Аллостерические центры "биосинтетической" L-треониндегидратазы из дрожжей Saccharomyces carlsbergensis Рабинович Сергей Эдуардович

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 10

1. Роль аллостерических ферыентов в регуляции метаболических путей в клетке 10

2. Доказательства пространственной обособленности аллостерических центров... 17

3. Участие SH-груіш в функционировании аллостерических ферментов 28

4. Свойства "биосинтетической" L-треониндегидратазы из микроорганизмов 35

5. Свойства "биосинтетической" L -треониндегидратазы из дроккей 48

6. Канцеростатическая активность L-треониндегидра-

тазы 53

7. Постановка задачи собственных исследований 55

ГЛАВА П. МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ 57

1. Очистка "биосинтетической" L 57

2. Определение активности 58

3. Определение концентрации белка 59

4. Определение связывания Р^С] -эффекторов с "биосинтетической" L-тре онинде гидратазой 60

5. Методика десенсибилизации активаторной функции фермента 61

6* Метод модификации пиридоксаль^'-фосфатом 62

7. Метод модификации 5>5*-дитиобис-(2-нитробензой-

ной) кислотой... 62

8* Химические синтезы аналогов L-валина и L-изо-

лейцина 64

9. Материалы *. 64

ГЛАВА III. КИНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ "АКТИВАТОРНОГО" ШОСТЕРИЧЕСКОГО ЦЕНТРА "БЙОСИНТЕТИЧЕСКОЙ" L -ТРЕОНИНДЕГЙДРАТАЗЫ ИЗ ДРОЖЖЕЙ ... 66

ГЛАВА ІУ. КИНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ "ИНГИБИТОРНОГО" АЛЛО-СТЕРИЧЕСКОГО ЦЕНТРА "БИОСИНТЕТИЧЕСКОЙ" L-TPEO- НИНДЕГИДРАТАЗЫ из ДРОЖЖЕЙ S. carfshercjensig 86

ГЛАВА У. ИССЛЕДОВАНИЕ СВЯЗЫВАНИЯ [14С] -ЭФФЕКТОРОВ С "АКТИВАТОРНЫМ" И "ИНШЙТОРНЫМ" ЦЕНТРАМИ "БЙОСИНТЕТИЧЕСКОЙ" L -ТРЕОНИНДЕГЙДРАТАЗЫ ИЗ ДРОЖЖЕЙ S. carfubet-cjenuLg 105

ГЛАВА УІ.ФУНКЩОНАЛЬНАЯ РОЛЬ SH-ГРУПП "БЙОСИНТЕТИЧЕСКОЙ"

L-ТРЕОНИНДЕГЙДРАТАЗЫ ИЗ ДРОЖЖЕЙ S. carfsbercjen- 116

ГЛАВА УП. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ... 130

ВЫВОДЫ 137

ЛИТЕРАТУРА 139

• Роль аллостерических ферыентов в регуляции метаболических путей в клетке
• Определение активности
• КИНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ "АКТИВАТОРНОГО" ШОСТЕРИЧЕСКОГО ЦЕНТРА "БЙОСИНТЕТИЧЕСКОЙ" L -ТРЕОНИНДЕГЙДРАТАЗЫ ИЗ ДРОЖЖЕЙ
• КИНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ "ИНГИБИТОРНОГО" АЛЛО-СТЕРИЧЕСКОГО ЦЕНТРА "БИОСИНТЕТИЧЕСКОЙ" L-TPEO- НИНДЕГИДРАТАЗЫ из ДРОЖЖЕЙ S. carfshercjensig
• ИССЛЕДОВАНИЕ СВЯЗЫВАНИЯ [14С] -ЭФФЕКТОРОВ С "АКТИВАТОРНЫМ" И "ИНШЙТОРНЫМ" ЦЕНТРАМИ "БЙОСИНТЕТИЧЕСКОЙ" L -ТРЕОНИНДЕГЙДРАТАЗЫ ИЗ ДРОЖЖЕЙ S. carfubet-cjenuLg

