Содержание к диссертации
Введение
Часть 1. Обзор литературы 9
Глава 1. Неорганические полифосфаты в энергетическом метаболизме прокариот. 11
1.1. Ферменты, вовлекающие неорганические полифосфаты в превращение нуклеозидфосфатов. 12
1.1.1. Полифосфаткиназа (полифосфат:АОР фосфотрансфераза, КФ 2.7.4.1). 12
1.1.2. Полифосфат:АМР-фосфотрансфераза. 17
1.1.3. Участие неорганических полифосфатов в фосфорилировании NAD+. 20
1.2. Реакции трансфосфорилирования, в которых неорганические полифосфаты заменяют АТР. 21
1.2.1. Участие неорганических полифосфатов в фосфорилировании глюкозы и других Сахаров . 21
1.2.2. 1,3-дифосфоглицерат : полифосфат-фосфотрансфераза (КФ 2.7.4.17). 25
1.2.3. Участие неорганических полифосфатов в фосфорилировании белков. 25
1.3. Запасание энергии неорганических полифосфатов в виде Дц.Н+. 25
Глава 2. Неорганические полифосфаты в энергетическом метаболизме зукариот . 26
Глава 3. Неорганические полифосфаты в митохондриях дрожжей. 31
Часть 2. Материалы и методы исследования. 36
2.1. Объекты исследования. 36
2.2. Состав среды и условия культивирования. 36
2.3. Получение сферопластов из дрожжевых клеток. 37
2.4. Условия гиперкомпенсации. 38
2.5. Получение фракции цитозоля. 39
2.6. Выделение митохондрий. 39
2.7. Очистка препарата митохондрий. 41
2.8. Определение поглощения кислорода митохондриями дрожжей Saccharomyces cerevisiae. 41
2.9. Получение растворимой фракции митохондрий и фракции митохондриальных мембран. 41
2.10. Получение фракций содержимого межмембранного пространства митохондрий и митопластов. 42
2.11. Определение полифосфаткиназой активности в изолированных митохондриях Saccharomyces cerevisiae. 43
2.12. Инкубация изолированных митохондрий Saccharomyces cerevisiae 43
2.13. Определение молекулярных масс экзополифосфатаз. 44
2.14. Экстракция неорганических полифосфатов. 44
2.15. Осаждение неорганических полифосфатов в виде нерастворимых солей бария. 45
2.16. Хроматография неорганических полифосфатов на бумаге. 46
2.17. Электрофорез неорганических полифосфатов в ПААГ. 46
2.18. Очистка неорганических полифосфатов от примесей ортофосфата и пирофосфата, 47
2.19. Определение ферментативных активностей. 47
2.20. Аналитические методы, 49
2.20.1. Определение ортофосфата. 49
2.20.2. Определение пирофосфата, 49
2.20.3. Определение белка. 50
2.20.4. Определение глюкозы. 50
Часть 3. Результаты исследования и их обсуждение 52
3.1. Обнаружение неорганических полифосфатов в препарате изолированных митохондрий Saccharomyces cerevisiae. 52
3.2. Экзополифосфатаза растворимой фракции митохондрий Saccharomyces cerevisiae в условиях гиперкомпенсации. 57
3.3. Сравнение влияния недостатка и избытка РІ в среде на содержание неорганических полифосфатов в сферопластах и митохондриях Saccharomyces cerevisiae. 58
3.3.1. Влияние недостатка и избытка Р; в среде на содержание неорганических полифосфатов в сферопластах Saccharomyces cerevisiae . 58
3.3.2. Влияние недостатка и избытка РІ в среде на содержание и длину цепи неорганических полифосфатов в митохондриях Saccharomyces cerevisiae. 61
3.3.3, Влияние недостатка и избытка РІ в среде на активность экзополифосфатаз митохондрий Saccharomyces cerevisiae. 66
3.4. Определение локализации неорганических полифосфатов в митохондриях Saccharomyces cerevisiae. 67
3.5. Определение полифосфаткиназной активности в изолированных митохондриях Saccharomyces cerevisiae. 69
3.6. Действие ингибиторов энергетического обмена на накопление неорганических полифосфатов в митохондриях и сферопластах, а также на активности экзополифосфатаз митохондрий Saccharomyces cerevisiae . 72
3.7. Влияние источника углерода на содержание и длину цепи неорганических полифосфатов, а также на активность экзополифосфатаз митохондрийSaccharomyces cerevisiae. 76
3.8. Влияние инактивации генаррг/, кодирующего экзополифосфатазу и renapprtJ, кодирующего эндополифосфатазу, на обмен неорганических полифосфатов в митохондриях Saccharomyces cerevisiae. 83
3.8.1. Инактивация гена эндополифосфатазы/рт/ приводит к неспособности клеток Saccharomyces cerevisiae использовать несбраживаемые субстраты. 83
