Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Биологический изоморфизм неорганических ионов 10
1.2. Физико-химические свойства Т1+ и его состояние в водных растворах 11
1.3. Ионофоры 14
1.4. Транспорт Т1+ через клеточные мембраны 19
1.4.1. Возбудимые мембраны 19
1.4.1.1. Мышечные клетки 19
1.4.1.2. Нервные клетки 21
1.4.2. Невозбудимые мембраны 22
1.4.2.1. Бактерии 22
1.4.2.2. Водоросли 23
1.4.2.3. Эпителиальные клетки 24
1.4.2.4. Эритроциты 26
1.5. Транспорт ионов калия и его аналогов через внутреннюю мембрану митохондрий 28
1.5.1. Структура митохондрий и характеристики митохондриальных мембран 28
1.5.2. Исследование транспортных механизмов на изолированных митохондриях 30
1.5.3. Циклический транспорт ионов калия через внутреннюю мембрану митохондрий 32
1.5.3.1. Электронейтральный ICVH* обмен 33
1.5.3.2. АТФ-зависимый калиевый канал 36
1.5.3.3. Неселективная пора высокой проводимости 40
1.5.4. Транспорт в митохондриях 41
1.6. Токсичность таллия 44
Глава 2. Материалы и методы исследования 47
2.1. Экспериментальные животные 47
2.2. Химические реактивы 47
2.3. Выделение митохондрий печени крысы 47
2.4. Определение белка по методу Лоури 48
2.5. Измерение скорости потребления кислорода. (дыхательный контроль) 48
2.6. Определение содержания калия в митохондриях 49
2.7. Спектрофотометричесжая оценка изменения объема митохондрий 50
2.8. Радиоизотопный метод исследования транспорта К+иТ1+ 51
2.8.1. Определение величины коэффициентов накопления 204Т1+, 137Cs+ или 86Rb+ 52
2.8.2. Определение констант скоростей однонаправленных потоков 52
2.9. Статистическая обработка полученных результатов 53
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение 55
3.1. Исследование проницаемости внутренней мембраны митохондрий для ионов калия и таллия по методу изменения светорассеяния 55
3.1.1. Влияние анионного состава среды на проницаемость внутренней мембраны митохондрий для ТҐ" и К+ 56
3.1.2. Влияние рН среды па проницаемость внутренней мембраны митохондрий для Т1+ и К+ 61
3.1.3. Транспорт Т1+ и К+ через К-АТФ-зависимые каналы 64
3.2. Транспорт 204Т1 через внутреннюю мембрану митохондрий печени крысы 70
3.2.1. Влияние энергизации на накопление 204Т1+ 70
3.2.2. Влияние состава среды на накопление ТІ* 71
3.2.3. Влияние субстратов окисления на накопление 20ФП митохондриями печени крысы 73
3.2.4. Влияние диффузионного потенциала на транспорт 204Т1+ 74
3.2.5. Влияние рН среды на транспорт Т1+ 76
3.2.6. Влияние ионофоров на энергозависимое накоплениеTl+, Cs+ и Rb+ в митохондриях печени крысы 78
3.3. Заключение 88
Выводы 91
Список литературы 92
- Физико-химические свойства Т1+ и его состояние в водных растворах
- Структура митохондрий и характеристики митохондриальных мембран
- Влияние анионного состава среды на проницаемость внутренней мембраны митохондрий для ТҐ" и К+
- Влияние ионофоров на энергозависимое накоплениеTl+, Cs+ и Rb+ в митохондриях печени крысы
Введение к работе
Согласно современным представлениям (Garlid, Paucek, 2003), мембранный электрический потенциал, генерируемый в процессе электрогенного выброса Н+ протонными помпами, благоприятствует электрофоретическому унипорту как путем диффузии, так: и через специализированные АТФ- чувствительные (Кдтф) каналы. Такой опосредованный обмен К+ на Н+ вызывает защелачивание митохондриального матрикса, которое компенсируется входом неорганического фосфата через симпорт с Н+ (или антипорт с ОН"). Вход солей калия в митохондрии.сопровождается:осмотически связанной водой, приводя к набуханию матрикса, которое, в свою очередь, ограничивается выходом К+ в результате К+/Н+ антипорта, движущей силой которого является: химический градиент Н+ на мембране.
Физиологическая роль системы циклического транспорта К+ в митохондриях, обеспечивающей регуляцию объема этих органелл, получила в последние годы особое внимание в связи с ее возможным вовлечением в, процессы контроля механизмов окислительного фосфорилирования (Garlid, Paucek, 2003) и в развитие некоторых патофизиологических состояний (O'Rourke, 2000; Szewczyk, Wojtczak, 2002).