Введение к работе

"Биосинтетическая" L-треониндегидратаза (КФ.4.2.1.16), катализирующая гидролитическое дезаминирование L -треонина с образованием ^-кетомасляной кислоты и аммиака, является первым ферментом цепи биосинтеза L -изолейцина и регулируется этой аминокислотой по принципу отрицательной обратной связи. TJL обладает строгой специфичностью по отношению к своему ретроингибитору ( L-изолейцйну) и довольно строгой субстратной специфичностью. У микроорганизмов и растений существует еще один изофермент ТД -"биодеградативный". Так же как и TJ^, он является классическим аллостерическим ферментом, активирующими эффекторами которого являются смесь Г-SH и АМФ или АДФ у облигатно анаэробных бактерий. Исследование Ц^ из микроорганизмов послужило одной из экспериментальных основ для создания общей теории аллостерической регуляции ферментов модели моно, Уаймена и Шан&ё [172] . У животных оба эти изофермента отсутствуют; отсутствие ТД_С - одна из причин незаменимости L-изолейцина для животных и человека [тв] . Обнаруженная в печени человека [і] и ряда животных L-трвонин-L -сериндегидратаза является важным ферментом глюконеогенеза из аминокислот и, возможно, выполняет также другие физиологические функции.

Актуальность темы. Представляя собой классический пример аллостерического регуляторного фермента, 2 микробного происхождения является удобным объектом для изучения общих механизмов аллостерической регуляции. В этом смысле ТДф рассматривается в качестве обобщённой модели регуляторних ферментов для поиска биологически активных химических соединений или выявления повреждающих факторов внешней среды по принципу их воздействия на аллосте-рические центры фермента. Кроме того, высокоочищенные препараты

ТД обладают противораковой и, в первую очередь, антилейкозной активностью [17] . Так, показано, что ТД иа печени овцы [iIOjIIl] обладает канцеростатической активностью на культуре ткани.

Хотя аллостерическая природа TJ^ из микроорганизмов и растений и регуляция активности и синтеза этого фермента аллостери-ческими эффекторами не вызывает сомнений, вопрос о механизме аллостерических взаимодействий на уровне молекулы фермента во многом остаётся открытым для ТД_С из любого источника, в том числе и для фермента из дрожжей, а функциональная роль отдельных аминокислотных остатков в аллостерическом функционировании регуляторних ферментов практически не изучена для ТД_С из любых источников и вообще недостаточно изучена для других аллостерических ферментов.

ЗД_С из дрожжей плохо изучена с точки зрения аллостерической природы и аллостерических взаимодействий; в литературе содержится много противоречивых данных. Данный фермент из пивных дрожжей &. caruberqensLS в этом плане почти не исследован; он, так же как и аналогичный фермент из других видов высших дрожжей, не был получен в десенсибилизированном по отношению к аллостерическим эффекторам состоянии.

Еель работы. Долучить доказательство наличия аллостерических регуляторних центров в высокоочищенной їД_с из пивных дрожвей 2 carfgbergengLg » изучение некоторых их свойств, специфичности и сродства к эффекторам, определение количества аллостерических центров в молекуле фермента, получение фермента в десенсибилизированном по отношению к различным аллостерическим эффекторам состоянии при помощи химической модификации такими специфическими реагентами как ионы н|⁺ , ИЛФ, ДТНБ и изучение ряда свойств такого избирательно десенсибилизированного фермента. Исследование кинетическим методом и методом связыванияр^с] -эффекторов функциональных групп аллостерических центров Щ, , существенных для связывания эффекторов и для инициации вызванных таким связыванием конформационных переходов в активном олигомере исследованного фермента, т.е. для аллостерического перехода.