3.8.2. Влияние инактивации геновppxl uppnl на активность экзополифосфатаз митохондрий Saccharomyces cerevisiae. 86
3.8.3. Растворимая экзополифосфатаза митохондрий Saccharomyces cerevisiae кодируется геном ppxl. 88
3.8.4. Влияние инактивации гена ррпі на содержание и длину цепи неорганических полифосфатов в митохондриях Saccharomyces cerevisiae. 89
Заключение 92
Выводы 9^
Список литературы 99
- Участие неорганических полифосфатов в фосфорилировании глюкозы и других Сахаров
- Неорганические полифосфаты в энергетическом метаболизме зукариот
- Влияние недостатка и избытка Р; в среде на содержание неорганических полифосфатов в сферопластах Saccharomyces cerevisiae
- Действие ингибиторов энергетического обмена на накопление неорганических полифосфатов в митохондриях и сферопластах, а также на активности экзополифосфатаз митохондрий Saccharomyces cerevisiae
Введение к работе
Актуальность проблемы. Неорганические полифосфаты (полиР), представляющие собой линейные полимеры ортофосфата (Pi), выполняют в клетке многочисленные функции. Они участвуют в резервировании фосфата, связывании катионов, образовании мембранных каналов, в регуляции активности ферментов и экспрессии генов. Так, у бактерий полиР вовлечены в регуляцию синтеза о38-субъединицы РНК полимеразы (Kusano and Ishihama, 1997), ответственной за транскрипцию более чем 50 генов, продукты которых обеспечивают устойчивость к голоданию и другим стрессовым условиям, а. также адаптацию в стационарной стадии роста. Было показано, что мутантные штаммы Escherichia coli, неспособные синтезировать полиР, были не жизнеспособными в стационарной стадии роста, имели высокую чувствительность к тепловому шоку, окислительному и осмотическому стрессу.
Функции полиР в клетках тесно связаны с энергетическим метаболизмом. У бактерий благодаря наличию таких ферментов, как полифосфаткиназа и полифосфат:АМР фосфотрансфераза эти полимеры вовлечены в регуляцию внутриклеточной концентрации АТР и других нуклеозидфосфатов, а полифосфатглюкокиназа и полифосфат:NADP фосфотрансфераза используют полиР вместо АТР в реакциях трансфосфорилирования. В эукариотических клетках указанные ферменты отсутствуют, и участие полиР в энергетическом метаболизме исследовано в значительно меньшей степени. Поскольку митохондрии имеют ключевое значение в энергетическом обмене эукариотических клеток, а также принимают участие в регуляторных процессах (Бакеева и др., 2001; Niemmen, 2003), то вопрос о присутствии и возможной роли полиР в этих органеллах является актуальным. В связи с этим особый интерес вызывает исследование метаболизма этих полимеров в митохондриях дрожжей, широко изучаемых и богатых полиР эукариотических микроорганизмов. Присутствие полиР в митохондриях дрожжей было показано лишь в одной работе с помощью метода 3,Р-ЯМР (Beauvott et al., 1989), и до настоящего времени остается неясным, какую роль они играют в этих органеллах. В митохондриях дрожжей Saccharomyces cerevisiae были обнаружены растворимая и мембраносвязанная экзополифосфатазы, катализирующие отщепление Рі от конца цепи полиР и различающиеся по ряду физико-химических свойств (Lichko et зі, 1998). Это говорит в пользу участия митохондрий в метаболизме данных соединений. Актуальность изучения обмена полиР в митохондриях дрожжей определяется важностью понимания функций этих биополимеров как в митохондриях, так и в эукариотической клетке в целом.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение влияния условий культивирования и мутаций по важнейшим генам полифосфатного метаболизма на обмен полиР в митохондриях дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
Были поставлены следующие задачи:
1) Провести обнаружение полиР в митохондриях дрожжей S. cerevisiae различными методами и определить их локализацию в этих органеллах.
2) Определить влияние недостатка и избытка Pt в среде культивирования на содержание и длину цепи полиР, а также на активность экзополифосфатаз в митохондриях.
