Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Функции вакуолей в клетках грибов и растений . 10
1. Методы исследования вакуолей 10
2. Вакуоль-лизосома дрожжевой и растительной клетки 11
3. Вакуэлярная компартментация низкомолекулярных метаболитов, и участие вакуоли в регуляции их содержания в цитоплазме 17
ГЛАВА 2. Транспорт веществ через вакуолярную мембрану . 28
1. Белково-ллипидный состав тонопласта 28
2. Характеристика некоторых транспортных систем вакуолярной мембраны 29
3. АТФ-зависимый транспорт в изолированные вакуоли и везикулы тонопласта 33
ГЛАВА 3. Основной фермент, энергизующий транспорт через мембрану вакуолей . 36
1. Свойства АТФазы вакуолей 36
2. АТФаза вакуолей - электрогенная БГ-транслоказа . 41
Материалы и методы 46
1. Выращивание дрожжей 46
2. Получение сферопластов из дрожжевых клеток . 47
3. Выделение вакуолей 48
4. Выделение тонопласта 49
5. Солюбилизация и очистка вакуолярной АТФазы 49
6. Аналитические методы 49
Определение активностей ферментов 49
Заключение 131
Выводы 143
Список литературы 145
- Вакуоль-лизосома дрожжевой и растительной клетки
- Вакуэлярная компартментация низкомолекулярных метаболитов, и участие вакуоли в регуляции их содержания в цитоплазме
- Характеристика некоторых транспортных систем вакуолярной мембраны
- АТФаза вакуолей - электрогенная БГ-транслоказа
Введение к работе
Вакуолярная система грибных и растительных клеток, включающая в себя как крупную центральную вакуоль, так и более мелкие везикулы, вовлечена в регуляцию уровня в клетке некоторых ферментов, а также важнейших низкомолекулярных метаболитов и неорганических ИОНОВ (Matile, 1978; bichko et al., 1982; Око-роков, 1983).
Пристальное внимание исследователей к вакуолям привлечено тем, что в этих органеллах накапливаются различные полезные для человека вещества: незаменимые аминокислоты, витамины, алкалоиды, органические кислоты, сахара (Matile, 1982).
Так, в вакуолях дрожжей сосредоточены аргинин, орнитин, S- енозил-і-метионин (Matile, 1978), ионы Mg2+, К+, ортофосфа-та (Личко, Окороков, 1976; Личко, 1981). Вакуолярная компартмен-тация позволяет поддерживать в цитоплазме относительно постоянные и оптимальные для работы клеточных систем концентрации ряда веществ, а также мобилизовать запасные пулы метаболитов и ионов для поддержания жизнедеятельности в случае изменения внешних условий.
Накопление в вакуолях различных веществ против градиента концентрации, а также необходимость регуляции процессов входа и выхода их через вакуолярную мембрану указывают на то, что в этой мембране должны существовать специфические транспортные системы для этих веществ, а также системы, обеспечивающие эти транспортные процессы энергией.
Актуальность темы определяется тем, что изучение транспортных систем вакуолей позволяет понять как сами механизмы транспорта через вакуолярную мембрану, так и их взаимодействие со всем метаболизмом, и на этой основе увеличить накопление полезных для человека веществ.
К началу настоящей работы данные как по транспортным системам вакуолярнои мембраны, так и по их энергообеспечению были немногочисленными. Изучение свойств систем транспорта аргинина (Boiler et al,, 1975) и 3 аденозил-Інуіетионнна (Schwen-cke and de Robichon-Szulmajster, 1976) привело ИЗВЄСТНЄЙШЄГ0 исследователя вакуолей Матиля к выводу, что общим свойством вакуолярных транспортных систем, изученных в опытах с изолированными вакуолями, по-видимому, является отсутствие прямой зависимости транспорта от энергии, высвобождаемой при метаболизме (Matile, 1978).
В то же время, базируясь на общности законов клеточной энергетики, а также учитывая данные о наличии в вакуолях АТФ-азной активности, можно было предполагать возможность существования и участия в энергизации транспорта вакуолярнои АТФазы.
