Введение к работе
Актуальность тепы. Киллернно !пта?.5-лы S. cerevlsiae секрзтируют токсины, по своей специфичности составляющие двэ основные группы: KI, и К2. Токсины кодируются разными молекулами двуштевой РНК (днРНК)» Ml и.М2, входящими в состав нвинфэктишшх вирусных частиц. Исследование первичной структуры и организации генов, кодирующих токсин и устойчивость у 2СІ >и К2 типов вирусов необходимо по следующим положениям. Первое, процессянг и секреция токсина могут изучатся как общая модель процессипга и секреции белков в аукариогах. Второэ, изучение механизма действия токсина моеэт послужить моделью в понимании действия гормонов и'гзежкла точних коммуникаций. Однако, изучение генома вирусов, входящих в кшілерную систему S, cerevlsiae, з основном было сконцентрировано на системе 'КІ типа. Ген, кодирующий токсин и иммунность ІС2 типа до настоящего времени не был секзенирован в связи с трудностями при СШІ-.тезе ДНЯ, комплементарной к вирусной днРНК (кДНК). Поэтому установление первичной структуры гена, кодирующего токсин и иммунность КЗ типа' является необходимым этапом в исследовании организации киллерных токсинов. Кроме того, прямое сравнение геномов двух типов вирусов обеспечивает более полное представление о структурно-функциональной организации киллерной системы Saccnaro-myces cerevlsiae. Таїсатл образом, актуальность данной теш обусловлена необходимость получения шзформации о структуре генов на М2 днРНК сегменте генома вируса К2 типа для выяснения организации и проявления киллерной системы SaccMaromyceg cerevlsiae..
Работа выполнена по теме Института ботаники Литовской АН
"Создание и анализ модельных генетических систем на клеточном
уровне для селективного изучения изменчивости и биологической
продуктивности генома о целью создания высокопродуктивных корме-
еых культур" (й Госрегистрации 022814) и является составной
частью Всесоюзной научно-технической программы "Новейшие метода
биоинженеряи". ч .
ШШ .исследования: изучение структуры генов в участке вирусной М2 днРНК, определяющем продукцию токсша и юлмушость.' Задачи исследования':
1) провести синтез и клонирование ДШ, комплементарной к м>;~1
сегменту вирусного генома;
-
определить нуклеотидную последовательность клонированного участка вирусного генома, выявить первичную структуру гена токсина-иммунности. - .
-
провести экспрессию кДНК в дрозкжах.
Научная новизна работы. Впервые проведен синтез и клонирование кДНК, величиной в 1144 п.н., почти полностью перекрыващей M2-I днРЖ фрагмент и включающей ген токгаша-шыунности К2 типа. Определена нуклеотидная последовательность гена токсина-иммунности К2 типа, 'Состоящего из 362 кодонов, включающая ранее установленную (Hannlg and Leloowitz, 1985) 210 п.н. 5*-концвврз последовательность. Впервые проведена вкспрбссия клонированного гена К2 токсина-иммунности In vivo и показано, что токсин и иммунность кодируются одной открытой рамкой считывания., расположенной на M2-I днРНК фрагменте. На аминокислотной последовательности предавственншш токсина 1{2 типа выявлены потенциальные =-сайтн гликозилирования и Процессинга, осуществляемого KEXI -и КЕХ2 кодируемыми протеазами. ,
Практическое значение работы. Селективные преимугзства клеток дроетгай, обладающих клонированным геном токсина-иммунности, используются в.Лаоораторіш генетшси Института ботаники Литовской АН для стабильной поддержки плазыид. Нуклеотидная последовательность кДНК, представленная в работе, зарегистрирована в банке данных Европейской Лаборатории Молекулярной Биологии (EMBL, Гейдельберг, ФРГ) под номером ХБ4І54 и- может быть использована в научных лабораториях, ведущих работы- по генной инженерии и молекулярной биологии. На базе гена токсина-иммунности могут быть сконструированны дрожжевые векторы для секреции белков.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на от
четной конференции по Всесоюзной программе "Новейшие метода био-
инженерии" (Пущино, 1990), на научных конференциях Общества гене
тиков и селекционеров Литвы (Вильнюс, 1988, 1991), и международ
ном симпозиуме по вирусам грибов и низших эукарйотов (Мальерка,
ГЭЭ1). '
Пуйлиурлзти. По теме диссертации опубликованы 4 статьи и тези
сы 5 докладов. - ,
Структура и объем работы. Диссертация состоит. из введения,
