Содержание к диссертации
Введение
3. Обзор литературы 12
3.1. Кинетические характеристики и механизм нуклеозиддифосфаткиназной реакции 12
3.1.1. Кинетические характеристики нуклеозиддифосфаткиназной реакции 12
3.1.2. Роль ионов двухвалентных металлов Л 15
3.1.3. Роль З1 гидроксильной группы рибозы 15
3.1.4. Фосфорилированный интермедиат 16
3.1.5. Природа переходного состояния нуклеозиддифосфаткиназной реакции 17
3.1.6. Альтернативные субстраты и ингибиторы НДФК 18
3.2. Физико-химические свойства изоформ НДФК 19
3.2.1. Гены, кодирующие НДФК 19
3.2.2. Структура НДФК 21
3.2.3. Локализация, молекулярная масса и изоэлектрические точки изоформ НДФК 25
3.2.4. Локализация НДФК в митохондриях 28
3.3. Роль продуктов нуклеозиддифосфаткиназной реакции в метаболизме 30
3.4. Вторичные активности НДФК 31
3.5. Роль НДФК в регуляции внутриклеточных процессов 34
3.5.1. Участие НДФК в регуляции клеточного цикла 35
3.5.2. Участие НДФК/пт23 в регуляции процессов дифференциации 36
3.5.3. Движение и форма клеток 36
3.5.4. Роль НДФК/пт23 в регуляции метастазирования опухолей 37
3.5.5. Ген - мутатор Escherichia coli 38
3.5.6. Участие НДФК в регуляции программируемой клеточной смерти 39
3.5.7. НДФК/пт23, как фактор регуляции экспрессии генов на уровне транскрипции 40
3.5.8. НДФК и сигнальные каскады 41
3.6. Регуляция проницаемости наружной мембраны митохондрий 42
3.7. Представление о функциональных компартмснтах и роли киназ наружного компартмента митохондрий во внутриклеточном транспорте энергии 45
3.7.1. Компартментация метаболитов и функциональное сопряжение, определение понятий 45
3.7.2. Компартментация адениловых нуклеогидов в межмембранном пространстве митохондрий во время активности митохондриальной аденилаткиназы 48
3.7.3. Функциональное сопряжение между активностью митохондриальной креатинкиназы и системой окислительного фосфорилирования 51
3.7.4. Функциональное сопряжение активности киназ, локализованных на внешней поверхности наружной мембраны митохондрий, с окислительным фосфорилированием 54
4.Цели и задачи исследования 56
5.Методы исследования 58
5.1. Материалы 58
5.2. Выделение митохондрий печени крысы методом дифференциального центрифугирования 58
5.3. Полярографический метод регистрации дыхания митохондрий 59
5.4. Определение скорости окислительного фосфорилирования, коэффициента дыхательного контроля и активностей НДФК. гсксокиназы и аденилаткиназы полярографическим методом 59
5.5. Выделение митохондрий по методу Hovius и соавт 60
5.6. Удаление цитохрома с из митохондрий 61
5.7. Исследование локализации нмНДФК в наружном компартменте митохондрий 62
5.8. Влияние различных веществ на солюбилизацию нмНДФК 62
5.9. Определение доли связанной с мембранами активности нмНДФК в ходе хранения препарата митохондрий 63
5.10.Получение препарата митохондрий с низким содержанием нмНДФК 63
5.11.Полярографические эксперименты в присутствии креатинкиназы 64
5.12. Обработка проб после полярографического эксперимента 64
5.13.Определение скорости взаимодействия креатинкиназы с CDP 65
5.14. Определение времени инкубации проб с хлорной кислотой, необходимого для полной инактивации ферментов 65
5.15. Опре деление степени гидролиза креагинфосфата и ЛТР при обработке проб хлорной кислотой 66
5.16.Определение концентрации креатина 66
5.17. Определение концентраций нуіслеотидов, глюкозо-6-фосфата и креатинфосфата 67
5.17.1. . Определение концентрации ADP и CDP 67
5.17.2. Определение концентрации глюкозо-6-фосфата, ATP, СТР и креатинфосфата 67
5.17.3. Определение концентрации ATP, ADP, AMP, СТР, CDP и UDP на основании коэффициентов их молярного поглощения 68
5.17.4. Определение чистоты препаратов ATP, ADP и CDP 68
5.18. Исследование взаимодействия дрожжевой НДФК с мембранами митохондрий 68
5.19. Исследование взаимодействия дрожжевой ГК с мембранами митохондрий 69
5.20.Обращение солюбилизации нмНДФК добавлением Mg 69
5.21.Сравнение взаимодействия протеиназ с пмНДФК, перешедшей в раствор, и с компонентами мембран в местах сё связывания 70
5.22.Влияние рН на прочность взаимодействия нмНДФК с мембранами митохондрий 71
5.23. Обращение солюбилизации нмНДФК изменением рН среды хранения 72
5.24.Влияние пальмитиновой кислоты на прочность взаимодействия нмНДФК с мембранами митохондрий 72
5.2 5. По лучение экстракта белков с поверхности митохондрий для электрофоретических исследований 73