АТФазная активность была определена в вакуолях дрожжей еще в 1969 году (Wiemken, 1969), однако множественность вакуолярных фосфогидролаз (Wiemken et al., 1979), не позволяла сделать вывода о существовании в вакуолях дрожжей специфической АТФ азы. Долгое время данные по определению АТФазной активности вакуолей, выделенных из различных организмов были противоречивыми. Одним авторы находили такую активность (Wiemken, 1969І Шабалин, 1979; Lin et al., 1977), другие не обнаруживали ЄЄ (Циоменко, 1978; Briskin and Leonard, 1980). До последнего времени некоторые авторы не считали окончательно доказанным существование специфической АТФазы в вакуолярнои мембране (Boiler, 1982; Налладина, 1983).
Целью настоящей работы было определить, существует ли в вакуолях дрожжей Saccharomyces carlsbergeneis специфическая АТФаза, а также оценить ее возможное участие в энергизации транспорта ионов через вакуолярнуга мембрану у этих дрожжей. Экспериментальные задачи были сформулированы следующим образом:
1. Изучить свойства АТёазной и других фосфогидролазных активностей вакуолей дрожжей s.carlsbergeneis с тем, чтобы выяснить, не обусловлена ли АТФазная активность другими фосфо-гидролазами вакуолей.
2. Солюбилизировать и очистить от других фосфогидролаз АТФазу из вакуолей S.carlsbergensis.
3. ВЫЯСНИТЬ, СПОСОбна ЛИ АТФаза вакуолей S•carLsbergensis создавать электрохимический градиент ионов водорода (ДмК ) через мембрану этих органелл.
4. Может ли пирофосфатаза вакуолей выполнять функцию протонного насоса,
5. Определить, могут ли ионы, накапливающиеся в вакуолях in vivo использовать создаваемый АТФазой 44- для своего транспорта.
6. Изучить, как некоторые ионы влияют на формирование химического градиента ионов водорода ( dpH) и мембранного потенциала (Eg) через вакуолярную мембрану и могут ли эти ионы изменять анионную проницаемость тонопласта.
Вакуоль-лизосома дрожжевой и растительной клетки
Вакуоли грибных и растительных клеток являются самыми крупными органеллами, видимыми в световой микроскоп. Считается, что вакуоли являются неотъемлемой частью сложной системы лизо-сомального характера, включающей эндоплазматическии ретикулюм, аппарат Гольджи, а также периплазматическое пространство (de Duve, 1973), Эта сложная система мембран дает начало везикулам, которые в процессе роста и развития клеток увеличиваются в размерах, сливаются друг с другом. Большая центральная вакуоль является конечным продуктом деятельности всей системы, для которой был предложен термин "вакуом" (de Duve, 1973).
Для биохимических исследований используется в основном большая центральная вакуоль, так как ее размеры облегчают идентификацию и выделение. Успехи в биохимических исследованиях вакуолей связаны с разработкой двух методов: метода выделения вакуолей ИЗ клетки (Matile, Wiemken, 1967; Wiemken, Durr, 1974) и метода дифференциальной (последовательной) экстракции клеточных пулов (Schlenk et al., 1970; Wiemken, Nurse, 1973).
В настоящее время удается выделить вакуоли в изотонических условиях, определяемых разными авторами от 0,6 М (Wiemken, Durr, 1974), до I М (Medermeyer, 1976) с сохранением в них пула низкомолекулярных веществ. Однако, выделение вакуолей из каждого конкретного объекта по-прежнему представляет собой трудоемкую задачу, так как свойства вакуолей, определяющие возможность их очистки от других клеточных органелл, изменяются в зависимости как от объекта исследования, так и от условий культивирования.
В связи с этим метод последовательной экстракции сохраняет свою ценность. Он основан на способности некоторых полимеров основного характера, таких как ДЭАЭ-дектран (нйъег-v/ai-chli et al., 1978), цитохром С (Schlenk et al., 1970) делать плазматическую мембрану проницаемой дія низкомолекулярных веществ. При обработке клеток этими поликатионами в присутствии осмотического стабилизатора экстрагируются растворимые вещества только из цитоплазмы, вакуоли остаются интактными. Содержимое вакуолей экстрагируется затем при обработке клеток водой. Указанным методом изучено распределение между цитозолем и вакуолью серусодержащих компонентов (Schlenk et al., 1970), аминокислот (Wiemken, Uurse, 1973), ионов (Личко и щ .9 1976; Okorokov et al., 1980\ а также регуляция их уровня в этих двух КОМПартментах (Wiemken, Nurse, 1973; Lichko et al.,1982).