Научная новизна работы. Показано наличие в составе гекса-мерной молекулы !ВД_С из пивных дрокЕей 2. cartsЬегдеп$і «актива-торных" аллостерических центров, связывающих L -валин, низкие концентрации I -изолейцина и ряд L - ^(-аминокислот с алифатическим радикалом, а также "ингибиторных" аллостерических центров, связывающих высокие, ретроингибирующие фермент концентрации L-изолейцина. Исследована специфичность эффекторов для данных аллостерических центров. Разработаны методы избирательной химической модификации фермента, делающей его десенсибилизированным по отношению к активации L -валином, низкими концентрациями L-изолейцина или по отношению к ингибированию высокими концентрациями L-изолейцина. Установлено, что существенными группами для аллостериче-ской активации фермента являются SH-группы остатков цистеина, а для процесса аллостерического ингибирования - -^-группа остатка лизина. Исследована роль этих существенных функциональных групп в связывании эффекторов на этих центрах и участии их в гетеротроп-ных аллостерических взаимодействиях между "активаторными" и активными, "ингибиторными" и активными центрами фермента. Методом связывания [с] -эффекторов показано, что в составе активного гек-самера фермента содержатся два "активаторных" и три "ингибитор-ных" аллостерических центра, между которыми устанавливается гете-ротропное взаимодействие, в основе которого лежит механизм "исключающего" связывания лигандов. Модификацией ТЛ_С при помощи ДТНБ исследованы число, реакционная способность и функциональная роль SH-групп фермента. Показано, что в нативной гексамерной молекуле ТД_С содержится три типа SH-групп, различающихся по своей реак- ционной способности по отношению к ДТНБ и существенных не только для процесса аллостерической активации, но также для самой каталитической активности фермента и процессов ассоциации гексаиера в более высокомолекулярные каталитически неактивные агрегаты. Полученные результаты вносят существенный вклад в изучение ВД. и в об- щую теорию аллостерической регуляции.

Практическое значение работы состоит в создании обобщённой модели аллостерических регуляторних ферментов для отбора химических соединений на биологическую активность, в том числе и возможную фармакологическую активность, по принципу их воздействия на аллостерические свойства исследуемого фермента.

Роль аллостерических ферыентов в регуляции метаболических путей в клетке

Проблема выяснения механизма действия ферментов и регуляции их активности в условиях in чХЫо является важнейшей проблемой современной биологии. Это объясняется той ролью, которую ферменты играют в визнедеятельноети живых организмов, одним из уникальных свойств которых является сохранение химического гомеоста-за, т.е. постоянного баланса между необходимыми для поддержания их функционирования катаболическими (биодеградативными) и анаболическими (биосинтетическими) процессами. Такой гомеостаз обеспечивается регуляторними механизмами различной природы, среди которых важная роль принадлежит механизму регуляции активности ферментов, занимающих ключевые позиции в метаболических путях, под действием метаболитов - регуляторов. Среди большого числа химичесйих механизмов регуляции (нервно-гуморальной и гормональной у животных, фитогормональной у растений) особое место принадлежит регуляции по принципу отрицательной обратной связи. Этот принцип наиболее детально разработан для микроорганизмов в связи с тем, что он у них проявляется наиболее рельефно из-за отсутствия более сложных механизмов регуляции, в частности, гормональных [18].

Принцип отрицательной обратной связи для строго биосинтети-ческих путей исходит из работ Абельсояа с сотр. [42] , показавших в начале 50-х годов, что "конечный" продукт в цепи биосинтеза -L-изолейцин препятствует включению _С в _, иэолвйцин белков у бактерии 6. еоіі из различных [I/fC ] - предшественников, в том числе и из р С ] -глюкозы, фундаментальными работами для разви - II тия теории отрицательной обратной связи явились работы Амбаргера [225] , установившего, что у .eo(?i L-из о лейцин регулирует свой биосинтез двумя путями: подавляя активность ТД (первого фермента пути его биосинтеза) и ингибируя биосинтез этого фермента. Таким образом, принцип отрицательной обратной связи состоит в подавлении конечным продуктом синтеза первых ферментов (одного или нескольких) в пути биосинтеза этого конечного продукта - генетическая репрессия, или в подавлении этим же конечным продуктом непосредственно активности этого первого фермента - ретроингибирование часто наблюдается двоякое действие. Такой тип регуляции (репрессия и ретроингибирование) позволяет клетке не тратить энергию и промежуточные соединения для биосинтеза тех веществ, которые содержатся в клетке в данный момент в необходимом количестве, при этом, ретроингибирование является мгновенным, физиологическим ответом клетки на изменение пищевых условий среды, тогда как репрессия отражает длительное, регулярное наличие во внешней среде необходимого клетке соединения и клетка не тратит энергию и аминокислоты на синтез ферментов, участвующих в биосинтезе данного соединения.

