Введение к работе
з
Актуальность темы. Среди важнейших внутриклеточных компонентов особое положение занимают вещества нуклеотидной природы, которые в качестве кофакторов и в составе ДНК и РНК участвуют в таких жизненноважных процессах живых организмов, как биосинтез белков, регуляция биохимических процессов, энергетического обмена, иммунитета и функционирования наследственного аппарата. В настоящее время существенно возрос интерес к поиску и разработке лекарственных препаратов на основе природных нуклеотидов, которые могут стать эффективными средствами регуляции различных функций организма и метаболической терапии (van der Giet М. et al., 2001; Химкина JI.H. с соавт, 2001; Медведев М.С. с соавт., 2002). Известна также ключевая роль некоторых нуклеотидов в синтезе оксида азота- NO, которому принадлежит важная роль в регуляции многих биохимических процессов, в частности, активировании гуанилатциклазы, фосфолипазы С, влиянии на синтез инсулина, адреналин- и дофаминергическую системы. Кроме того, NO является неиротрансмиггером и веществом, участвующим в регуляции артериального давления, иммунореактивности и многих других важных физиологических процессов (Kerwin, J. F., et al., 1995, Bartberger M. D., et al., 2002). В связи с тем, что влияние нуклеотидов на синтез NO в организме осуществляется путем изменения активности NO-синтаз (NOS), в частности Са 2+ - зависимой NO-синтазы, поиск препаратов, влияющих на активность NOS, является одной из актуальных задач современной биологии и медицины.
Наше внимание привлекла возможность получения нуклеотидных препаратов из дрожжей Saccharomyces cerevisiae, которые по данным Лидак М.Ю., (1980); Заерко В.В с соавт, (2000) обладают выраженной биологической активностью, низкой токсичностью и перспективны для разработки на их основе лекарственных препаратов для повышения иммунореактивности организма, коррекции метаболических нарушений и
нормализации физиологических процессов при развитии ряда патологических состояний.
Цели исследования: получение нуклеотидных препаратов при различных условиях культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae, оценка влияния полученных препаратов на активность Са2+- зависимой NOS, выбор наиболее активного из них, исследование его фармакологических свойств и токсичности для получения разрешения на проведение клинических испытаний препарата.
Для достижения указанных целей были поставлены следующие задачи:
Разработать способы получения и стандартизации нуклеотидных препаратов из 5 штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae при различных условиях их культивирования.
Изучить влияние условий культивирования исследуемых штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae на активность полученных нуклеотидных препаратов по действию на Са2+-зависимую NO-синтазу тимоцитов крыс Wistar и отобрать наиболее активный из них.
Исследовать иммуномодулирующее действие отобранного нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisiae на основные звенья гуморального и клеточного иммунитета, а также на систему естественной резистентности организма.
Исследовать антиоксидантное действие полученного нуклеотидного препарата при окислительном стрессе на модели диабета 2 типа у крыс Wistar и изучить влияние препарата на секрецию инсулина Р-клетками поджелудочной железы при данной патологии.
Изучить цитотоксическое действие полученного нуклеотидного препарата на клетки человеческой аденокарциномы линии HeLa, человеческой монобластоидной линии U937, человеческой карциномы молочной железы MCF7 и мышиной фибробластомы L929.
Провести доклиническое токсикологическое изучение нуклеотидного препарата для получения разрешения на проведение его клинических испытаний.
Научная новизна и практическая значимость работы.
о Впервые разработан способ получения, изучен состав и
биологическая активность комплексного нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14, который является активатором Са2+ - зависимой N0- синтазы, обладает иммуномодулирующей активностью, защищает при окислительном стрессе и стимулирует образование инсулина Р-клетками поджелудочной железы при диабете 2 типа и является селективным апоптотическим фактором по действию на опухолевые клетки. По эффективности действия разработанный препарат не уступает используемым в настоящее время в клинической практике лекарственным препаратам аналогичного действия. Препарат малотоксичен, не обладает мутагенными, эмбриотоксическими, тератогенными, аллергизирующими свойствами и не влияет на репродуктивную функцию животных.