Ферментативные активности изолированных вакуолей были исследованы в ряде лабораторий, В таблице I показаны ферменты, удельные активности которых увеличиваются при выделении дрожжевых вакуолей по сравнению с лизатом сферопластов (wiemken, 1975), Видно, что цри выделении вакуолей обогащаются различные гидролазы. По данным Вимкена (Wiemken et al,, 1979) вакуоли
Saccharomyces cerevisiae содержали более 50 % протеазы А, 90 % протеазы В, 80 % карбоксипептидазы У, около 60 % -манно-зидазы от общей активности в клетке. Авторы считают, что дрожжевая вакуоль является основным компартментом литических ферментов (Wiemken et al., 1979).
Аналогичный вывод следует из таблицы 2, где показано, что вакуоли, выделенные из различных растительных объектов содержат основную часть таких ферментов, как протеазы, нуклеазы, маннозидаза, кислая фосфатаза. Общий вывод, поддерживаемый РЯДОМ исследователей (Matile, 1978,1982; Boiler, 1982) - ва-куоль грибных и растительных клеток является основным компарт-ментом литических ферментов, и выполняет функцию лйзосомы этих клеток, аналогичную лизосомам животных клеток.
На роль маркерного фермента вакуолей большинством авторов выдвигается оНданнозидаза (Van der wiiden et ai., 1973; wiem-ken, 1975; Matile, 1978; Boiler, 1982). Для этого фермента существует простая методика определения, он стабилен, кроме того, до последнего времени он был единственным маркером вакуолярной мембраны дрожжей (Van der wiiden et al., 1973), тогда как остальные ферменты вакуолей являются растворимыми.
Вакуэлярная компартментация низкомолекулярных метаболитов, и участие вакуоли в регуляции их содержания в цитоплазме
Решающий вклад в установлении факта компартментации ионов у дрожжей был внесен исследованиями, проведенными в отделе регуляции биохимических процессов ИЕШ (Личко и др., 1976; Lichko et ai., 1980; Okorokov et ai., 1980; Личко, 1981). Накопление Mg + и Mn + в вакуолях грибов и дрожжей было выявлено цитохи-мически (Okorokov et al., 1975;Окороков и др., 1978; Личко, 1981). Методом дифференциальной экстракции было показано, что вакуоль s.carisbergensis является главным компартментом ионов магния, калия и ортофосфата. Концентрации их составляют 5,60 и I мМ в цитоплазме, и 73,470 и НО мМ в вакуоли соответственно, что означает существование между цитоплазмой и вакуолью градиентов концентрации 1:15, 1:8 и 1:110. Градиенты концентраций через вакуолярную мембрану (тонопласт), по-видимому, не обусловлены более высокой степенью комплексообразования в вакуоли, а создаются транспортными системами. Так, определение концентрации свободного Mg так же показало существование градиента на тонопласте: в цитоплазме его концентрация 1,35 мМ, а в вакуоли 20 мМ (Lichko et al., 1980),
Следует отметить, что распределение ионов между цитоплазмой и вакуолью может зависеть как от вида микроорганизма, так и от условий выращивания и фазы роста. Данные, описанные выше, получены для дрожжей, аэробно выросших на глюкозе до середины логарифмической стадии роста. Содержание К+, например, на этой стадии максимально, а в стационарной стадии падает (Личко, 1981). В то же время мы не раз уже убеждались в том, что изменения, затрагивающие внутриклеточное содержание, например, аминокислот, в первую очередь отражаются на вакуолярном пуле. Поэтому нет ничего удивительного в том, что для культуры Candida utilis концентрация К+ в цитоплазматическом экстракте была определена в 2 раза более низкой, чем в вакуолярном (Ни-Ъег-walchli, Y/iemken, 1979). Эти же авторы получили, что 24 % ортофосфата находится в вакуолях, а 76 % - в цитоплазме (нйъег-Walchli, Wiemken, 1979). Для сравнения у Saccharomyces carls-bergensis в вакуолях содержится 64 % ортофосфата, а в цитоплазме - 2 %, остальной ортофосфат находится в клеточной стенке и в связанном состоянии (Личко, 1981). Данные по локализации К4 в дрожжевых клетках, полученные методом