. class2 МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ class2

Определение активности

Активность ТДС определяли по количеству образованного продукта реакции - d -кетобутирата (используя L -треонин в качестве субстрата) или пирувата (используя L-серии) при помощи лак-татдегидротеназной системы двумя методами: а) по ходу самой ферментативной реакции при сопряжении с лактатдегидрогеназой и МЩН [69] , скорость которой определяли по убыли А/АЭИ при 340 нм в кювете с длиной оптического пути I см (коэффициент экстинции для N№H при этой длине волны = 6,22-10 М"1 см""1) или б) с остановкой ферментативной реакции и дальнейшим определением -кетобутирата при помощи той ке лактатдегидрогеназной системы [133] .

В обоих случаях реакцию проводили в 0,25 М калий-фосфатном буфере соответствующего значения рН при 25 или при указанной температуре, который содержал субстрат ( [,-треонин или L cepHH) в разных концентрациях и 7,5ФЮ" М ПЛФ. Объём реакционной смеси составлял 3 мл.

При использовании первого метода определения активности в реакционную смесь добавляли также 3,67«I0"" M NADH и избыток лак-татдегидрогеназы (0,03 мл суспензии фермента из мышц свиньи с удельной активностью 200 ед/мг белка при концентрации белка 19 мг/мл Реакцию начинали добавлением ТД При использовании второго метода реакцию Т с субстратом и ПЛФ проводили в течение 6 мин при 25 а затем ее останавливали добавлением 0,075 мл концентрированной Hg g 0 с последующим выдерживанием реакционной смеси в течение 5 мин в кипящей водяной бане. Необходимую аликвоту надосадочной жидкости, содеркащей образованную (/-кетокислоту, приливали к 0,5 I калий-фосфатному буферу, рН 7,0, нейтрализовали КОН до рН 7,0 и добавляли NKbH (3,67-10" М). Общий объём смеси составлял 5 мл, её разливали в две пробирки по 2,5 мл и к одной порции добавляли избыток предварительно отфильтрованной лактатдегидрогеназы, а к другой - тот же объём буфера. Через 15 мин, когда разница в оптической плотности между контрольной и опытной пробами достигала постоянного значения при комнатной температуре ( 20), измеряли уменьшение оптической плотности при 340 нм в связи с убылью NABH . Накопление продукта реакции во времени носило прямолинейный характер по крайней мере в течение 10 мин.

За единицу ферментативной активности принимали такое количество белка, которое катализирует образование I мкмоль d -кетокислоти за I мин при 25. Удельную активность выражали в единицах активности в расчёте на I мг белка. Все кинетические кривые, представленные в данной работе, получены по начальным скоростям реакции.

Кинетическое исследование "активаторного" шостерического центра "бйосинтетической" l -треониндегйдратазы из дрожжей

Кинетический анализ активации фермента L -валином и низкими концентрациями L-изолейина и ингибирования высокими концентрациями L -изолейцина при рН 7,8 и при фиксированной концентрации субстрата (1»10 2 М L -треонин) показал (см.рис.3, кривая I), что активация фермента L -валином достигает максимума при концентрации L -валина 2«КГ М,- дальнейшее увеличение концентрации этой аминокислоты не влияет на степень активации (т.е. на отношение к!Q) котоРая при этом составляет 50-54%. Негиперболический характер активации фермента при увеличении концентрации L-валина (кривая не спрямляется при представлении ее в двойных обратных координатах - см.рисзб; величина коэффициента кооперативности Хилла н I - см.рис.Зв) указывает, что в олигомерной ТДС из пивных дрожнсей (молекулярная масса 300 000 дальтон [?] ) содержится несколько центров связывания L -валина, мекду которыми устанавливается гомотропное кооперативное взаимодействие. Аналогичные кривые зависимости активации фермента L -валином от концентрации этой аминокислоты при фиксированных концентрациях L -треонина (I lO "2 М) были получены в широком интервале значений рН (от рН 6,5 до рН 9,5) (см.рисЛ). Как следует из этого рисунка (рисЛ), максимальная величина /2 выявляется в области рН 8,5 9,3, что указывает на максимальную степень кооперативности в данной области рН.