5.26.Спектрофотометрическое определение активности гексокиназы и НДФК в сопряженной ферментной системе 73
5.27.Электрофорез белков, солюбилизироваиных с поверхности митохондрий 74
5.27.1. Деионизация растворов 74
5.27.2. Изоэлектрофокусирование 74
5.27.3. Нативный электрофорез 75
5.27.4. Градиентный электрофорез 76
5.27.5. Окрашивание гелей 76
5.28.Определение концентрации Mg"+ методом комплексонометрпческого титрования 77
5.29.Определение белка митохондрий 77
5.30. Статистическая обработка результатов 77
6. Результаты исследования 78
6.1. Полярографический метод регистрации скорости дыхания митохондрий 78
6.2. Сравнение двух методов выделения митохондрий 82
6.3. Исследование локализации нмНДФК в наружном компартмепте митохондрий 85
6.4. Природа сил взаимодействия нмНДФК с мембранами митохондрий 88
6.5. Изучение функционального сопряжения между активностью нмНДФК наружного компартмента митохондрий и окислительным фосфорилированием 90
6.5.1. Пригодность КК на роль внешней ADP-потребляющей системы 92
6.5.2. Солюбилизация нмНДФК из митохондрий, хранившихся в разных средах 94
6.5.3. Определение времени инактивации ферментов 99
6.5.4. Определение степени гидролиза КФ и АТР в ходе инкубации проб полярографического опыта с НСЮ4 100
6.5.5. Оптимизация метода определения креатина 101
6.5.6. Исследование взаимодействия дрожжевой НДФК и дрожжевой ГК с мембранами митохондрий : 103
6.5.7. Полярографические эксперименты в присутствии креатинкиназы 105
6.6. Доля активности нмНДФК, функционально сопряженной с окислительным фосфорилированием 109
6.7. Влияние 10%-ного декстрана на функциональное сопряжение нмНДФК и митохондриальной аденилаткиназы с окислительным фосфорилированием 111
6.8. Обращение солюбилизацин нмНДФК в среде с низкой ионной силой добавлением MgCl2 114
6.9. Сравнение взаимодействия протеиназ с нмНДФК, перешедшей в раствор, и с компонентами мембраны в местах её связывания 118
6.10.Поиск физиологических регуляторов солюбилизацин нмНДФК 121
6.10.1. Влияние рН на прочность взаимодействия нмНДФК с мембранами митохондрий 121
6.10.2. Обратное связывание нмНДФК, солюбилизировавшейся при кислом значении рН 123
6.10.3. Влияние различных веществ на прочность связи нмНДФК с мембранами 127
6.10.4. Влияние голодания и углеводной диеты на солюбилизацию нмНДФК 132
6.11. Исследование однородности нмНДФК наружного компартмента митохондрий 133
6.11.1. Оптимизация метода окрашивания геля по активности НДФК 134
6.11.2. Нативный электрофорез экстракта белков с поверхности митохондрий 136
7. Обсуждение результатов 144
8. Выводы 163
9. Список литературы 164
- Кинетические характеристики нуклеозиддифосфаткиназной реакции
- Регуляция проницаемости наружной мембраны митохондрий
- Выделение митохондрий печени крысы методом дифференциального центрифугирования
- Сравнение двух методов выделения митохондрий
Введение к работе
В физиологических условиях нуклеозиддифосфаткиназа (ЕС 2.7.4.6, НДФК) катализирует реакции синтеза различных нуклеозидтрифосфатов из ЛТР и соответствующих нуклеозиддпфосфатов. Эти нуклеозидтрифосфаты служат непосредственным источником энергии для основных анаболических процессов: UTP участвует в синтезе гликогена, GTP - белков, СТР - фосфолипидов [564]. Кроме того, синтезированные ферментом нуклеозидтрифосфаты необходимы для построения молекул ДНК и РНК. Как следствие, НДФК принадлежит одна из центральных ролей в обеспечении нормальной жизнедеятельности живых организмов.
Другой замечательной особенностью НДФК является то, что фермент обладает регуляторными свойствами. Показано, что каталитическая и регуляторная функции могут осуществляться независимо одна от другої! [163. 194, 505, 550, 5581. В настоящее время известно, что НДФК участвует в регуляции таких важных процессов как клеточный цикл [316], подвижность клеток [100, 558], дифференциация клеток и тканей [265], метастазирование опухолей [200] и апоптоз [86, 252, 455]. Имеющиеся данные позволяют предположить, что регуляторные свойства НДФК в значительной степени обусловлены ее способностью проявлять активность протеинкиназы и 3 - - 5 экзонуклеазы, а также образовывать комплексы со многими внутриклеточными белками и таким образом изменять свойства последних. Изучение этих механизмов регуляции представляет интерес не только для фундаментальной науки, но и для медицины.