При исследовании механизмов биологического транспорта К+ достаточно часто используются соли моновалеитного таллия (Т1+), которые близки к ионам калия по величинам кристаллического радиуса, энергии гидратации и подвижности в водных растворах (обзор: Скульский, 1991). Для подтверждения концепции биологического изоморфизма ионов И.А. Скульский начал широко использовать ТІ в качестве аналога К при изучении транспортных и биоэнергетических свойств митохондрий (Скульский, 1977; Skulskii et al., 1978; Скульский и др., 1980; 1984: Saris et al., .1981; Скульский, Глазунов, 1982). На основании полученных результатов был сделан вывод о том, что внутренняя мембрана митохондрий гораздо более проницаема для Т1+, чем для К+ и было высказано предположение о наличии в гидрофобной области этой мембраны катиошюго насоса, способного в присутствии ионофоров транспортировать К+ и ТҐ против электрохимического градиента. Результаты этих работ были получены И.А.Скульским с соавторами в то время, когда в литературе практически отсутствовала информация о наличии во внутренней мембране митохондрий специфических транспортных механизмов для К+. Поэтому вопрос о способности Т1+ проникать в митохондрии посредством путей транспорта К+, несомненно, требует пересмотра с позиции накопленных знаний.
Необходимость изучения механизмов транспорта Т1+ обусловлена также, высокой токсичностью этого элемента (Woods, Fowler, 1986; Mulkey, Oehme, 1993; Zierold, 2000; Leung, Ooi, 2000). Мишенью токсического действия таллия вполне могут быть митохондрии, учитывая сравнительно высокую проницаемость. их внутренней мембраны для ТҐ\
Цель работы и задачи исследования: Цель работы состояла в изучении способности Т1+ использовать для проникновения через,внутреннюю мембрану митохондрий известные в настоящее время пути транспорта К+. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 1.С помощью метода регистрации изменений объема матрикса по светорассеянию дать сравнительную оценку проницаемости внутренней мембраны митохондрий печени крысы для К+ и ТҐ, присутствующих в инкубационной среде в макроконцентрациях.
2. Сравнить влияние таких воздействий, как защелачивание среды и снижение ее осмолярности, на изменения проницаемости митохондриальной мембраны для К+иТ1+.
3. С помощью известных модуляторов митохондриального транспорта К исследовать способность Т1+ имитировать К+ для входа в митохондрии.
4. С помощью метода радиоактивного анализа сравнить проницаемость митохондриальной мембраны для Tl+, Rb+ и Cs+ (как аналогов К+) в отсутствие изменений объема митохондрий. Научная новизна работы: Впервые в рамках одной работы проведено систематическое сравнительное исследование путей транспорта Т1+ и К+ в митохондриях. Показано, что Т1+, в дополнение к более высокой по сравнению с К+ способностью пассивно проникать через внутреннюю мембрану митохондрий печени крысы, может входить в матрикс через Кдтф- каналы и участвовать в обменном процессе, осуществляемом К+/Н+-антипортером. Обнаружено, что Т1+, подобно К+, может проникать в митохондрии при индукции открытия неселективной поры высокой проводимости во внутренней мембране; при этом относительный вклад поры в проницаемость К+ и Т1+ практически одинаков.
Теоретическое и практическое значение работы: Результаты работы и их. обсуждение дают возможность произвести переоценку накопленных в литературе сведений о путях транспорта ТІ в митохондрии с точки зрения современных представлений о механизмах митохондриального транспорта К+. Данные, полученные в работе, подтверждают концепцию биологического изоморфизма ионов (Скульский, 1991), согласно которой ионы, близкие по физико-химическим свойствам, способны в определенной степени замещать друг друга в организации физиологических функций. Продолжение сравнительных исследований транспорта ионов-аналогов может быть плодотворным для выявления характеристик структур, обеспечивающих функционирование этих механизмов.
Примененный в работе сравнительный подход при исследовании транспорта может быть использован при изучении механизмов токсического действия таллия при поиске путей снижения его токсических эффектов. Основные положения работы, выносимые на защиту:
Внутренняя мембрана изолированных митохондрий печени крысы при всех применявшихся экспериментальных условиях более проницаема для Т1+, чем для К+.
Все известные в настоящее время пути митохондриального транспорта К+ -электрофоретическая диффузия, электрофоретический унипорт через Кдтф- каналы, электронейтральный обмен с участием К+/Н+-антипортера и диффузия через неселективную пору высокой проводимости — могут быть использованы
Т1+ для проникновения через внутреннюю мембрану митохондрий.
3. Ионофоры, нонактин для ТҐ и валиномицин для Cs+, облегчают доступ этих катионов к КАТФ-каналам, находящимся в латентном состоянии в гидрофобной области внутренней мембраны митохондрий, тем самым повышая ее катионную проницаемость.
Апробация работы: Результаты работы были доложены на XI Всероссийском симпозиуме «Мембранный транспорт и: функции клетки», Санкт-Петербург (1994), конференции молодых физиологов и биохимиков России «Биохимические и биофизические механизмы физиологических функций», Санкт-Петербург (1995); на научном семинаре в Университете Хельсинки (1996); FEBS Meeting of Oxidative Phosphorilation, Вагу, Italy (1997); на семинаре отдела биоэнергеники, биомембран и метаболической регуляции Института им.Ненцкого Польской академии наук, Варшава (1998); на XII международном совещании по эволюционной физиологии, Санкт-Петербург (2001). Обсуждение результатов работы происходило на заседаниях Ученого совета, секции молекулярных основ эволюции функций и научных семинаров лаборатории сравнительной биохимии неорганических ионов ИЭФБ РАН (2003, 2004,2005).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методического раздела, результатов и обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на 112 страницах, включает 38 рисунков и 12 таблиц, список литературы составляет 213 источников.