Выше (см.раздел 5» глава I) было указано, что для тдс из дрожжей характерна активация фермента низкими концентрациями. Зависимость степени активации реакции, катализируемой "биосинтетичаской" L -треониндегидратазой из пивных дрожжей J. catftbet-jjentU , от концентрация эффектора при фиксированной концентрации субстрата (0,01 Н L -треонин) при рИ 7,8.

Данные представлены в координатах зависимости степени активации C I/ Q) ОТ концентрация эффектора, б - В координатах обратной зависимости абсолютной величины активация () от обратной концентрация эффектора, в - В координатах Хилла. I - L -валив, 2 -L-ва-лин в присутствии фиксированной концентрации L -изолейцина (5»Ю"5 м), 3 -L-нзолейцин, 4 - L - -амино-н.-масляная кислота» 5 - cL -кето- $-метнл-н.-валериановая кислота ( -кетоаналог изо-лейцина).

Зависимость относительной активности высокоочищен-ной "биосинтетической L -треониндегидратазы из пивных дрожжей от концентрации L -ваша при различных значениях рН при постояв-вой концентрации L-треонина (1»10"2 1):

Данные представлены а - В координатах зависимости относительной активности от концентрации эффектора; 6-8 двойных обратных координатах; в - Зависимость коэффициента кооперативноети ХиллаАІд от pi; I - 9,75; 2 - 9,3; 3 - 6,5; - 7,8; 5 - 8,5 и о — 8,9 дзолейцина и что эта активация, возможно, обусловлена связыванием L -изолейцина на "активаторном" центре. Действительно, низкие концентрации [_,-изолейцина значительно (до 35%) активировали исследуемую высокоочищенную ТДС, при рн 7,8 при фиксированной концентрации L-треонина 1-Ю"2 М (см. рис.За, кривая 3). Дальнейшее повышение концентрации L -изолейцина приводило к иягибирова-нию фермента. Для решения вопроса о том, является ли "активатор-ный" центр общим для 1 -валина и низких концентраций L -изолейцина, исследована аддитивность их действия. Как видно из рис.За (кривая 2), при низкой фиксированной концентрации L -изолейцина (5 Ю - М) и низких концентрациях L-валина (в области 5 10 М) аддитивности активации не было: степень активации (30-32%) близка к степени активации под действием одного лишь L -изолейцина. Форма кинетической кривой активации фермента (см.рис.За, кривая 2) обусловлена тем, что сродство L-изолейцина к "активаториому" центру выше, чем сродство L-валина к этому центру. Количественный анализ сродства "активаторного" центра к этим эффекторам приведен ниже. Отсутствие аддитивности при активации фермента L -валином и низкими концентрациями L-изолейцина было показано также для Тд из пекарских дрожжей #. cetevigicie [43] . Эти данные свиде-тельствуют об общности "активаторного" центра фермента по отношению к этим двум L -аминокислотам.

Кинетическое исследование "ингибиторного" алло-стерического центра "биосинтетической" l-tpeo- ниндегидратазы из дрожжей S. carfshercjensig

Как было отмечено в разделе 5 главы I, ТД. из ДРОЖЕЄЙ в отличие от фермента из бактериальных и растительных источников не была получена в десенсибилизированной по отношению к ингибирующе-му действию L -изолейцина форме, т.е. аллостерическая природа "ин-гибиторного" центра у ТДС из дрожжей не была доказана. Вместе с тем, было высказано предположение, что в ТДС из пекарских дрожжей 0.сегеггї &ае центр связывания [_-изолейцина Б качестве ре-троингибитора перекрывается с центром связывания _,-валина в качестве активатора, а также с активным центром фермента [69] . Поэтому установление аллостерической природы "ингибиторного" центра для высоких концентраций L-изолейцина при исследовании аллостери-ческих регуляторних центров ТДС из дрожжей $. cartubet-cje/zgcg является существенной научной задачей.