В тканях человека обнаружены 8 изоформ НДФК. Они различаются внутриклеточной локализацией и тканевой специфичностью [285]. Обилие изоформ НДФК и их разная внутриклеточная локализация позволяют предположить, что каждая изоформа выполняет в клетке специфическую функцию, и внутриклеточная локализация принципиально важна для выполнения этой функции [285].
В клетках печени НДФК локализована в цитоплазме, а также связана с мембранами [266, 460]. В митохондриях гепатоцитов фермент был найден в наружном компартменте и в матриксе [234, 364]. В то время как физиологическая роль НДФК матрикса достаточно ясна [234, 343, 364], специфические функции НДФК наружного компартмента до сих пор не известны, хотя в митохондриях печени активность этой НДФК достаточна для того, чтобы обеспечить близкую к максимальной скорость окислительного фосфорилирования [234, 399, 567]. Этот факт сам по себе свидетельствует о важной роли НДФК наружного компартмента.
В нашей лаборатории было показано, что в митохондриях печени крысы вся НДФК наружного компартмента (нмНДФК) локализована на внешней поверхности наружной мембраны [567]. Природа сил взаимодействия нмНДФК с мембранами митохондрий до сих пор не изучена.
Известно, что важнейшей функцией митохондрий в нормально функционирующих клетках является обеспечение клеток энергией. Однако наружная мембрана митохондрий представляет собой диффузионный барьер для заряженных молекул [38, 424, 439, 500]. Поскольку концентрация свободного ADP в цитоплазме клеток очень низка ( 30 мкМ) [471, 502], потенциально наружная мембрана митохондрий могла бы лимитировать скорость внутриклеточного транспорта энергии.
Имеющиеся литературные данные свидетельствуют о том, что низкая проницаемость наружной мембраны для ADP в значительной степени преодолевается благодаря возникновению так называемого функционального сопряжения между активностью киназ наружного компартмента митохондрий и системой окислительного фосфорилирования. Показано, что в функциональном сопряжении участвуют ферменты межмембранного пространства митохондрий - креатинкиназа и аденилаткиназа [151, 235, 296]. а также ферменты, связанные на внешней поверхности наружной мембраны митохондрий - гексокиназа и глицеринкиназа [44, 77, 298, 386, 453, 534, 535]. Благодаря возникновению функционального сопряжения часть ADP, образованного в указанных киназных реакциях, прямо переносится в матрикс митохондрий, минуя стадию смешивания с ADP среды.
Митохондрии печени не содержат креатинкиназу, а активности гексокиназы и глицеринкиназы в них ничтожно малы по сравнению с активностью нмНДФК [251, 527]. В связи с этим выявление возможности участия нмНДФК митохондрий печени в функциональном сопряжении с системой окислительного фосфорилирования представляется актуальной задачей. Как уже было сказано, изоформы НДФК участвуют в регуляции многих внутриклеточных процессов. Некоторые из этих процессов (например, злокачественный рост, апоптоз) протекают с участием ферментов, связанных с наружной митохондриальной мембраной. нмНДФК может быть одним из регуляторов этих процессов. Нельзя также исключить участие нмНДФК в регуляции и других процессов, протекающих на поверхности наружной мембраны митохондрий. Очевидно, что солюбилизация фермента должна изменять его регуляторныс свойства. До настоящего времени в литературе нет данных о природе сил взаимодействия нмНДФК с мембранами митохондрий, а также о возможности обратимой солюбилизации фермента. Выяснение этих вопросов является необходимой предпосылкой для изучения регуляторных свойств нмНДФК.
Кинетические характеристики нуклеозиддифосфаткиназной реакции
Впервые фермент, катализирующий обратимую реакцию трансфосфорилирования между нуклеозидтрифосфатами и нуклеозиддифосфатами, выделили в 1953 г. Krcbs и Hems из мышц и слизистой оболочки кишечника свиньи [277]. В этом же году Berg и Joklik обнаружили аналогичный фермент в клетках дрожжей [41] и назвали его «нуклеозиддифосфаткиназа» (КФ 2.7.4.6, нуклеозидтрифосфат-нуклеозиддифосфаттрансфосфорилаза). Спустя недолгое время после открытия было показано, что этот фермент обладает широкой субстратной специфичностью по отношению к большинству рибо- и дезоксирибонуклеозидди- и три-фосфатов, а таюке, что скорость нуклеозиддифосфаткиназной реакции зависит от природы субстратов [164. 165, 357, 365. 399, 419]. В 60-х годах при изучении стационарной кинетики НДФК, выделенной из разных источников, было установлено, что нуклеозиддифосфаткиназная реакция идёт по механизму пинг-понг [89, 148, 165, 357]. Истинными субстратами НДФК являются комплексы нуклеозидди- и три- фосфатов с ионами Mg [165]. НДФК катализирует реакцию переноса терминальной (у) фосфатной группы от 5 -трифосфатнуклеозидов на 5 -дифосфатнуклеозиды [362]. Нуклеозидтрифосфаты связываются со свободным ферментом, а нуклеозиддифосфатьт - с фосфорилированным [292]: Mg-NjTP + Е -+ Mg-N,DP + Е-Р (1а) Mg-NoDP + Е-Р - Mg-N-ЛТ + Е (16) Mg-NiTP + MgN2DP - Mg-N]DP + Mg-N2TP (1) Где Ni и N2 - любые рибо- и дезоксирибонуклеотидьт. Так как реакция, катализируемая НДФК, идёт по механизму пинг-понг, избыток любого из субстратов может её ингибировать. Ингибирующее действие MgNDP и MgNTP объясняется образованием неактивных комплексов фермента с субстратом: Е-MgNDP и Е-Р-MgNTP. Ингибирующее действие субстратов НДФК зависит от их природы и концентрации Mg [90, 164, 165]. К\ для MgADP в 50 раз меньше, чем К\ дляМАТР[165,362].