рентгеновского микроанализа (Hoomas, Seveus, 1976) представляются спорными, так как метод включает замену К на Са или Rb t что связано с длительной инкубацией в присутствии глюкозы. А такая инкубация даже в отсутствии Cs+ или Rb+ приводит к значительным потерям К (ІИЧКО, 1981). Эти авторы (Roomas, Seveus, 1976) нашли, что концентрация Rb+ в цитоплазме в 2 раза выше, чем в вакуолях. В ТО же время ДЛЯ Saccharomyces cerevisiae, выращенных в сходных условиях и до той же стадии роста, что и s.carisber- gensis удалось показать преимущественную локализацию Rb , Sr и Мп2+ в вакуолях (Nieuwenhius et ai., 1981). Подтверждение вакуолярной локализации ортофосфата получено методом ХР-ЯМР. Наряду с пиком ортофосфата, отнесенным к цитоплазматическому пулу, был обнаружен пул ортофосфата, находящегося в более кислом растворе, чем цитоплазма, предположительно в вакуолях, и превышающий цитоплазматический пул в несколько раз (flavon et ai., 1979). Метод позволил также определить, что в дрожжевой клетке есть более кислый (рН 6,5) компартмент, чем цитоплазма (рН 7,2-7,3), вероятнее всего, это - вакуоль №avon et al., 1979), В настоящее время общепризнанно, что вакуоль - более кислый компартмент, чем цитоплазма, следовательно, ионы Б также компартментализованы в грибных и растительных клетках, а вакуоль может принимать участие в регуляции внутриклеточного рН (Matile, 1982; d Auzac et al., 1982).
Заключая вопрос о вакуолярной компартментации ионов, следует отметить, что, если бы существовали данные о динамике цитоплазматического и вакуолярного пулов в процессе роста, то это могло бы решить вопрос о причинах различий, наблюдаемых разными авторами в распределении ионов. Тем не менее, не остается сомнений как в существовании вакуолярной компартмента-пии неорганических ионов, так и в ее регуляторнои роли в клетке.
Получен ряд интересных данных об участии вакуолей в регуляции содержания ИОНОВ В ЦИТОПЛаЗМе (Lichko et al., 1980,1982 ; Личко, 1981). Так при накоплении дрожжами s.carisbergensis Mg + или и 1 в присутствии глюкозы, происходит выход из клеток К+, затрагивающий в основном вакуолярный пул, а накапливающиеся Mg или Мп локализуются в вакуолях. Выход калия в таких условиях на 85-100 % осуществляется за счет вакуолярного пула этого катиона. Опыты по культивированию дрожжей на средах, дефицитных по неорганическим ионам, также демонстрируют регуляторную роль их вакуолярных пулов. Перенос дрожжей с полноценной среды на среду, дефицитную по Mg2+, приводит к уменьшению содержания этого иона, причем это уменьшение не затрагивает цитоплазмати-ческий пул, а касается только вакуолярного пула. Перенос дрожжей с дефицитной по фосфату калия среды на полноценную вызывает удвоение внутриклеточного Mg2+ и вновь уровень цитоплазматического MgfcT не изменяется, благодаря накоплению этого иона в вакуолях. Перенос на полноценную среду со среды, дефицитной по К+ приводил к 6-кратному увеличению количества К+ в вакуолях. В вакуолях дрожжей, голодавших по К+ и ортофосфату, при перенесении на среду с фосфатом калия, происходит сверхнакопление . низкомолекулярных полифосфатов параллельно со сверхнакоплением в тех же вакуолях Mg . Таким образом, известное явление "гиперкомпенсации" полифосфатов (Кулаев, 1975) имеет место в вакуолях. Вакуоли способны накапливать также Mg , при этом цитоплазматическая концентрация его остается неизменно низкой (Личко, 1981; Lichko et al., 1982). Обращает на себя внимание тот факт, что в вакуолях присутствует ряд катионов: Mg2+, К+, аргинин. Электронейтральность может обеспечиваться ортофосфатом, полифосфатами, возможно, другими анионами, такими, как сукцинат, НСОд. Следует отметить, что в вакуолях высших растений показана локализация ряда органических КИСЛОТ (Matile, 1982) , нитрата (Giandstedt, Huffacker, I9Q2 ), а в вакуолях дрожжей из анионов идентифжщрованы пока только ортофосфат и полифосфаты.