о Изучен предполагаемый механизм действия препарата, связанный с
его нормализующим действием на систему свободно-радикального окисления путем активации ряда таких ключевых ферментов и ферментных систем, как Са 2+ - зависимая N0- синтаза и активация Са + - мобилизующей системы, глутатион-связывающей системы и, возможно, с нивелированием убиквитин-перехватывающей активности.
о На модели диабета 2 типа у крыс установлено, что полученный
нуклеотидный препарат оказывает выраженное антиоксидантное действие, восстанавливая нарушенные системы супероксид-перехватывающей активности и восстановленного глутатиона. Назначение препарата купирует изменение активности синтазы оксида азота, вызванное стрептозотоцином.
о Впервые получены данные, свидетельствующие о способности
разработанного препарата в концентрациях 0,2-0,5 мг/мл оказывать цитотоксическое действие in vitro на перевиваемые клетки аденокарциномы линии HeLa, человеческой монобластоидной линии U937, человеческой карциномы молочной железы MCF7 и мышиной фибробластомы L929.
о Установлено, что в диапазоне испытанных концентраций
нуклеотидный препарат активирует каспазу-3 в опухолевых клетках указанных выше линий, вызывая при этом снижение доли G2/M в популяции клеток и увеличение доли апоптотирующих клеток (< Gi) и не влияет на клетки в культуре нормальных лейкоцитов человека, т.е. обладает селективным апоптотическим действием на опухолевые клетки.
о На способ получения, являющийся экологически чистым,
безотходным, и биологическую активность разработанного
комплексного нуклеотидного препарата получено 3 патента Российской Федерации (№ 2128218, № 2128702, № 2138549) и 3 Европатента (ЕР 0 805 201, ЕР 0 805 202, ЕР 0 805 203). На Всемирном салоне «Брюссель-Эврика-98» изобретение награждено Золотой медалью.
Внедрения в клиническую практику.
В соответствии с Законом Российской Федерации, разработанный комплексный нуклеотидный препарат зарегистрирован Министерством здравоохранения РФ в качестве лекарственного средства иммуностимулирующего действия для лечения острых респираторных вирусных инфекций у взрослых и детей с 6 лет и старше, сезонной профилактики ОРВИ, а также для комплексной терапии сахарного диабета 2 типа (Регистрационное удостоверение № Р №000949/ 02-2001 от 27.12.2001, ФСП 42-0331-1690-01, код ATC-[L0AX]), и в качестве БАД (Регистрационное удостоверение Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека № 77.99.23.3.У.9412.8.05 от 16.08.2005).
Результаты исследований использованы при подготовке методических указаний для врачей "Перекисное окисление липидов и его значение в патогенезе сахарного диабета и его осложнений" Министерства здравоохранения и социального развития РФ (Москва, 2004).
Результаты исследований используются в клинической практике по целевой Федеральной программе "Профилактика гриппа и ОРВИ в дошкольных и школьных учреждениях"
Положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Оптимальным источником для получения нуклеотидного препарата из 5 изученных штаммов хлебопекарных дрожжей Saccharomyces cerevisiae (раса 14, гибрид 67, гибрид 581, гибрид 722, гибрид 739) при различных режимах культивирования на глюкозе является раса 14. Полученный при этом комплексный нуклеотидный препарат содержит: адениновые нуклеотиды, свободные аминокислоты, микро- и макроэлементы, витамины, жирные кислоты и обладает выраженным активирующим действием на Са2+-зависимую NOS тимоцитов крыс Wistar.
Нуклеотидный препарат, полученный из дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14, оказывает выраженное иммуномодулирующее действие на клеточный и гуморальный иммунитет, а также на систему естественной резистентности организма.