3) Изучить влияние ингибиторов энергетического обмена на накопление полиР в митохондриях дрожжей S. cerevisiae.
4) Сравнить содержание полиР в митохондриях при выращивании дрожжей S. cerevisiae на глюкозе и лактате.
Определить влияние мутаций но генам полифосфатного обмена: гена ppxl, кодирующего 40 кДа - экзополифосфатазу и гена ppnl, кодирующего эндополифосфатазу, на содержание полифосфатов и активность экзополифосфатаз в митохондриях.
Определить влияние вышеуказанных мутаций на функциональное состояние митохондрий.
Научная новизна работы. В данной работе с помощью хорошо известных методов исследования полиР: химической экстракции, осаждения солями бария, хроматографии и
7 электрофореза - было достоверно показано, что митохондрии дрожжей S. cerevisiae содержат неорганические полиР.
В работе впервые было показано, что содержание полиР в митохондриях дрожжей в значительной степени зависит как от концентрации фосфата в среде культивирования, так и от; источника углерода. У дрожжей, выращенных на лактате, содержание полиР в митохондриях было значительно ниже, чем в случае использования в качестве источника углерода глюкозы.
Показано, что для митохондрий, также как и для целых клеток, характерно явление гиперкомпенсации - повышенного накопления полиР при переносе дрожжей с фосфат-лимитированной среды на полноценную по фосфату среду.
Показано, что в условиях гиперкомпенсации кислоторастворимые полиР митохондрий отличаются от кислоторастворимых полиР сферопластов по средней длине цепи и чувствительности к действию некоторых ингибиторов. Процесс накопления полиР в митохондриях в отличие от такового в сферопластах не подавляется 2-дезокси-0-глюкозой, но в большей степени блокируется нигерицином. Полученные данные по действию разобщителей и ионофоров на накопление полиР в митохондриях дрожжей S, cerevisiae, говорят в пользу того, что этот процесс зависит от электрохимического потенциала.
Установлено, что растворимая форма экзополифосфатазы митохондрий дрожжей S. cerevisiae кодируется геном ppxl, который кодирует экзополифосфатазу цитозоля.
Показано, что инактивация гена ppnl, который кодирует эндополифосфатазу, приводит к существенным изменениям в метаболизме полиР в митохондриях дрожжей и нарушениям функционального состояния этих органелл, что влечет за собой неспособность клеток использовать несбраживаемые источники углерода.
Научно-практическое значение. Настоящая работа относится к разряду фундаментальных исследований, однако полученные данные позволяют расширить наше представление о фосфорном метаболизме и значении неорганических полиР в клетках дрожжей, имеющих большое практическое значение и широко используемых в различных отраслях народного хозяйства.
Разработана методика изучения эффекта гиперкомпенсации полиР с использованием сферопластов вместо клеток, что позволяет свести к минимуму гидролиз полиР, который происходит в ходе получения сферопластов при выделении органелл и улучшить возможности для исследования метаболизма полиР в отдельных клеточных органеллах. Апробация работы. Результаты работы были доложены на ряде конференций: на 6ой и 8ой конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века» (Пущино, 2002, 2004), на 3-ем съезде Российского биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи.
Благодарности
Автор приносит искреннюю благодарность своим Л научным руководителям чл,-корреспонденту РАН Игорю Степановичу Кулаеву, д.б.н. Татьяне Валентиновне Кулаковской за постоянное внимание к работе и обсуждение её результатов. Автор благодорит к.б.н. Л.П. Личко, к.б.н. НА Андрееву, старшего лаборанта Н.Н. Косенкову, старшего лаборанта Е.В. Михайлину за оказанную помощь в работе, к.б.н. А.Г. Меденцева за помощь при измерении поглощения кислорода митохондриями дрожжей, лабораторию А Корнберга (Стенфордскии университет, США) за предоставление мутантных по генам полиР обмена штаммов S. cerevisiae, а также всех сотрудников отдела биохимии микроорганизмов РАН за содействие при выполнении работы и активное обсуждение результатов.
Участие неорганических полифосфатов в фосфорилировании глюкозы и других Сахаров
Для прокариот было показано, что неорганические полиР используются не только для фосфорилирования нуклеозиддифосфатов в соответствующие нуклеозидтрифосфаты, но также участвуют в реакциях фосфорилирования гексоз. Один из таких ферментов был обнаружен Шимоной у Mycobacterium phlei (Szymona, М., 1957; Szymona, М., and Szymona, О., 1961; Szymona, . M, et al., 1962; Szymona, M., 1964). Этот фермент катализирует фосфорилирование глюкозы, используя в качестве донора фосфата полиР или АТР (реакция 9).