Характеристика некоторых транспортных систем вакуолярной мембраны
Переходя к вопросу о транспорте метаболитов через вакуоляр-ную мембрану, следует отметить методические трудности при изучении его на изолированных вакуолях. Первая попытка получить транспорт в выделенные из дрожжей вакуоли не удалась (Hakamura and Schlenk,1974). По настоящее время не всегда удается получить сопряжение между транспортом веществ и его энергизацией (Thorn et al., 1982; Busser-Sutter et al., 1982).
Изучены три системы транспорта через тонопласт у дрожжей: системы транспорта аргинина (Boiler et al., 1975), S-аденозил-!-МЄТИОНИНа (Schwencke, de Robischon-Szulmaj ster, 1976), аде-нозина (Nagy, 197Э). Изучены кинетические и некоторые другие характеристики этих систем. Транспорт аргинина осуществлялся с %=30 мкМ (Км транспорта в протопласты 1,3 мкМ), характеризовался рН оптимум 7,0-7,5. Переносчик имеет большее сродство к лизину (Кэд=1,3 мкМ) и орнитину (%=3 мкМ), конкурентно инги-бируется структурными аналогами 1-аргинина- d-аргинином и 1-канаванином (Boiler et al., 1975). Транспортная система активируется в 2-3 раза мягкой протеазной обработкой; повышение концентрации протеаз подавляло транспорт (Durr et al., 1976). Эти данные говорят, с одной стороны, в пользу белковой природы самого переносчика, а с другой стороны, в пользу существования белкового ингибитора этого переносчика. Четкое различие арги-ниновых транспортных систем тонопласта и плазмалеммы, показанное по кинетическим данным, подтверждено выделением мутантов s.cerevisiae, которые будучи лишены плазматической транспортной системы, сохранили в неизменности вакуолярную систему (Matile, 1978).
Транспортная система s-аденозил-і-метионина также отличается по Kjyj=68 мкМ от транспортной системы плазмалеммы (%=П мкМ). Она конкурентно подавляется з-аденозил- -этионином, З-аденОЗИЛ-ГОМОЦИСТеинОМ (Schwencke, de Robischon-Szulmajster, 1976). Транспорт S- аденозил-і-метионина не наблюдался, если дрожжи были выращены в отсутствие его предшественника - 1-ме-тионина, что указывает на индупибельность транспортной системы. Б пользу индуцибельности транспортных систем тонопласта говорит и то, что вакуоли дрожжей saccharomyces uvarum становились способными накапливать глицин только после предварительного азотного голодания (Indge et al., 1977). Изолированные вакуоли saccharomyces cerevisiae обладали способностью транспортировать гуанозин и аденозин с К =0,63 мМ и 0,15 мМ соответственно. Транспорт аденозина зависел от стадии роста №agy, 1979) Общий вывод из этих работ может быть следующим: в вакуо-лярной мембране для изученных соединений существуют специфические белки-переносчики, имеющие кинетические отличия от соответствующих переносчиков плазматической мембраны, и независимые от них генетически. Наиболее неожиданным свойством указанных систем явилась их независимость от источников энергии. Процесс не требовал глюкозы, фосфоэнолпирувата, АТФ, ІЩФ, других нуклеотидфосфа-тов, не был чувствителен к ингибиторам метаболизма - азиду, 2,4-данитрофенолу, которые иыгибировали транспорт в сфероплас-ты (Boiler et al., 1975; Schwencke, de Robischon-Szulmajster, 1976; Hagy, 1978), Подобная система охарактеризована для транспорта в вакуоли растений малата (Busser-Sutter et al., 1982), а также различных Сахаров (Thorn et al,, 1982). Авторы (Thom et al., 1982) предположили, что в процессе выделения вакуолей произошло нарушение сопряжения между процессами транспорта и энергизации