Ингибирующего действия избытка NDP трудно избежать, так как Km vp и ,NDP имеют близкие значения [292]. Ингибирование реакции субстратами и продуктами затрудняет точное определение кинетических параметров нуклеозиддифосфаткиназной реакции, так как Кт для любого субстрата зависит от концентрации второго участника реакции. Кажущиеся величины констант Михаэлиса для НДФК из разных источников представлены в табл. 1. Из таблицы видно, что величины Кт различаются в широких пределах (например. Кт для АТР различаются на порядок). Такой разброс величин нельзя объяснить только большой погрешностью измерений. В зависимости от источника получения фермента, тканевой специфичности и внутриклеточной локализации НДФК обладает разными кинетическими параметрами. Эти различия, вероятно, имеют большое значение для специфических функций НДФК, и обусловлены тем, что фермент приспособлен к специфическим условиям метаболизма в разных тканях. Величина константы равновесия реакции фосфорилирования (1а), равная обратной величине константы равновесия реакции (16), определена в ряде работ, как: 0,188 [148], 0,26 [293]. 0,59 [438], 0,19 [112], 0,61 [451]. Величина Vmax обычно варьирует между 300 и 2000 единиц активности/мг, а /с имеет величину порядка 100-600 с1 [292].
Deville-Bonne и соавт. [112] показали, что фосфорилирование НДФК приводит к уменьшению флуоресценции входящего в состав фермента триптофана, и на основании этого разработали подход к изучению пред стационарной кинетики отдельно полу реакций (1а) и (15) в отсутствие второго субстрата. Исследование стационарной кинетики (табл. 1) и предстационарной кинетики [438] нуклеозиддифосфаткиназной реакции, а также калориметрические данные [73] показали, что пуриновые нуклеотиды являются лучшими субстратами для НДФК, чем пиримидиновые. При этом наибольшее сродство НДФК имеет к гуаниловьтм нуклеотидам, а самое низкое - к цитозиновым. Активность НДФК с дезоксирибонуклеотидами несколько ниже, чем с рибонуклеотидами. Таблица 1. Кажущиеся Кт (мМ) для разных субстратов НДФК, выделенной из разных источников
Исследование предстационарной кинетики [438] показало, что лимитирующей стадией нуклеозиддифосфаткиназиой реакции при взаимодействии с нуклеотидами (кроме адениловьтх и гуаншговых) является стадия переноса фосфорильного остатка. При взаимодействии НДФК с гуаниловыми и адениловыми нуклеотидами скорость переноса фосфорильного остатка настолько высока, что лимитируют стадии связывания субстрата и высвобождения продукта, скорость которых определяется скоростью диффузии нуклеотидов.
Для НДФК из разных источников показано, что область оптимума рН для ігуклеозиддифосфаткиназной реакции достаточно широкая (от 7 до 9), активность фермента сохраняется при рН от 5 до 11 [164, 165, 365]. . Роль ионов двухвалентных металлов Присутствие ионов двухвалентных металлов является критическим элементом катализа. Ряд исследователей, изучавших стационарную кинетику нуклеозиддифосфаткиназиой реакции и фосфорилирование фермента при участии [у-32Р]АТР, показали, что в отсутствие Mg"+ НДФК не способна катализировать трансфосфорилирование [92, 164, 165. 362, 365, 406]. Исследование предстационарной кинетики также продемонстрировало необходимость ионов Mg2+ [522]. Рентгсноструктурный анализ показал, что присутствие Mg2+ не является 94 необходимым условием для связывания ADP, но Mg необходим для осуществления переноса остатка фосфорной кислоты с фосфогистидина в активном центре фермента HaADP[533]. Mg"+ является наилучшим катионом для катализа, но он может быть заменён на л і і O- 9-(- 9-1- 9 I катионы других двухвалентных металлов: Mn , Со" , Zn" , Ni , Са" , Fe и даже на Fe3+ в порядке уменьшения степени их эффективности [164, 365, 396]. Высокие концентрации Mg"+ оказывают на НДФК, как и на другие фосфотрансферазы, ингибиругощее действие [164, 165]. Возможное объяснение ингибирующего действия Mg"+ заключается в том, что при высокой концентрации Mg2+ ATP образует комплекс с двумя ионами металла. і
Регуляция проницаемости наружной мембраны митохондрий
Наружная и внутренняя покровная мембраны митохондрий могут формировать контакты, впервые описанные Hackenbrock в 1968 г [187]. Эти контакты являются мобильными структурами, их число зависит от функционального состояния митохондрий [3, 21, 59, 271, 381, 560]. Относительно недавно было показано, что существуют по крайней мере два типа контактных участков, различающихся по фосфолипидному составу [21]. В местах контактов мембран осуществляется транспорт метаболитов и ионов [3, 50, 198, 274, 371], перенос липидов между наружной и внутренней мембранами [468] и транслокация предшественников митохондриальных белков (обзоры [60, 64]). Межмембранные контакты необходимы также для осуществления апоптоза [60, 64].