Этот фермент был назван полифосфатглюкокиназой (полифосфат;В-глюкозо 6-фосфотрансфераза, КФ 2.7.1.63). Полифосфатглюкокиназа была также обнаружена у многих других микобактерий, а именно у М. stegmatalis, М. tuberculosis, М. friburgensis, М. scotochromogenus (Szymona,0., and Widomski, 1974; Szymona, M., et al., 1977; Szymona, O., and Szymona, M., 1978), а также у Nocardia minima (Szymona, 0., and Szymona, M, 1979), Corimbacterium diphtheriae (Szymona, M, and Szymona, O., 1961), Myxococcus coralloides (Gonzales et al., 1990), Bdellovibrio bacteriovorus (Bobyk et al., 1980), Propionibacterium shermanii (Clark and Wood, 1987; Clark, 1990), Streptomyces aureofaciens (Host&\ek et al., 1976) и у филогенетически древних прокариот, принадлежащих к классу Actinomicetales по классификации Н.А. Красильникова (Kulaev, 1979). Полифосфатглюкокиназную реакцию относят к так называемым "ископаемым реакциям", которые сохранились у бактерий, накапливающих значительное количество полиР в связи с большой зависимостью от меняющихся условий окружающей среды. Полифосфатглюкокиназа была очищена из Propionibacterium shermanii (Phillips et al., 1993; 1999) и Mycobacterium tuberculosis (Hsieh et al., 1993; Hsieh, 1996; Hsieh et al., 1996a; 1996b) и в настоящее время этот фермент активно изучается (Pepin and Wood, 1986; Pepin et al., 1986; Pepin and Wood, 1987; Phillips et al.; 1993; Phillips et al., 1999).
Фермент, очищенный из M phlei, фосфорилировал кроме глюкозы также глюкозамин и не действовал на маннозу и фруктозу. Скорость реакции фосфорилирования глюкозы этим ферментом была тем ниже, чем выше был молекулярный вес полиР, и зависела в первую очередь от концентрации конечных фосфатных групп. Использование полиР в ходе полифосфатглюкокиназной реакции идет ступенчато до конца цепи этих полимеров. В специальном исследовании (Szimona, М., and Ostrovswski, 1964), было установлено, что этот фермент расщепляет высокомолекулярные полиР до полиРз, который является конечным продуктом реакции. Однако недавно конечные продукты полифосфатглюкокиназной реакции были охарактеризованы более детально (Kowalczyk and Phillips, 1993), и ПреДСТаВЛЯЮТ СОбоЙ СМеСЬ ПОЛИР4 и полиРз Общим свойством полифосфатглюкокиназ, является их бифункциональность, которая заключается в том, что в высоко очищенных препаратах полифосфатглюкокиназы наблюдается АТР зависимая глюкокиназная активность. Причем соотношения полифосфатглюкокиназной и АТР зависимой активности у разных микроорганизмов отличаются (Szimona, М_, et al., 1977; Pepin and Wood, 1986; Kowalczyk et al„ 1996). При сравнении этих соотношений оказалось, что у филогенетически более древних микроорганизмов полифосфатглюкокиназная активность превышала АТР-глюкокиназную в несколько раз, тогда как у более молодых систематических групп наблюдалось обратное. У эукариот полифосфатглюкокиназная активность уже не наблюдается (Kulaev, 1979).
В ходе дальнейших исследований было показано, что полифосфатглюкокиназная и АТР глюкокиназная активность принадлежит одному белку (Hsieh et al., 1993; Phillips et al., 1993). Кроме того, в этих работах были представлены доказательства существования в этом ферменте двух отличных центров связывания для полиР и АТР, которые отличаются по своим каталитическим и регуляторним свойствам (Hsieh et al., 1993).