мембраны. То, что процесс транспорта в вакуоли не требовал энергии, объясняется по крайней мере для аргинина и аденозина тем, что в этих работах (Boiler et al., 1975; Hagy, 1978) наблюдалось не накопление этих субстратов, а эквивалентный обмен содержащихся в вакуолях аргинина и аденозина на аргинин и аденозин, добавленные извне. Естественно, что для такого процесса, не связанного с накоплением веществ против градиента концентрации, энергия не требуется. Для s-аденозил-і-метионина такой обмен не был обнаружен, однако авторы предполагают, что он обменивается на какой-либо другой внутривакуолярный компонент (Schwencke, de Robischon-Szulmajster, 1976). Несмотря на то, что в этих работах исследовалось не накопление веществ в вакуоли, как таковое, а процесс обмена, Матилем на основании полученных данных было сделано предположение об отсутствии прямой зависимости транспорта в вакуоли от метаболической энергии (Matile, 1978). Было предположено, что основным механизмом транспорта аргинина в вакуоль является облегченная диффузия благодаря переносчику, а удерживание аргинина осуществляется за счет комплексообразования с поли 32 фосфатами (Durr et al., 1979; Matile, 1978). Это предположение было подкреплено модельными опытами, в которых полифосфаты, помещенные внутрь диализного мешка, концентрировали аргинин, создавая кажущийся градиент этой аминокислоты 1:300 (Durr et al,, 1979). В пользу такого предположения говорило и то, что вакуоли дрожжей, выросших на аргинине и концентрирующих его в вакуолях, содержат в 3 раза больше полифосфатов, чем дрожжи, выращенные на сульфаты аммония (Durr et al., 1979). В некоторых условиях удавалось наблюдать корреляцию накопления и использования аргинина и полифосфатов у дрожжей (Durr et al., 1979). Однако в дальнейшем группой Дэвиса была показана неза-висимость,метаболизма аргинина и полифосфатов yH.crassa (Cramer et al., 1980) % Более того, в работе на целых клетках H.cras-sa (Drainas, Weiss, 1982) показано, ЧТО ЄСЛИ ДЛЯ сохранения аргининового пула в вакуолях энергия не требуется, то для накопления его в вакуолях энергия необходима. Так, при переносе с дефицитной среды на среду богатую аргинином, когда в контроле аргинин накапливается в вакуолях, воздействие разобщителей и ингибиторов гликолиза приводит к тому, что вакуэли теряют способность накапливать аргинин (Drainas, Weiss, 1 982).
АТФаза вакуолей - электрогенная БГ-транслоказа
Н+-АТФаза - это "липопротеидный комплекс, гидролизующий АТФ , сопряженно с трансмембранным переносом водородных ионов против их электрохимического градиента" (Скулачев, Козлов, 1977). В настоящее время получены данные о том, что вакуоляр-ная АТФаза способна осуществлять такой процесс, причем протоны транслоцируются внутрь вакуоли. Так, вакуоли гевеи имеют рН вакуолярного сока 5,5-6,0, тогда как рН внешней среды 7,0-7,5 (Marin et al., 198Іб). В условиях эксперимента ДрН, кислый внутри вакуоли и равный 0,9 ед, возрастал при добавлении Mg АТФ до 1,4 ед. Исходный потенциал на мембране вакуолей - 120mv при добавлении Mg АТФ сдвигался на 60 mv в положительную сторону (Marin et al., I98I6). Mg2+, Mg ДЦФ не вызывали такого изменения. Протонофор ФКФ, а также ионофор A23I87 в присутст-вии Са предотвращали действие Mg АТФ на ДрН и мембранный потенциал. Таким образом, АТФаза вакуолей работает как элект-рогенный протонный насос (Marin et al., I98I6). Аналогичные исследования проведены на везикулах тонопласта из этого растения (Marin, 1983).