На модели инсулиннезависимого диабета (диабет 2 типа) у крыс Wistar нуклеотидный препарат в диапазоне испытанных доз от 100-1000 мг/кг при внутрижелудочном введении животным обладает выраженным гипогликемическим эффектом и повышает уровень секретируемого поджелудочной железой инсулина. При этом восстанавливается уровень сульфгидрильных групп глутатиона в плазме крови, нормализуется активность СОД и супероксидперехватывающей активности, а также уровень Са2+-зависимой NOS в печени, (3-клетках поджелудочной железы и буром жире, что свидетельствует о нормализации антиоксидантных систем организма. У интактных животных нуклеотидный препарат не влияет на указанные выше биохимические показатели.
Нуклеотидный препарат в концентрациях 0,2-0,5мг/мл обладает цитотоксическим эффектом на перевиваемых клетках человеческой аденокарциномы линии HeLa, человеческой монобластоидной линии U937, человеческой карциномы молочной железы линии MCF7 и мышиной фибробластомы L929; активирует каспазу-3 в клетках указанных опухолевых линий, изменяет их клеточный цикл и не влияет на эти показатели в эксперименте на интактных лейкоцитах донорской крови человека. Нуклеотидный препарат из дрожжей Saccharomyces cerevisiae обладает селективным апоптотическим действием на опухолевые клетки.
Нуклеотидный препарат, полученный из дрожжей Saccharomyces cerevisiae, является малотоксичным при однократном введении мышам и крысам, хорошо переносится при длительном назначении лабораторным животным. Препарат не проявляет мутагенности в тесте Эймса, не вызывает хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей и не влияет на количество доминантных леталий в зародышевых клетках мышей. При назначении беременным крысам препарат не обладает эмбриотоксичностью и тератогенностью. Препарат не влияет на репродуктивную функцию половозрелых животных. В испытанных дозах и схемах введения препарат не проявляет аллергизирующего действия.
Результаты проведенных исследований позволяют рекомендовать полученный комплексный нуклеотидный препарат в качестве лекарственного средства сопутствующей терапии для коррекции метаболических нарушений при диабете 2 типа, в качестве иммуностимулятора и БАД общеукрепляющего действия.
Апробация работы.
Основные результаты работы были доложены, обсуждены и опубликованы в материалах следующих симпозиумов и конференций: The XI-Th International Symposium on Microsoms and Drag Oxidation, Los-Angeles, USA, 1996; International Conference of EPR Spectroscopy of NO in Biological Systems. Suzdal, Russia, 1996; The VII Bait-LAS A Conference «Animal Models», Vilnius, Lithuania, 1997; 6* European Symposium on calcium binding properties in normal and transformed cells. Paris, France, 2000; International Conference "New food technologies" , Russia, Moscow, 2003; 11-th International Congress of yeasts "Yeasts in science and technology. The quest for sustainable development", Brazil, Rio De Janeiro, 2004; 25* Congress of Russian Biochemical Society, Russia, Moscow, 13-15 October, 2004, p.44; XII международный конгресс "Человек и лекарство", 2005, Москва, Россия, с.497., International Conference NMRCM-2005, Russia, St. Petersburg, 11-15 July, 2005, p.94; VI Научно-техническая конференция-выставка с международным участием "Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации", Москва, 2006, 15-16 ноября, с. 24.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 31 печатная работа, из них 9 статей в журналах перечня ВАК Министерства образования и науки РФ, 1 монография, 15 работ в материалах международных конференций. Получено 6 патентов (3 Патента РФ и 3 Европатента), а также Золотая медаль Всемирного салона "Брюссель-Эврика-98".
Объем и структура диссертации.
Диссертация изложена на 233 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 6 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложений. Работа иллюстрирована 56 таблицами, 21 рисунком. Список литературы содержит 581 источник, в том числе 112 отечественных и 463 зарубежных.