Поскольку полифосфатглюкокиназа способна использовать для фосфорилирования глюкозы как полиР, так и АТР, то нельзя было однозначно сказать, что этот фермент для фосфорилирования глюкозы in vivo использует полиР. В пользу того, что полир используются в процессе фосфорилирования глюкозы, говорит наблюдение сделанное Вудом и Кларком (Wood and Gark, 1988). В этой работе найдено, что при росте Propiombacterium shermcmii на среде содержащей в качестве источника углерода лактат происходило накопление длинноцепочечных полиР. При использовании глюкозы в качестве источника углерода накопления длинноцепочечных полиР не наблюдалось. Авторы предполагают, что присутствие полиР при росте на лактате объясняется отсутствием у этой бактерии субстрата фосфорилирования, тогда как при использовании глюкозы полиР исчезают в результате фосфорилирования глюкозы полифосфатглюкокиназой (Wood and Clark, 1988). В пользу того, что полифосфатглюкокиназа действительно может использовать для фосфорилирования глюкозы полиР в клетках, говорит обнаружение полифосфатглюкокиназы у Microlunatus phosphovorus, которая фосфорилирует глюкозу только за счет полиР (Tanaka et al., 2003). Для этого микроорганизма было показано, что при анаэробных условиях в ходе поглощения глюкозы и накопления гликогена происходит расходование полиР, накопленных при аэробных условиях роста (Nakamura et al., 1995).
Шимона и сотр. (Szymona,M., and Szumilo, 1966; Szymona, О. et al., 1969) показали, что в случае выращивания Mycobacterium phlei на среде содержащей фруктозу, маннозу или глюконат в клетках наблюдалось появление соответственно полифосфатфруктокиназы, полифосфатманнокиназы и полифосфатглюконаткиназы. При выращивании этого микроорганизма на среде содержащей глюкозу эти активности не обнаруживались. Следовательно, эти ферменты являются адаптивными. Совсем недавно группой исследователей (Mukai et al., 2003), был охарактеризован новый фермент полифосфатглюкоманнокиназа у Arthrubacter sp. штамм КМ. Этот фермент был способен фосфоршгировать глюкозу и маннозу, используя полиР или АТР. При этом сродство этого фермента к глюкозе было гораздо выше, чем к маннозе. Км этого фермента к глюкозе, маннозе, АТР и полиР составляли 0,50, 15, 0,20, 0,02 мМ соответственно. Этот фермент, так же как и полифосфатглкжокиназа имеет два центра связывания для полиР и АТР. Аминокислотная последовательность этого фермента проявляет гомологию с полифосфатглюкокиназой бактерий Mycobacterium tuberculosis H37Rv, а также АТР-зависимой глюкокиназой Corynebacterium glutamicum, Renibacterium salmoninarum и Bacillus subtilis.
Существует предположение, что на ранних стадиях эволюции, когда полиР имели более важное значение в биоэнергетике, чем АТР, возник фермент, осуществляющий фосфорилирование глюкозы за счет полиР, которые присутствуют в клетках филогенетически более древних микроорганизмов в значительном количестве. Затем по мере усиления роли АТР в клеточном метаболизме в этом ферменте развился новый активный центр для АТР и в процессе дальнейших мутационных изменений полиР-связывающий центр начал утрачивать активность и полностью исчез у эукариот (Phillips et al, 1999).
Неорганические полифосфаты в энергетическом метаболизме зукариот
Как указывалось в обзоре литературы, вопрос о наличии полиР в митохондриях дрожжей оставался к началу настоящей работы окончательно нерешенным, поскольку в препаратах митохондрий, выделенных из Neurospora crassa и Endomyces magnusii, полиР не были обнаружены (Афанасьева и др., 1968; Крашенинников, и др., 1968). И лишь в единственной работе с помощью метода 3!Р-ЯМР-спектроскопии в митохондриях дрожжей Saccharomyces cerevisiae были выявлены полиР со средней длиной цепи около 14 фосфатных остатков, количество которых составляло до 10% от общего количества полиР, определяемого этим методом (Beauvoit et al., 1989).
В связи с этим мы решили провести эксперименты по обнаружению полиР в препарате митохондрий дрожжей S. cerevisiae ВКМ Y 1173, используя для этого различные химические методы (Кулаев, 1975). В отличие от вышеуказанных работ (Афанасьева и др., 1968; Крашенинников и др., 1968), мы для получения препарата митохондрий использовали клетки дрожжей, которые были выращены в условиях, благоприятных для накопления в них полиР, а именно, в условиях гиперкомпенсации (Liss and Langen, 1959). Для достижения условий гиперкомпенсации по фосфату дрожжи S. cerevisiae, выращенные до стационарной стадии роста на фосфат-лимитированной среде Ридер с 2% глюкозой, переносили на свежую полноценную по фосфату среду, и культивировали в течение 18 часов (см. Материалы и методы исследования, раздел 2.4.).