In vivo объем матрикса может изменяться в зависимости от функционального состояния митохондрий и под влиянием внешних факторов. Этот процесс связан с изменением проницаемости наружной и внутренней покровной митохондриальных мембран [190, 191. 246]. Внутренняя покровная мембрана митохондрий содержит семейство переносчиков, которые избирательно переносят низкомолекулярные вещества в матрикс и из матрикса [279, 393]. Механизмы транспорта основных метаболитов и адениловых нуклеотидов хорошо изучены [279, 393]. Транспорт ADP и АТР осуществляется аденилатным переносчиком, обладающим строгой субстратной специфичностью [269]. Данные, подтверждающие существование переносчиков неадсниловьтх нуклеотидов получены только в последние годы [114, 337]. В настоящее время их свойства не изучены.
Наружная мембрана митохондрий содержит порин, формирующий каналы [439, 464]. У человека известны четыре изоформы порина [52, 53], а у крысы - три [17, 74]. Митохондрии могут содержать на наружной мембране одновременно все изоформы порина [74, 551]. Пориновые каналы распределены по поверхности мембраны неравномерно, большая их часть локализована в местах контактов наружной и внутренней покровной мембран [463], где порин может образовывать комплексы с переносчиками адениловых нуклеотидов [3, 48, 514]. Недавно Goncalves и соавт. показали, что 80% каналов образуют крупные кластеры, а остальные 20% представляют собой единичные каналы или небольшие группы [170]. В настоящее время неизвестно, влияет ли объединение пориновых каналов в кластеры и взаимодействие с переносчиками адениловых нуклеотидов на их проницаемость.
Долгое время считалось, что наружная мембрана, перфорированная пориновыми каналами, выполняет функции молекулярного сита, через отверстия которого могут беспрепятственно проходить растворимые вещества с молекулярной массой меньшей 5 кДа — основные метаболиты и ионы [95, 553]. Однако в последние годы сложилось представление, согласно которому пориновые каналы являются не просто пассивными "молекулярными ситами" митохондрий, а, находясь под контролем различных факторов, сами могут регулировать ионный транспорт, скорость окислительного фосфорилирования и даже определять, должны ли митохондрии идти по пути нормального метаболизма или апоптоза [96, 304, 427, 464].
Механизмы регуляции пориновых каналов изучены мало и, в основном, на моделях, в которых пориновые каналы встроены в искусственные фосфолипидные мембраны [36, 37, 94, 215, 346, 439, 456, 463]. Впервые Schein и Colombini [439] обнаружили, что порин, встроенный в липидный бислой, формирует каналы, характеризующиеся высокой проницаемостью для анионов и более низкой - для катионов. Авторы показали, что при увеличении трансмембранного потенциала до 30-40 мВ, проницаемость пориновых каналов снижается [439], в связи с чем, их назвали погенциалзависимыми анионселективными каналами (VDAC. voltage-dependent-anion-selective channels). Предполагается, что in vivo регуляция пориновых каналов трансмембранным потенциалом может осуществляться в области контактов наружной и внутренней мембран митохондрий [36, 37, 62, 313], однако это предположение до сих пор не получило экспериментальных подтверждений. Позднее появились данные, что функции пориновых каналов, встроенных в липидный бислой, контролируются величиной рН. Так, Shao и соавт. [456] показали, что проводимость пориновых каналов, встроенных в фосфолипидные мембраны, снижается в условиях, когда рН ниже 5.
Имеющиеся в настоящее время данные кристаллографии указывают на то, что регуляция ионной селективности пориновых каналов связана с изменением их конформации [37, 39, 183, 217, 331, 346]. В «открытом» состоянии каналы проницаемы для анионов, тогда как в «закрытом» - для катионов. Предполагается, что, переключаясь между «открытым» и «закрытым» состоянием, пориновые каналы могут коніролировать обмен ATP, ADP и других метаболитов между цитозолем и митохондриями [313, 425]. Показано, что АТР и ADP не могут проходить через пориновые каналы, находящиеся в "закрытом" состоянии [38, 313, 424, 425, 500].
