lindquist, 2002; True et al., 2004; True and Lindquist, 2000). Более того, эти временные преимущества, обеспечиваемые прочтением стоп-кодонов, могут быть закреплены генетически (True et al., 2004). Селективные преимущества при определенных условиях обеспечивает и [URE3] (Uptain and Lindquist, 2002). Прион [Het-s] обеспечивает гетерокарионную несовместимоть, которая, как полагают, ограничивает распространение вирусных инфекций за счет предотвращения слияния различающихся колоний. Агрегированный HET-s найден в диких штаммах (Dalstra et al., 2003), что может свидетельствовать о важности функции данного приона, однако существует вероятность, что организмы, не несущие агрегированного HET-s, просто умирают в результате реакции гетерокарионной несовместимости. Недавние исследования показали, что ни фенотип [URE3], ни [PSI+] не встречается в 70 диких штаммах S. cerevisiae (Nakayashiki et al., 2005) и что Ure2p консервативен лишь для некоторых Saccharomyces spp. (Baudin-Baillieu et al., 2003; Talarek et al., 2005). Вопрос, являются ли прионы полезными для дрожжей, остается открытым. В высших эукариотах были выявлены несколько белков, возможно являющихся амилоидными прионными. Ряд свойств амилоидного приона был продемонстрирован для нейрон-специфичной изоформы белка СРЕВ (cytoplasmic pplyadenylation element binding protein — белок, связывающий цитоплазматический элемент полиаденилирования) из морского моллюска Aplysia californica (Si et al., 2003a). N-концевой домен данного белка гомологичен прионным доменам дрожжей. Он был слит с репортерным белком (глюкокортикоидным рецептором) и экспрессирован в дрожжевой модели. Слитый белок был способен существовать в двух функционально различных состояниях, которые наследовались и переходили друг в друга с низкой частотой эпигенетическим образом, а также данный белок был устойчив к воздействию протеиназы К (Si et al., 2003а). Полноразмерный СРЕВ также продемонстрировал свойства амилоидного приона, в частности он был способен формировать агрегаты в клетках дрожжей, фибриллярные агрегаты in vitro (Si et al., 2003a). Было показано, что СРЕВ проявляет свою активность, а именно связывает РНК, содержащие цитоплазматический элемент полиаденилирования, в агрегированном состоянии, и не проявляет, когда он получен рекомбинантно в Е. coli или в бесклеточной системе трансляции в растворимом виде (Si et al., 2003а). Однако не было представлено данных, свидетельствующих о присутствии СРЕВ в прионном состоянии в A. californica. СРЕВ был впервые обнаружен в ооцитах лягушек рода Xenopus как регулятор трансляции, который активирует "спящие" мРНК, удлиняя их поли(А) хвосты (Hake and Richter, 1994). СРЕВ является не только активатором, но и, в некоторых случаях, репрессором (deMoor and Richter, 1999). Переключение между этими функциями в норме контролируется фосфорилированием (Mendez et al., 2002). Однако, нейрональная изоформа Aplysia СРЕВ лишена этих сайтов фосфорилирования. Вместо этого при синаптической стимуляции серотонином возрастает количество белка СРЕВ- (Si et al., 2003b). В Aplysia нейрональная изоформа СРЕВ обычно вовлечена в поддержание долговременного синаптического возбуждения (Si et al., 2003b). Если прионные свойства присущи СРЕВ в нейронах Aplysia, то можно предположить основанный на этих свойствах механизм поддержания локального изменения скорости трансляции в отдельных нейронах, с помощью которого СРЕВ способствует установлению долговременного самоподдерживающегося синапс-специфичного пластического изменения, участвую в формировании памяти.