Полученный препарат митохондрий не содержал неразрушенных сферопластов, что контролировали с помощью световой микроскопии. АТРазная активность препарата митохондрий в значительной степени подавлялась азидом, известным ингибитором FiF0 53 АТРаз (Pederson and Carafolli, 1987). Чистота полученного препарата митохондрий от примесей плазматических мембран была подтверждена отсутствием активности ванадат-чувствительной АТРазы, маркерного фермента плазматических мембран (Bowman et al., 1978, Rao, R., et al, 1992), а от примесей вакуолей - отсутствием активности нитрат-чувствительной АТРазы, маркерного фермента вакуолей (Churchill and Sze, 1983) (табл. 2).
АТРазная активность была выше при рН 8,5 по сравнению с рН 7,2, что согласуется с литературными данными об оптимуме рН АТРазы митохондрий (Pederson and Carafolli, 1987). Ранее в исследованиях, проведенных на митохондриях Neurospora crassa nEndomyces magtmsii (Афанасьева и др., 1968; Крашенинников и др., 1968) удавалось провести разделение препарата митохондрий путем дифференциального центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы на фракцию, содержащую лабильный фосфор, и фракцию, содержащую основную часть белка и цитохрома а. Из этого эксперимента авторы заключили, что присутствие лабильного фосфора в их препарате было обусловлено загрязнением волютиновыми гранулами. В связи с этим мы провели дополнительную очистку препарата митохондрий S. cerevisiae, в линейном градиенте сахарозы (0,6 - 1,5 М) (см. Материалы и методы исследования, раздел 2.7,), В отобранных после центрифугирования фракциях определяли содержание лабильного фосфора и активность АТРазы. В нашем случае оказалось, что пик лабильного фосфора совпадает с пиком АТРазнои активности (рис. 4). Это свидетельствует о том, что присутствующий в препарате митохондрий лабильный фосфор принадлежит этим органеллам.
Из препарата митохондрий провели химическую экстракцию фосфорных соединений согласно хорошо известному из литературы методу Лисса и Лангена в модификации Кунаева (Liss and Langen, 1959; Кулаев и др., 1960; Kulaev, 1979) и получили две фракции, содержащие лабильный фосфор: кислоторастворимую и солерастворимую. При получении щелочерастворимой фракции (экстракция NaOH, рН, 9-10), произошла полная солюбилизация митохондрий, и поэтому в дальнейшем эту фракцию больше не получали, (табл. 3). Поскольку 84% от общего количества лабильного фосфора, содержавшегося в митохондриях, приходилось на кислоторастворимую фракцию (табл. 3), то в последующих экспериментах основное внимание уделялось изучению именно этой фракции. Так как нуклеозидфосфаты из этой фракции были удалены сорбцией на активированный уголь, а количество пирофосфата составляло не более 1,5 % от общего количества лабильного фосфора, то, по всей видимости, основная часть лабильного фосфора этой фракции должна быть представлена полиР. Одним из простейших и наиболее распространенных способов обнаружения полиР является их осаждение с помощью солей бария, при различных значениях рН (Кулаев, 1975). Действительно, в ходе добавления к кислоторастворимой фракции митохондрий насыщенного раствора нитрата бария при рН 4,5 выпал хлопьевидный осадок. При последующем перерастворении этого осадка в пробах был обнаружен лабильный фосфор. Для более точной идентификации полиР были использованы методы хроматографии и электрофореза. При хроматографии препарата перерастворенного осадка были обнаружены фосфорные соединения в зоне, характерной для полиР (рис. 5).