Химическая модификация различных групп белка широко используется для десенсибилизации аллостерических ферментов. В частности, для этой цели часто применяют Н#2+ как реактив на н-группы. Десенсибилизация ТДС из разных микробных и растительных источников к ретроингибирующему действию L-изолейцина под действием Но2+ также описана (см.раздел 4 главы I). С другой стороны, обработка Но этого фермента из дрожжей S. сегемс$сае [191] и ЗїііЕО асс/іаґоті/сеї/ о/»6е\9Ь] не приводила к десенсибилизации по отношению к ингибированию L-изолейцином.

Как показали наши эксперименты (см.рис.9), модификация SH - 87 [цуію м 2+ групп под действием Но не вызывала десенсибилизацию по отношению к иягибирующему действию L-изолейцина также и изучаемой % из пивных дрожжей S. еаг&Ьемеп$(.$ . Действительно, инкубация фермента в 0,05 М калий-фосфатном буфере, рН 6,5, в течение 20 мин. при 4 в присутствии различных концентраций MJIg почти в равной степени снижала активность фермента, измеренную в отсутствие и в присутствии L-изолейцина (4-10- I). Этот факт, очевидно, указывает на отсутствие в ферменте из пивных дрожжей Н-групп, существенных для процесса ретроингибирования, или же на большую реакционную способность Н-групп активного центра по сравнению с $Н-груп-пами, необходимыми для ретроингибирования. Первое предположение кажется более вероятным. Отметим, что резкое снижение ферментативной активности при обработке фермента H0CI2 указывает на существенное значение $Н-групп для самого каталитического акта. Этот вывод подтверждается тем, что обработка такого модифицированного фермента высокими концентрациями дитиотреитола (1-Ю""3 М) полностью восстанавливала каталитическую активность, не влияя на чувствительность фермента к ретроингибированию L -изолейцином.

Следует отметить, что десенсибилизацию изучаемого фермента в отличие от ТДС из многих микробных и растительных источников (см.раздел 4 главы I) также не удалось вызвать нагреванием ферментного раствора в течение 10 или 15 мин. при 60 или выдерживанием фермента в щелочной среде (рН I0) с последующей нейтрализацией раствора фермента.

Исследование связывания [14с] -эффекторов с "активаторным" и "иншйторным" центрами "бйосинтетической" l -треониндегйдратазы из дрожжей S. Carfubet-cjenulg

С целью исследования участия существенных для функционирования "активаторных" центров ?Н-групп в связывании L-валина на этих центрах и роли остатков лизина в связывании L-изолейцина на "ингибиторных" аллостерических центрах, а также для количественной оценки связывания этих аллостерических эффекторов на своих центрах было важно исследовать процесс связывания [_,- \р $ ] -валина с "активаторными", a L- [- С ]-изолейцина с "ингибиторными" центрами исследуемой ТДС из пивных дрожжей $. саг&Аегре/гїї?

Обнаружение кинетическим методом гомотропных кооперативных взаимодействий в пределах одноимённых центров привело к предположению о наличии в гексамерной молекуле ТД@ (молекулярная масса 300 000 дальтон [7] ) нескольких центров каждого типа, хотя этим методом установить их количество не представляется возможным.

Выше (см.главы III и ІУ) было показано, что сродство "акти-ваторных" аллостерических центров в ТДс из пивных дрожжей S.са ubetgensiS к L-валину и к низким активирующим фермент концентрациям L-изолейцина в значительной степени зависит от рн. В этой связи представлялось интересным исследовать связывание [ С] -эффек-торов при рН 6,5 и при рН 7,8, т.е. при тех значениях рН, при которых кинетические и аллостерические свойства фермента различаются.

Из рис.15 видно, что при рН 6,5 (кривая 2) и при рН 7,8 (кривая I) при представлении результатов связывания -[ с] -валина с нативным ферментом в координатах Скэтчарда с учетом молекулярной