Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 8
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. Феномен программируемой клеточной смерти 11
Характерные признаки апоптоза 11
Функции апоптоза у многоклеточных 13
Компоненты каскада самоубийства 14
Роль митохондрий в апоптозе многоклеточных 16
Терминология типов клеточной смерти 18
Апоптотические домены и механизмы апоптоза в разных систематических группах 19
Глава 2. Запрограммированная гибель одноклеточных организмов 22
Инфузории 23
Паразитиеские кинетопластиды 24
Слизевики 25
Одноклеточные автотрофы 26
Архемонады 26
Дрожжи 27
Глава 3. Молекулярные механизмы программируемой клеточной смерти дрожжей 34
Дрожжевая метакаспаза 34
Протеаза Оті. 35
AIF 36
Роль митохондрий в программируемой клеточной смерти дрожжей 37
Неспецифическая митохондриальная пора дрожжей 41
Глава 4. Феромонный каскад дрожжей 42
Биология дрожжей 42
Клеточный ответ на половой феромон 44
Гибель клеток S. cerevisiae, вызванная а-фактором 47
Глава 5. Кальций в дрожжах 48
Методы измерения внутриклеточного кальция в S. cerevisiae 48
Поддержание кальциевого гомеостаза в S. cerevisiae 50
Амиодарон 52
Глава 6. Особенности митохондрий пекарских дрожжей 53
Глава 7. Активные формы кислорода 56
Особенности образования и детоксикации АФКу дрожжей S.cerevisiae 58
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 1. Культивирование дрожжей 63
Генотипы использованных штаммов дрожжей 63
Приготовление среды для культивации 63
Условия культивации 64
Глава 2. Тесты на выживание дрожжей 66
Индукция ПКС 66
Оценка выживаемости по количеству КОЕ. 66
Микроскопические методы 67
Глава 3. Синхронизация культуры дрожжей 68
Глава 4. Методы флуоресцентной микроскопии 68
Окрашивание клеток на АФК. 68
Окрашивание клеток на митохондрии 69
Окрашивание клеток на Са2+ 70
Окрашивание клеток на ДНК* 70
Определение репликативного возраста клеток. 70
Глава 5. Выделение митохондрий из Saccharomyces cerevisiae и измерение скорости поглощения кислорода 71
Глава 6. Молекулярно биологические методы 72
Выделение плазмидной ДНК из E.coli на колонках Qiagen miniprep kit. 72
Выделение геномной ДНК дрожжей 73
Расщепление и лигирование ДНК дрожжей 73
Аналитический электрофорез ДНК в агарозных гелях 74
Трансформация клеток E.coli методом электропорации 74
Интегративная трансформация дрожжей 74
Получение мутантных линий с полностью инактивированным геном 75
Глава 7. Список использованных реактивов 77
РЕЗУЛЬТАТЫ
Глава 1. Исследование модели программируемой клеточной смерти дрожжей штамма W303-1B, вызванной избытком феромона 79
Глава 2. Исследование ПКС, индуцированный высокой концентрацией феромона на линии клеток W303-1B cmd1-6 82
Глава 3. Влияние ингибиторов и антиоксидантов на ПКС клеток W303-1Bcmd1-6 88
Глава 4. Скрининг генов, участвующих в регуляции программы самоубийства Saccharomyces cerevisiae, вызванного избытком фермона 90
Описание скрининга 90
Результаты скрининга 95
Анализ мутантов на предмет устойчивости к ПКС, вызванной избытком феромона 96
Глава 5 Индукция программируемой клеточной смерти на промежуточных этапах 104
Индукция ПКС пекарских дрожжей перекисью водорода и менадионом 104
Искусственное повышение концентрации цитоплазматического кальция 105
А23187 106
Амиодарон 107
Глава 6. Характерные признаки апоптоза, наблюдаемые в клетках обработанных амиодароном 113
Глава 7. Гиперполяризация митохондрий, вызванная амиодароном 114
Изменения дыхания дрожжевых клеток, вызванные амиодароном...115
Глава 8. Образование АФК клетками, вызванное амиодароном 121
Глава 9. Фрагментация митохондрий 126
Глава 10. Исследование функции гена YSP1 128
ОБСУЖДЕНИЕ 130
ВЫВОДЫ 138
Список работ, опубликованных по теме диссертации 139
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 140
Введение к работе
Исследование механизмов программируемой клеточной смерти имеет большое теоретическое и практическое значение. Контролируемая элиминация клеток играет важную роль в онтогенезе, функционировании иммунитета и поддержании тканевого гомеостаза. До недавних пор считалось, что программируемая клеточная смерть (апоптоз) присуща только многоклеточным животным или растениям (Vaux et al., 1996, Huettenbrenner et al., 2003). Такое мнение было основано на том факте, что анализ геномов одноклеточных организмов не выявлял гены, гомологичные генам, кодирующих апоптотические белки многоклеточных животных. Однако увеличение количества полностью отсеквенированных геномов, а также обнаружение новых семейств апоптотических белков, позволило обнаружить их гомологи в одноклеточных эукариотах и даже в бактериях (Aravind et al., 1999, Коопіп & Aravind, 2002). Одновременно было обнаружено, что программируемую клеточную смерть, сходную с апоптозом высших эукариот по цитологическим признакам, можно вызвать различными искусственными и природными индукторами у целого ряда одноклеточных организмов: дрожжевых грибов, кинетопластид, инфузорий, одноклеточных водорослей (см Гордеева и др., 2004).