Влияние недостатка и избытка Р; в среде на содержание неорганических полифосфатов в сферопластах Saccharomyces cerevisiae
Содержание полиР в клетках и отдельных клеточных компартментах у дрожжей в значительной степени зависит от условий культивирования, как это было в частности показано на примере отдельных фракций, экстрагируемых из клеток (Вагабов и др., 2000) и вакуолей (Трилисенко и др., 2002). Одним из основных эффекторов, влияющих на метаболизм этих полимеров, является концентрация РІ в среде культивирования. В связи с этим одной из задач работы было изучение влияния изменений концентраций Pi среды на содержание полиР и на активности экзополифосфатаз в митохондриях S. cerevisiae. Следует учитывать, что полиР являются весьма активно метаболизируемыми соединениями. Поэтому если клетки, у которых в результате гиперкомпенсации возрос уровень полиР, использовать для дальнейшего фракционирования с целью получения клеточных органелл, то в процессе получения сферопластов может произойти гидролиз полиР. В связи с этим были проведены специальные эксперименты для выяснения того, способны ли сферопласты, полученные из клеток, выращенных на фосфат-лимитированной среде до стационарной стадии роста, накапливать повышенное количество полиР при их переносе и инкубации на полноценной по фосфату среде. Для получения сферопластов использовали клетки дрожжей S. cerevisiae ВКМ Y 1173, которые выращивали на фосфат-лимитированной (0,8 мМ Pi) или полноценной среде Ридер (19,3 мМ Pi) в течение 23 ч (рис. 8). Полученные сферопласты инкубировали в течение 2 ч на полноценной среде Ридер в присутствии осмотического стабилизатора (см. Материалы и методы исследования, раздел 2.4.). Из сферопластов получали три фракции полиР: кислоторастворимую, солерастворимую и горячий хлорнокислый экстракт. Как и в случае митохондрий, не удалось получить щелочерастворимые фракции вследствие почти полной солюбилизации сферопластов. Содержание полиР как в солерастворимой, так и в кислотонерастворимой фракциях мало зависело от концентрации РІ в среде (табл. 4). Напротив, содержание кислоторастворимых полиР, на долю которых в сферопластах при достаточной концентрации Р; в среде приходится 70 % всех полиР, изменялось в наибольшей степени (табл. 4). В условиях гиперкомпенсации содержание кислоторастворимых полиР в сферопластах за 2 ч инкубации возрастало в 23 раза по сравнению с условиями лимитирования по фосфату и достигало 85 % от суммарного содержания полиР сферопластов. В условиях переноса сферопластов, полученных из клеток вьфащенных на полноценной среде, на свежую полноценную среду, содержание полиР даже уменьшалось (табл: 4). В сходных условиях гиперкомпенсации, в целых клетках за 2 ч общее содержание полиР возрастало в 12 раз, а вклад кислоторастворимых полиР составлял —70% (Kulakovskaya et al., 2004).
Таким образом, в условиях гиперкомпенсации в сферопластах наблюдаются изменения в содержании полиР похожие на те, которые характерны для целых клеток. Следовательно, сферопласты могут служить подходящей моделью для изучения гиперкомпенсации.
Влияние недостатка и избытка Pt в среде на содержание и длину цепи неорганических полифосфатов в митохондриях Saccharomyces cerevisiae.
После инкубации сферопластов дрожжей S. cerevisiae ВКМ Y 1173 в экспериментальных условиях, описанных в предыдущем разделе, из них получали препараты митохондрий. Полученные митохондрии, как следует из таблицы 5, обладали дыхательным контролем, Р/О и АТРазной активностью, которая на 90 % ингибировалась азидом - специфическим ингибитором митохондриальной АТРазы. АТРазная активность не подавлялась о-ванадатом и нитратом, что свидетельствовало в пользу отсутствия в препарате митохондрий плазматических мембран и вакуолей. Активность этого фермента была в 1,5 раза выше при рН 8,5 по сравнению с рН 7,2, что характерно для АТРазы FoFt типа с оптимумом рН 8-9 (Pederson and Carafolli, 1987; Скулачев, 1989).
Из таблицы 6 следует, что содержание полиР в митохондриях существенным образом зависит от изменения концентрации РІ в среде культивирования. Как и в случае сферопластов, наибольшие изменения происходили в кислоторастворимой фракции, тогда как в солерастворимой и особенно в кислотонерастворимой фракциях содержание полиР мало изменялось. При выращивании клеток на фосфат-лимитированной среде происходило десятикратное снижение уровня кислоторастворимых полиР в митохондриях по сравнению с полноценной по Pi средой. При инкубации сферопластов в условиях гиперкомпенсации, уровень кислоторастворимых полиР в митохондриях многократно увеличивался. Общее количество полиР в митохондриях превышало таковое в условиях роста на полноценной по РІ среде в 1,5 раза. Перенос с полноценной на полноценную по Р, среду не оказывал существенного влияния на содержание полиР в митохондриях (табл. 6).