Добавление Mg АТФ к везикулам вакуолярной мембраны также приводило к изменению ДрН от 0,6 до 0,9 ед, a Eg от - 175 mv 1 до - 25 mv. Процесс не ингибировался олигомицином, ванадатом, диэтилстильбестролом, не действующими на АТФазу этих мембран, но ингибировался ДЦКД, который блокирует АТФазу, и полностью ингибировался ФКФ. рН-зависимость изменения дрН и 1 при добавлении Mg АТФ совпадала с рН-зависшлостью гидролиза АТФ (Marin , 19836). Показано существование АТФ-зависимого протонного насоса на везикулах тонопласта ИЗ Saccharomyces cerevisiae (Kakinuma et al., 1981). Для этого авторы приводят три группы доказательств: АТФазная активность везикул стимулируется в 1,5-3 раза протонофором SF 6847, а также нигерицином, обменивающим Н+ на К+, следовательно, градиент протонов является продуктом АТФазной реакции и блокирует ее по принципу обратной связи (протонный контроль АТФазы). Более прямым доказательством того, что АТФаза формирует дрН, кислый внутри везикул, являются опыты по гашению флуоресценции квинакрина. При добавлении Kg АТФ происходит гашение флуоресценции, при добавлении SP 6847, разрушающего протонный градиент, флуоресценция возвращается к прежнему уровню. Добавление Мр ДЦФ не вызывает гашения флуоресценции: 100 мкМ ДЦКД, ингибирующие АТФазу, предотвращают гашение флуоресценции (Kakinuma et al., 1981), Наконец, по распределению С метиламина, и С sen" были измерены ДрН=1,7 ед, кислый внутри везикул, и %=75 mv, положительный внутри, что составляет Л/ИН+=+180ту. В этой работе не была определена субстратная специфичность протонного насоса, хотя в вакуолярных мембранах S.cere-viaiae гТФазная активность близка к АТФазной (Kakinuma et al., 1981). В настоящее время показано (rOkorokov,iLiChko,; 1983), что ГТФаза и УТФаза вакуолей s.carlsbergensis в меньшей степени подвержены протонному контролю, чем АТФаза. УТФ и ГТФ позволяют образовать меньший дрН, чем АТФ, причем при добавлении после них АТФ образуется дополнительный АрН, превышающий исходный по величине. Эти данные не оставляют сомнений в том, что основным протонным насосом вакуолярнои мембраны у дрожжей является АТФаза COkordkov,lLichko, 1983). На вакуолях из клеток сахарного тростника, которые гидролизуют АТФ и ГТФ примерно одинаково, показано, что ь ГТФ мало влияет на мембранный потенциал (1%АТФ вызывает образование Е =20 mv) (Thom, Komor, 1984). Существование электрогенной протонной АТФазы показано также для секреторных гранул животных клеток (Toll et al., 1980; Kanner et al., 1980; Cidon et al., 1983), а также ДЛЯ лизосом этих клеток (P Dell Antone, 1984). Таким образом, в настоящее время можно считать доказанньм, что в вакуолярнои мембране грибов и растении имеется АТФ-аза, выполняющая функцию электрогенного протонного насоса, который за счет энергии гидролиза АТФ создает ДрН более кислый внутри вакуоли, и Е более положительный с внутренней стороны мембраны. Вопрос о том, как энергия создаваемого АТФазой iytfH используется для транспорта различных веществ через вакуолярную мембрану, интенсивно изучается. Следует подчеркнуть, что основные данные по транспортным свойствам вакуолярнои мембраны, ее первичным и вторичным системам транспорта ионов поступали непосредственно в период выполнения данной работы. Часть вопросов, поставленных во введении в качестве экспериментальных задач была решена параллельно как в настоящей работе, так и в исследованиях других авторов. Постановка этих задач определялась тем, что к началу работы вопрос о существовании АТФазы в вакуолях не был решен. Для создания представления о настоящем состоянии проблемы в обзоре литературы рассмотрены данные последних лет, к которым будет еще необходимо вернуться при обсуждении результатов работы.