До последнего времени основным объектом исследования при изучении апоптоза были клеточные линии высших эукариот, тогда как использование дрожжей Saccharomyces cerevisiae в качестве модельного организма значительно удобнее в экспериментальном плане. Пекарские дрожжи, в отличии от клеточных линий многоклеточных, значительно более удобны для всевозможных генетических манипуляций, в том числе и для проведения широкомасштабного генетического скрининга. В 1998 году был проведен скрининг дрожжевых клеток, экспрессирующих библиотеку кДНК человека на предмет устойчивости к действию проапоптоического белка Вах, который также был экспрессирован в этих клетках. В результате этого скрининга был идентифицирован новый антиапоптотический белок, ингибитор Вах — ВИ (Xu et al., 1998). Однако подобный генетический скрининг так и не был осуществлен с естественными индукторами программируемой клеточной смерти пекарских дрожжей. Это упущение было связано с тем, что большинство известных к тому времени индукторов программируемой смерти вызывали программируемую гибель лишь в части клеток, тогда как остальные клетки гибли либо неспецифическим способом (их смерть не подавлялась ингибиторами синтеза белка), либо оставались живы (в случае гибели клеток, вызванной старением или мутаций в шапероне гистонов). Однако совсем недавно был обнаружен еще один естественный индуктор программируемой клеточной смерти пекарских дрожжей. Оказалось, что половой феромон (а-фактор) в высоких концентрациях вызывает программируемую гибель небольшой фракции клеток дрожжей дикого типа (Severin & Hyman, 2002). Но если использовать штаммы, сверхчувствительные к половому феромону, то можно создать условия, где практически все клетки, обработанные феромоном, будут нежизнеспособны. Затем, если такие гиперчувствительную штаммы трансформировать транспозонной библиотекой для инактивации случайных фрагментов генов (или целых генов) и обработать их высокой концентрацией феромона, можно идентифицировать мутантные линии с нарушенной программой самоубийства. Идентифицировав положение вставки, можно узнать, какие гены дрожжей являются необходимыми для реализации этой программы. Проведение такого скрининга и идентификация роли найденных генов в программе самоубийства дрожжей были поставлены в качестве задач настоящей работы.
Для линий клеток многоклеточных животных, в ряде случаев, достаточно подробно изучен механизм реализации программы самоубийства, тогда как в случае пекарских дрожжей до сих пор были получены только предварительные сведения, не раскрывающие механизмов этой программы. Поэтому, перед нами была поставлена задача выяснить последовательность и взаимосвязь процессов, происходящих в клетке при активации программы самоубийства половым феромоном. Поскольку цитологические и молекулярные признаки программируемой гибели одноклеточных организмов во многом схожи с таковыми для клеток многоклеточных животных, то есть основание полагать, что исследование механизма программируемой гибели дрожжей позволит выявить некоторые общие закономерности апоптоза.
Особый интерес в этой связи представляет собой исследование роли митохондрий в программе самоубийства дрожжевой клетки. Для клеток млекопитающих было показано, что митохондрии играют важную роль в регуляции программы самоубийства. Предполагается, что явление апоптоза могло возникнуть одновременно с возникновением митохондрий (цит. по Koonin & Aravind 2002), что объясняет важную сигнальную роль этой органеллы в апоптозе. Кроме того энергетика клетки находится в сильной зависимости от функционального состояния митохондрий. При апоптозе клеток многоклеточных животных митохондрии являются основным источником активных форм кислорода. In vitro было показано, что митохондрии дрожжей также могут образовывать АФК (Chance 1979). Однако до сих пор оставалось неизвестным, являются ли митохондрии источником АФК in vivo. Исследование этого вопроса позволило бы в определенной степени управлять процессом программируемой смерти в одноклеточных организмах. Поэтому, перед нами была также поставлена задача выяснить судьбу и роль митохондрий в программируемой клеточной смерти дрожжей.
Понимание механизмов контролируемой клеточной смерти дрожжей имеет значение не только в связи с тем, что позволяет проводить аналогии с апоптозом высших эукариот. Очевидно, что механизмы самоубийства клеток грибов и млекопитающих имеют более или менее существенные отличия, что позволяет надеяться на создание новых специфических антигрибковых препаратов (Philips et al., 2003).
