Введение к работе
Актуальность проблемы. Митохондрии в клетках высших эукариот, помимо их известной роли в энергизации клетки и общем клеточном обмене, играют решающую роль в выборе клетки между жизнью и смертью (апоптозом). Апоптоз - это генетически запрограммированный, четко отрегулированный, высококоординированный механизм гибели клеток, направленный на удаление невостребованных, поврежденных, инфицированных, ослабленных, закончивших свой жизненный цикл, потенциально опасных клеток. Согласно рекомендации Номенклатурной комиссии по клеточной гибели (2009), этот вид клеточной смерти отличается от других (некроз, аутофагия, митотическая катастрофа) набором характерных морфологических и биохимических признаков. Интерес к апоптозу огромен, поскольку, по крайней мере, в клетках животных, он выполняет множество функций, от созидательных (морфогенез, онтогенез, антираковая защита и т. д.) до разрушительных (сепсис, инфаркт миокарда, инсульт, нейродегенеративные заболевания и т. д.).
До относительно недавнего времени полагали, что апоптоз свойственен лишь высшим многоклеточным, поскольку считалось, что одноклеточные организмы не имеют в своем геноме генов, аналогичных тем, которые кодируют апоптотические факторы многоклеточных и поскольку существовал скептицизм относительно физиологической целесообразности и эволюционных преимуществ апоптоза у одноклеточных, в том числе и дрожжей. Однако сейчас установлено, что дрожжи в природе живут в виде сообществ (колонии, биопленки). Известны вещества (ароматические спирты), ответственные за коммуникацию клеток. Описаны многочисленные случаи гибели (в основном исследования проводились на дрожжах S. cerevisiae) по механизму апоптоза под действием различных неблагоприятных внешних факторов и внутриклеточных дефектов. Выявлен ряд апоптотических факторов, некоторые из которых (эндонуклеаза G, цитохром с, белок, подобный протеазе HtrA) локализованы, как и в митохондриях животных, в межмембранном пространстве и выход которых при повреждении внешней мембраны означает начало необратимой стадии апоптоза, приводящей в конечном итоге к гибели клетки. Однако вопрос - каким образом осуществляется выход апоптотических факторов из дрожжевых митохондрий до недавнего времени не имел ответа. Для митохондрий животных известны два основных пути выхода апоптотических факторов из межмембранного пространства. Один из них включает в себя активацию, конформационную перестройку, встраивание во внешнюю мембрану митохондрий и димеризацию проапоптотического белка Вах, члена семейства белков Вс1-2, в результате чего образуется пора [Sheridan et al., 2008; Yamaguchi et al., 2008]. Другим механизмом выхода
апоптотических факторов из митохондрий является увеличение проницаемости митохондрий в результате открытия ряда пор во внутренней митохондриальной мембране:
1) неспецифической, Са /Рн-зависимой, циклоспорин А (ЦсА)-чувствительной поры,
мегаканала диаметром 2,6-2,9 нм, способного пропускать вещества с молекулярной массой до
1,5 кДа [см. Bernardi et al, 2006];
2) ЦсА-нечувствительной небелковой поры, образующейся при одновременном
добавлении к митохондриям Са и насыщенных жирных кислот и отличающейся от
классической Са /Рн-зависимой поры отсутствием специфичности по отношению к
дивалентным катионам и способностью спонтанно закрываться [Mironova et al., 2001; Sultan
and Sokolove, 2001];
3) ЦсА-чувствительной поры, индуцируемой высокими концентрациями
неорганического фосфата при кислых значениях рН [Kristian et al, 2001];
4) поры, открываемой в митохондриях животных (и растений) в условиях анаэробиоза
[Chavez et al., 1997; Kuzminova et al., 1998; Virolainen et al., 2002].
Открытие пор ведет к снижению мембранного потенциала, дисфункции митохондрий, нарушению ионного гомеостаза, высокоамплитудному набуханию митохондрий и, как следствие, выходу апоптотических факторов из митохондрий.