Экспериментальное выявление белков КС, обладающих свойствами амилоидов
Бактериальные амилоиды тесно ассоциированы с болезнями человека и животных. Недавние работы обнаружили связь амилоидов и гемостаза (остановки кровотечения) человека. Система гемостаза человека регулирует образование сгустков крови и их растворение с помощью серии протеолитических каскадов. При активации фактор XII инициирует протелитический каскад который, в итоге, приводит к превращению фибриногена в фибрин. Фибрин затем полимеризуется и формирует основную часть сгустка крови (Gebbink et al., 2005). Как выяснилось, фактор XII может быть активирован различными амилоидами in vitro (Shibayama et al., 1999). Вторичная структура фибрина обогащена р-листами (Bramanti et al., 1997). При определенных обстоятельствах фибрин окрашивается КК (Kranenburg et al., 2002). Более того, пептиды, входящие в состав молекулы фибрина, формируют амилоиды (Kranenburg et al., 2002). Таким образом, сгустки крови состоящие из агрегированного фибрина, вероятно, содержат кросс-Р-структуру и могут формироваться преимущественно из амилоида. Полимеризованный фибрин деградируется протеазой плазмин, которая образуется из плазминогена с-помощьюі тканевого активатора плазминогена (tissueype plasminogen activator - tPA). И tPA, и плазминоген входят в состав фибриновых сгустков, что повышает их эффективную концентрацию и приводит к образованию плазмина. Амилоидные фибриллы, полученные из различных источников, включая фибриновые пептиды, могут активировать плазмин, (Kranenburg et al., 2002). Таким образом, мотив кросс-Р-структура, по всей видимости, важен для активации фактора XII и tPA. Амилоиды могут представлять собой ключевой регуляторный элемент в механизмах коагуляции» и растворении сгустков крови. Интересно отметить, что микробы, похоже, эксплуатируют основанные на амилоидах компоненты гемостатической системы для увеличения вирулентности. Е. coli и Salmonella spp., генерирующие амилоиды, имеют преимущество при колонизации и инвазии тканей (Gebbink et al., 2005; Uhlich et al., 2002). Формирование амилоидных фибрилл курлей в Е. coli обеспечивает способность связываться с tPA и генерировать плазмин (Gebbink et al., 2005). Плазмин является неспецифичной протеазой и может гидролизовать компоненты внеклеточного матрикса, включая ламинин и фибронектин помимо фибрина. Опосредованная амилоидами активация плазмина, согласно гипотезе, усиливает бактериальную инвазию клеток и вирулентность посредством разрушения внеклеточного матрикса (Gebbink et al., 2005). Эти данные свидетельствуют о том, что гемостаз, амилоиды и микробный патогенез тесно связаны между собой и демонстрируют взаимодействие между амилоидами эукариот и прокариот. Существующая гипотеза о том, что амилоидные мотивы вовлечены в формирование и разборку сгустков крови, иллюстрирует потенциальную физиологическую возможность и важность амилоидов в организме человека.
Как ранее упоминалось, курли, пили и другие амилоиды связаны со способностью бактерий присоединяться и инвазировать клетки человека, что вызывает разрушительные последствия для клеток хозяина, в то время как харпины вызывают апоптоз клеток растений, хотя последнее может рассматриваться как защитный механизм, с помощью которого растения препятствуют распространению инфекции на весь организм. Другие бактерии,- такие как Borrelia burgdorferi, индуцируют похожие на болезнь Альцгеймера1 симптомы в клетках млекопитающих (Miklossy et al., 2006). Механизм данного явления не ясен, но он может вызываться нуклеированием амилоидообразования, при этом агрегаты образуются вокруг клеток спирохет (MacDonald-et al., 2006). Не известно, формируют ли Borrelia амилоиды сами. Однако в других случаях возможно, что бактериальные амилоиды играют роль в- индукции болезни: Nocardia otitidiscaviarumcan индуцирует симптомы болезни Паркинсона в мозге (Diaz-Gorrales et al., 2004). Броксмейер предложил гипотезу, согласно которой Mycolata {Nocardia и Mycobacterium) могут индуцировать амилоидоз (Broxmeyer, 2002), т.к. их присутствие в организме человека часто коррелирует с болезнью Паркинсона. Как было1 отмечено, все эти бактерии формируют амилоиды, которые потенциально способны служить затравкой для формирования амилоида в мозге. Однако прямых доказательств, что амилоидные фибриллы могут служить затравкой для дальнейшего амиоидообразования (механизм "кросс-сидинг"), пока не представлено. Если это действительно так, то амилоид-продуцирующие микроорганизмы могут служить потенциальным источником угрозы здоровью человека, как при инфекции, так и в качестве факторов окружающей среды. Таким образом, формирующие амилоиды микроорганизмы являются источником амилоидов, которые могут служить затравкой формирования амилоидов в организме человека.