В последние годы показано, что пориновые каналы содержат участки связывания Са2+ [161, 231] и нуклеотидов [545], а также могут взаимодействовать с митохондриальными липи дамп [427], белками цитозоля и наружного компартмента митохондрий [217, 218, 427]. Так, белки Вах и tBid увеличивают размер поры и модулируют зависимость проводимости канала от потенциала [32, 427], а димер тубулина способен эффективно блокировать канал [427]. Есть также данные, что пориновые каналы могут быть фосфорилированы ц-АМР-зависимыми протеинкиназами [40J.
Таким образом, совокупность имеющихся на настоящий момент фактов указывает на то, что проницаемость наружной мембраны митохондрий для основных метаболитов и ионов может иметь ограничения. Это может быть обусловлено существованием примембранных неперемегаиваемых слоев жидкости, белок-белковыми взаимодействиями, конформацией пориновых каналов, а также тем, что число пориновых каналов на наружной мембране митохондрий ограничено и локализованы они неравномерно [37, 157, 170, 463].
Известно, что важнейшей функцией митохондрий в нормально функционирующих клетках является обеспечение клеток энергией. В то же время механизмы, регулирующие транспорт ADP через наружную мембрану митохондрий, недостаточно изучены. Так как концентрация ADP в цитоплазме клеток очень низка ( 30 мкМ) [471, 502], а наружная мембрана митохондрий представляет собой диффузионный барьер для заряженных молекул [38, 424, 439. 500]. потенциально наружная мембрана митохондрий могла бы лимитировать скорость внутриклеточного транспорта энергии. Проблема проницаемости наружной мембраны митохондрий для ADP, по крайней мере частично, разрешается в результате функционального сопряжения между активностью киназ наружного компартмента митохондрий и системы окислительного фосфорилирования.
Выделение митохондрий печени крысы методом дифференциального центрифугирования
Во всех экспериментах все операции в ходе выделения митохондрий, а также их инкубации в разных средах проводили при +2 - +4 кроме специально обозначенных условий. Митохондрии выделяли из печени белых крыс массой 180-270 г, голодавших в течение ночи (16 ч) при свободном доступе к воде. Крысу усыпляли серным эфиром II декапитировали. Вырезанную печень ополаскивали от крови в 0,25 М сахарозе, взвешивали и продавливали через тканевый пресс с диаметром отверстий 1 мм. Во всех экспериментах, кроме серии опытов, описанных в разделе 6.2, использовали среду выделения, содержавшую 0,28 М маннит, 2,1 мМ HEPES, рН 7,4 (среда с низкой ионной силой). Ткань гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в течение 1 мин в 40 мл среды выделения, затем добавляли такой объём среды выделения, чтобы получить 10%-ный гомогенат, и центрифугировали 15 мин в центрифуге J2-21 («Beckman», Австрия) при 2000 об/мин в роторе JA-20. Супериатант (S.0) фильтровали через капроновый фильтр и центрифугировали в течение 10 мин в центрифуге J2-21 при 8000 об/мин. Первый осадок митохондрий (Р.1) после тщательного удаления супернатанта суспендировали (из расчета 2,7 мл на 1 г массы печени) в одной из сред промывания. Суспензию осадка Р.1 центрифугировали 10 мин в центрифуге J2-21 при 10300 об/мин. Супернатант тщательно удаляли. Осадок митохондрий (Р.2) суспендировали в одной из сред хранения до концентрации 60 мг белка митохондрий в 1 мл. Состав сред промывания и хранения указан в тексте и в подписях к рисункам и таблицам. Осмотическая концентрация всех сред промывания и хранения была равна 280 мосМ. Суспензию митохондрий хранили во льду. Время хранения препарата митохондрий считали с момента получения осадка митохондрий Р.2.
Скорость поглощения кислорода митохондриями при окислении сукцината определяли полярографическим методом [77, 131] с помощью полярографа LP 7е («Laboratorni Pristroje Praha», Чехословакия) и закрытого платинового электрода Кларка при 22. Пробы полярографического опыта, объёмом 1,0 мл, интенсивно перемешивали на магнитной мешалке. Основная среда инкубации полярографического опыта содержала 85 мМ КС1, ПО мМ маннит, 0,1 мМ ЭГТА, 20 мМ Tris-HCl, рН 7,4, 5 мМ фосфат калия, 3 мМ MgCl2. 5 мМ сукцинат калия. Дополнительные компоненты указаны в тексте, подписях к рисункам и таблицам. Считали, что концентрация растворенного кислорода в основной среде инкубации при 22 равна 290 мкМ [563].