Дрожжевые клетки лишены белков семейства Вс1-2 (в геноме не найдены гены, кодирующие эти белки). Практически ничего не известно об участии структурной реорганизации крист в выходе апоптотических факторов из митохондрий. Информация же о возможности индукции неспецифической проницаемости дрожжевых митохондрий до сих пор фрагментарна и противоречива. Известно лишь, что митохондрии S. cerevisiae содержат неспецифическую пору (канал) [Prieto et al, 1992; 1995; 1996; Roucou et al., 1997; Manon et al., 1998; Manon and Guerin, 1998; Gutierrez-Aguilar et al, 2007], закрываемую при дефиците ATP. Она имеет примерно те же размеры [Manon and Guerin, 1998], что и неспецифическая, Са /Рн-зависимая, ЦсА-чувствительная пора млекопитающих и ей приписываются те же функции. В последнее время в нашей лаборатории было показано, что в митохондриях дрожжей Dipodascus (ранее Endomyces) magnusii не индуцируется Са2+/Рн-зависимая, ЦсА-чувствительная пора [Дерябина и др., 2004], а митохондрии Yarrowia lipolytica лишены всех Са +-зависимых пор [Kovaleva et al, 2009; Ковалева и др., 2010].
Цель работы. Работа направлена на поиск условий индукции неспецифической проницаемости внутренней митохондриальной мембраны дрожжей Dipodascus magnusii. Выбор объекта исследования не случаен. Дрожжи D. magnusii, в отличие от дрожжей S. cerevisiae, характеризуются ярко выраженным аэробным типом обмена, содержат
многочисленные, хорошо структурированные митохондрии и полноценную дыхательную цепь со всеми тремя пунктами энергетического обмена, напоминающую по своей структуре дыхательную цепь млекопитающих.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
Исследовать возможность индукции: а) классической Са -фосфат-зависимой, ЦсА-чувствительной поры; б) ЦсА-нечувствительной поры, индуцируемой низкими концентрациями Са и жирных кислот; в) поры, индуцируемой анаэробиозом; г) поры, запускаемой окислительным стрессом;
Исследовать возможность функционирования АТР-зависимого К -канала.
Научная новизна. На прочно-сопряженных митохондриях дрожжей D. magnusii впервые проверены все условия индукции проницаемости внутренней митохондриальной мембраны, известные для митохондрий животных. Показано, что в митохондриях D. magnusii не индуцируется ни Са -фосфат-зависимая, циклоспорин А-чувствительная пора, ни циклоспорин А-нечувствительная пора, открываемая в митохондриях животных при одновременном добавлении Са и жирных кислот. В отличие от митохондрий животных и растений, анаэробиоз не индуцировал повышенную проницаемость внутренней митохондриальной мембраны дрожжей D. magnusii. Впервые показана АТР-зависимая энергизация дрожжевых митохондрий в условиях анаэробиоза. Прооксиданты совместно с Са (в присутствии Са ионофора) - вызывали лишь снижение мембранного потенциала митохондрий дрожжей D. magnusii, без образования мегаканала. Обнаружено «ресопрягающее» действие АТР. Доказано наличие в митохондриях D. magnusii регулируемого К -АТР-зависимого канала, закрываемого, как и в митохондриях животных (и в митохондриях дрожжей Y. lipolytica) при добавлении АТР. В условиях окислительного стресса селективный К -АТР-зависимый канал может превращаться в неспецифическую пору.
Практическое значение работы. Обнаруженное нами сходство АТР-зависимого К -канала (митоКдтр) митохондрий животных и дрожжей D. magnusii позволяет рассматривать дрожжевые митохондрии в качестве перспективной модели для изучения структуры и регуляции активности митоКАТР, которому в настоящее время отводится важная роль в защите миокарда от последствий ишемии и для поиска новых «открывателей» канала.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Всероссийской конференции молодых учёных и II школы «Окисление, окислительный стресс и антиоксиданты» им. Академика Н.М. Эммануэля (2006, Москва); Европейских Биоэнергетических Конференциях (ЕВЕС) (2006, Москва; 2010, Варшава); Конгрессах FEBS
(2007, Вена; 2008, Афины; 2009, Прага); 24-й Международной конференции «Yeast Transport and Energetics» (2006, Прага); 2-м Съезде микологов России с международным участием «Современная микология в России» (2008, Москва); XXII Зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (2010, Москва).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи в рецензируемых журналах, а также 12 тезисов докладов на конференциях.
Объем и структура работы. Работа изложена на 178 страницах печатного текста, содержит 87 рисунков и 3 таблицы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глав), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (глав), выводов и списка цитируемой литературы (333 источника, в том числе 299 на иностранных языках).