Действие ингибиторов энергетического обмена на накопление неорганических полифосфатов в митохондриях и сферопластах, а также на активности экзополифосфатаз митохондрий Saccharomyces cerevisiae
Ранее для дрожжевых митохондрий было показано, что образование пирофосфата, который является самым низкомолекулярным представителем полиР, сопряжено с работой электронтранспортной цепи. При этом синтез пирофосфата протекал независимо от образования ATP (Mansurova, 1989). Для дрожжевых митохондрий ферментная система, ответственная за синтез пирофосфата пока не выявлена, но для хроматофоров Rhodospirillum rubrum было показано, что пирофосфат синтезируется РҐ-пирофосфат-синтетазой за счет электрохимического потенциала на мембране (Ballscheffsky et al., 1999). В связи с этим возникает предположение о возможности синтеза полиР в митохондриях за счет ДцН на мембране этих органелл. Поскольку нам не удалось выявить накопление полиР в изолированных митохондриях S. cerevisiae, то мы провели эксперименты по выяснению влияния ингибиторов энергетического обмена на накопление полиР как в сферопластах, так и в митохондриях, используя в качестве экспериментальной модели гиперкомпенсацию сферопластов.
Ингибиторы добавляли к полноценной по фосфату среде Ридер с 0,8 М маннитом, одновременно с сферопластами, полученными из клеток, выращенных на фосфат лимитированной среде. В таблице 10 показано влияние используемых ингибиторов на содержание кислоторасгворимых полиР и Pj в сферопластах и полученных из них митохондриях после 2 ч инкубации в условиях гиперкомпенсации. Как следует из этой таблицы, накопление полиР в митохондриях дрожжей при указанных условиях в значительной степени подавлялось разобщителями и ионофорами. При добавлении к сферопластам 2,4-динитрофенола и FCCP содержание полиР в митохондриях уменьшалось на 50-60 %, а при добавлении нигерицина накопление полиР в митохондриях блокировалось полностью. При этом данные ингибиторы либо не влияли, как FCCP и ДНФ, либо в меньшей степени снижали, как нигерицин, содержание РІ в митохондриях. Степень ингибирования накопления полиР в сферопластах 2,4 динитрофенолом и FCCP, как и в случае митохондрий, составляла 40 - 60 %. Данные ингибиторы также не повлияли на содержание Р; в сферопластах. Нигерицин на 60 % подавил накопление полиР в сферопластах, однако его действие на сферопласты было выражено не так сильно, как это произошло в случае митохондрий. Поскольку нигерицин в качестве ионофора действует главным образом в митохондриальной мембране и не затрагивает при этом плазматические мембраны дрожжей S. cerevisiae (Kovac et al., 1982), то из этого следует, что митохондрии принимают непосредственное участие в накоплении в сферопластах, по крайней мере, части полиР. В присутствии нигерицина, ДНФ и FCCP произошло снижение экзополифосфатазной активности в растворимой и мембранной фракции митохондрий (табл. И). Это снижение, по- видимому, связано со снижением мембранного потенциала, который является движущей силой транспорта белков в эти органеллы (Pfanner and Neupert, 1985; SchJeyer et al., 1982; Weinstein et al., 1982). Ингибитор гликолиза 2-дезокси-П-глюкоза подавлял накопление полиР в сферопластах на 50%, тогда как процесс накопления полир в митохондриях являлся нечувствительным к данному ингибитору (табл. 10). Это указывает на существование нескольких путей биосинтеза полиР в клетках дрожжей. Ингибитор дыхательной цепи антимицин А не оказал влияния на процесс накопления полиР как в сферопластах, так и в митохондриях. Азид в выбранной концентрации (табл. 10) снизил содержание полиР в митохондриях дрожжей на 20 %. Учитывая тот факт, что в этой же концентрации азид снижал содержание кислоторастворимых полиР в сферопластах в большей степени, этот эффект азида можно считать связанным с неспецифичностью его действия, а не с прямым влиянием на активность митохондриальной АТРазы и электронтранспортной цепи в митохондриях S. cerevisiae. Интересно отметить, что в присутствии нигерицина и 2,4-динитрофенола снизилось не только содержание кислоторастворимых полиР в сферопластах (табл. 10), но и их средняя длина цепи, причем наиболее сильное влияние на длину цепи полиР оказал нигерицин (рис. 12), В отличие от указанных разобщителей, дезоксиглюкоза не оказала влияния на длину цепи полиР. Определить изменения средней длины цепи полиР в митохондриях в результате действия ионофора нигерицина и разобщителей не удалось вследствие резкого снижения содержания полиР в этих органеллах. Таким образом, процессы накопления полиР в митохондриях и сферопластах отличались по своей чувствительности к 2-дезокси-0-глюкозе и нигерицину, что говорит в пользу представления о существенных отличиях в метаболизме полиР в митохондриях и других клеточных компартментах. Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что процесс накопления полиР в митохондриях дрожжей зависит от электрохимического потенциала протонов на мембране митохондрий.