Определение скорости окислительного фосфорилирования. коэффициента дыхательного контроля и активностей НДФК. гексокиназы и аденилаткиназы полярографическим методом Реакцию начинали добавлением 10-20 мкл суспензии осадка митохондрий (0,9-1.2 мг белка) в полярографическую ячейку и регистрировали скорость дыхания с митохондрий (st4 ) (рис. 5, а). Находили скорость фосфорилирующего дыхания в нг-ат. О/мин на 1мг белка (V) как разность скоростей дыхания сразу после добавления 170 мкМ ADP (st3ADP) и после того, как весь ADP был фосфорилирован (st4ADP) (рис. 5, а). Скорость окислительного фосфорилирования находили, умножая скорость фосфорилирующего дыхания на отношение ADP/O, которое при окислении сукцината равно 2. Коэффициент дыхательного контроля (ДК) определяли как отношение скорости дыхания митохондрий в st3ADP к скорости в st4ADP (рис. 5, а) \11, 131]. Активность НДФК, дрожжевой гексокиназы (дГК) и митохондриальной аденилаткиназы находили, умножая скорость фосфорилирующего дыхания во время активности киназы (У т, Ї/ГК и Ушр соответственно) на отношение ADP/O. FNDP, V и V находили, как разность скоростей дыхания во время активности киназы (для НДФК в st3CDP на рис. 5, а) и в st4ADP, или, если перед началом киназной реакции не добавляли ADP, в st4k. В большинстве экспериментов активности нмНДФК, а также дГК и мАК характеризовали процентным отношением скорости фосфорилирующего дыхания во время активности соответствующего фермента (V р, Р или 1 соответственно) к скорости фосфорилирующего дыхания после добавления 170 мкМ ADP (V 9). Считали, что в пределах одной полярографической пробы отношение ADP/O остаётся неизменным, поэтому найденная таким образом относительная скорость фосфорилирующего дыхания равна процентному отношению активности киназы к скорости окислительного фосфорилирования в данной пробе. На наш взгляд, такое представление результатов, имея в виду функциональное сопряжение, более информативно, чем просто представление активности ферментов; кроме того, оно позволяет сравнивать результаты разных экспериментов и активности разных киназ. Отношение не зависит от концентрации белка в пробах, что позволило нам сравнивать результаты даже в тех случаях, когда определение белка в некоторых суспензиях митохондрий было затруднено из-за его низкой концентрации. В то же время активности НДФК, дГК и мАК могут быть рассчитаны путём умножения скоростей окислительного фосфорилирования в присутствии 170 мкМ ADP на величину относительной скорости фосфорилирующего дыхания в присутствии субстратов указанных киназ.
Среда инкубации полярографического опыта дополнительно содержала: при определении активности НДФК - 1 мМ АТР. когда в качестве субстрата использовали CDP; или 300 мкМ АТР, если в качестве субстрата использовали UDP; при определении активности дГК - 1 мМ АТР и 5 мМ глюкозы; при определении активности мАК - 7,4 - 9,6 мкМ АР5А и 1 мМ АТР. Киназную реакцию начинали добавлением 600 мкМ CDP. 300 мкМ UDP, дГК или 250 - 400 мкМ AMP, соответственно. Выделение митохондрий по методу Hovius и соавт.
Среда выделения содержала 250 мМ маннит, 0,5 мМ ЭГТА, 5 мМ HEPES, рН 7,4 и 0,1% iyv/v) БСА [220]. Печень, продавленную через тканевый пресс, гомогенизировали в среде выделения. Гомогенат делили на две равные части. Из одной части митохондрии выделяли, как описано в разделе 5.2, при этом использовали среды промывания и хранения митохондрий того же состава, что и среда выделения. Из другой части митохондрии выделяли методом, описанным Hovius и соавт. [220]. При выделении митохондрий по методу, описанному Hovius и соавт., гомогенат центрифугировали 5 мин в центрифуге J2-21 при 2200 об/мин. Супернатант S.0, не фильтруя, вновь центрифугировали 10 мин в центрифуге J2-21 при 9500 об/мин. Полученный осадок митохондрий Р.1 тщательно освобождали от супернатанта и суспендировали в 2,5 мл среды выделения. Затем в два центрифужных стакана вносили по 9,5 мл среды, содержащей 30% (v/v) перколл, 225 мМ маннит. 1 мМ ЭГТА, 25 мМ HEPES, рН 7,4 и 0,1% (w/v) БСА; сверху аккуратно наслаивали по -1,5 мл суспензии митохондрий Р.1 и центрифугировали 30 мин в ультрацентрифуге L5-50 («Beckman». Австрия) при 23000 об/мин в роторе SW-40 без торможения. Митохондрии (Р.2), сконцентрированные узким слоем в нижней части стаканов, отбирали, добавляли к ним 20 мл среды выделения, перемешивали и центрифугировали 10 мин в центрифуге J2-21 при 7000 об/мин. Осадок митохондрий Р.З суспендировали в 16 мл среды выделения и вновь центрифугировали в тех же условиях. Окончательный осадок митохондрий Р.4 суспендировали в среде выделения до концентрации 60 мг белка митохондрий в 1 мл.
Сравнение двух методов выделения митохондрий
Чувствительным показателем функционального состояния митохондрий и их структурной целостности является коэффициент дыхательного контроля, определяемый как отношение скорости дыхания митохондрий в состоянии 3 по Chance (st3AUP) к скорости дыхания в состоянии 4 (st4ADP) (рис. 5, а) [77, 131, 242]. Во многих работах (например [444]) было показано, что повреждение наружной мембраны митохондрий сопровождается падением величины коэффициента дыхательного контроля (ДК). При повреждении внутренней мембраны митохондрии полностью и необратимо утрачивают дыхательный контроль. Это означает, что ADP больше не вызывает стимуляцию дыхания митохондрий. При этом коэффициент ДК становится равным 1. Коэффициент ДК является также хорошим показателем чистоты препарата митохондрий. Так как все другие клеточные и внутриклеточные мембраны обладают АТР-азной активностью, но не потребляют кислород, наличие их примесей в препарате митохондрий приводит к увеличению скорости дыхания в состоянии st4ADP (так как АТР-азы гидролизуют АТР) и снижению величины коэффициента ДК. Считается, что препарат митохондрий достаточно чистый и митохондрии в нём находятся в хорошем функциональном состоянии («прочно сопряжены») при величине ДК выше 3 (при дыхании на сукцинате) [77, 131, 242].
Из табл. 4 видно, что значения коэффициента ДК обоих препаратов митохондрий достоверно не различались и не снижались в ходе 8 ч хранения. Если бы препараты митохондрий содержали примесные мембраны, обладающие АТР-азной активностью, то в присутствии 1 мМ АТР мы зарегистрировали бы снижение коэффициента ДК. Из табл. 4 видно, что в присутствии АТР в обоих препаратах митохондрий коэффициент ДК не снижался. Это свидетельствует о том, что «короткий» метод позволяет получить такой же чистый препарат «прочно сопряженных» митохондрий, как и метод Hovius и соавт. [220].
В митохондриях, полученных по методу Hovius и соавт. [220], процентное отношение V D?IVA было ниже, чем в митохондриях, выделенных «коротким» методом. В исследованиях, проведенных в нашей лаборатории ранее [567], было продемонстрировано, что загрязнение препарата митохондрий, выделенных «коротким» методом, цитоплазматической НДФК пренебрежимо мало. Кроме того, известно, что микросомы (которые могут присутствовать в незначительных количествах в обоих препаратах) если и обладают активностью НДФК, то её величина исчезающе мала [82, 234]. Таким образом, регистрируемая в обоих препаратах активность нмНДФК была обусловлена ферментом, ассоциированным с митохондриями. Возможно, повторные промывания митохондрий в ходе получения препарата по методу Hovius и соавт. [220] приводят к солюбилизации части белков, в том числе и нмНДФК, с внешней поверхности наружной мембраны митохондрий. Принимая во внимание всё вышесказанное, в последующих опытах мы выделяли митохондрии «коротким» методом. 6.3. Исследование локализации нмНДФК в наружном компартменте митохондрий
В работе, проведённой ранее в нашей лаборатории, Липская и Плакида [567] обрабатывали митохондрий дигптонином в средах с низкой (сахароза, маннит) и высокой (КС1) ионной силой. Авторы установили, что солюбилизация нмНДФК из наружного компартмента митохондрий сходна с кривой солюбилизации моноаминоксидазы (маркерного фермента наружной мембраны митохондрий), но отличается от кривых солюбилизации аденилаткиназы (маркерного фермента межмембранного пространства) и малатдегидрогеназы (маркерного фермента матрикса митохондрий). С помощью полярографического метода Липская и Плакида [567] также показали, что в ходе хранения митохондрий нмНДФК наружного компартмента может полностью солюбилизироваться, при этом наружная мембрана митохондрий остаётся непроницаема для мАК. Поскольку мАК не связывается с мембранами, и её молекулярная масса (-30 кДа) ниже, чем НДФК ( 100 кДа), непроницаемость наружной мембраны для мАК свидетельствует о том, что она непроницаема и для нмНДФК. Авторы сделали вывод, что вся активность нмНДФК наружного компартмента митохондрий ассоциирована с внешней поверхностью наружной мембраны.
Для того чтобы ещё раз проверить, все ли молекулы НДФК наружного компартмента митохондрий связаны с внешней поверхностью наружной мембраны, мы повторили эксперименты Липской и Плакиды [567] (рис. 7, а). Чтобы проследить, не нарушается ли в ходе эксперимента целостность наружной мембраны митохондрий, мы так же, как Липская и Плакида [567], использовали тест с мАК. В эксперименте, результаты которого представлены на рис. 7, а, суспензию митохондрий Р.1 инкубировали во льду в течение 10 ч. Через определённые промежутки времени из неё отбирали две пробы. Одну сразу добавляли в полярографическую ячейку, а вторую предварительно центрифугировали а затем промывали в 0,15 мМ КС1 для удаления солюбилизировавшейся во время хранения митохондрий нмНДФК и мАК. На рис. 7, а видно, что в ходе 10 ч хранения митохондрий во льду суммарная активность нмНДФК в препарате оставалась постоянной (рис. 7, а, кривая 3), тогда как связанная с мембранами активность нмНДФК снижалась более чем на 90% (рис. 7, а, кривая 4). Мы сделали вывод, что в ходе эксперимента нмНДФК не инактнвировалась, а практически полностью солюбилизировалась с мембран.