Публикации: Основные результаты по материалам диссертации опубликованы автором в 10 печатных работах.
Физико-химические свойства Т1+ и его состояние в водных растворах
Известно, что Т1+ легко проникает через мембраны некоторых видов бактерий, трудпопроницаемые для К и различающиеся по типу энергообеспечения ионного. транспорта (Скульский и др., 1977). При изучении энергозависимого трансмембранного переноса ТІ против электрохимического градиента в клетки Streptococcus faecalis (за счет энергии гликолиза) и Micrococcus lisodeikticus (за счет энергии окислительного фосфорилирования), было показано, что ТІ вовлекается в систему активного транспорта К . Сравнение кинетических параметров транспорта Т1+ (и Rb+, как аналога К4) у этих бактерий показало, что между системами активного транспорта ТҐ" в клетки обоих видов имеется значительное сходство. У S.faecalis ионы Т1+ аккумулируются в ответ на увеличение мембранного потенциала. Противоградиентный перенос ТҐ и Rb+ в клетки активировался при добавлении глюкозы в среду инкубации. Захват Т1+ клетками был чувствителен к рН среды (оптимум . рН 7,0). Калиевые соли ингибировали накопление Т1+ клетками. Кинетический анализ показал, что ТГ и К+ (Rb+) конкурируют за общие места связывания в системе активного транспорта ионов, но сродство Т1+ к этим центрам связывания в 3-4 раза превышает сродство К+ (Скульский и др., 1977). Напротив, по пассивному выходу ТҐ" и Rb+ из клеток в среду инкубации данные виды бактерий значительно различаются. Период лолувыведения (Т ) микроконцеитраций Т1+ составлял 2-3 мин, a Rb 1" - около 130 минут.
При изучении транспорта ТҐ у бактерий: S.lactis было показано, что Т1+ может накапливаться в клетках за счет энергии калиевого диффузионного потенциала, индуцированного валиномицином (Kashket, 1979). Глюкоза и NaCl стимулируют вход Т1+, а соли калия его ингибируют, как и у S.faecalis. Был сделан вывод, что транспорт ТІ у бактерий "диктуется" кинетикой и энергетикой транспорта К+ (Damper et al., ] 979).
Классическим примером водоросли, клетки которой - обладают системой активного транспорта калия, является черноморская, водоросль Ulva regida. Эта система обладает более высоким сродством к ионам Т1+, чем к К и его аналогам Cs+ и Rb+. Показано, что накопление 204Т1+ клетками водоросли при действии света возрастает в 4 раза по сравнению с темновыми условиями. Это увеличение связано с активацией процессов фотосинтеза, который является основным источником энергии в клетках водоросли. Повышение температуры также вызывает увеличение уровня накопления 204Т1+, что указывает на зависимость транспорта от интенсивности метаболизма (Скульский и др., 1972). Ингибитор гликолиза и фотосинтеза NaF значительно снижает уровень накопления Т1+. Температура и освещенность влияют, главным образом, на константы скоростей входа Т1+, и в меньшей степени, Rb+, и практически не влияют на константы скорости входа Cs+. По константам скоростей входа образуется ряд: Tl+ Rb+ Cs+. Избирательность поступления Т1+ в клетку обусловлена, вероятно, способностью ТІ к ассоциации с анионами и комплексообразованию с активным центром, транспортирующим ионы через мембрану клеток водоросли (Скульский и др., 1972). Другим возможным механизмом накопления ионов Т1+ является обменная диффузия, которая слабо зависит от температуры и от энергетического метаболизма. Вероятно, этот процесс имеет место при понижении температуры до 2С. В этих условиях преобладает пассивное поступление ионов в клетку и определяющим фактором избирательности, по-видимому, является кристаллический радиус катиона. Так, константы скорости входа близких по радиусам ТІ и Rb (1.44 и 1.33 А, соответственно) одинаковы и в 2 раза выше, чем константы скорости входа ионов цезия, обладающего большим радиусом (1.69 А) (Скульский и др., 1972).
Разные области плазматических мембран эпителиальных клеток, в отличие от плазматических мембран эритроцитов, нервных и мышечных клеток, имеют разную селективность для одновалентных катионов. Апикальная мембрана. эпителиальных клеток селективна для Na ; в ней находятся натриевые каналы и переносчики, облегчающие поступление ионов Na+ в цитоплазму. Базолатеральная мембрана обладает высокой избирательностью к К+. В ней расположены калий-селективные каналы и натриевые насосы, выбрасывающие Na+ в межклеточное пространство в обмен на К (Leaf А., 1964).
Влияние Т1+ на NaVK обмен в эпителиальных клетках разных видов животных исследовался рядом авторов. При регистрации однонаправленного транспорта Na+ через кожу лягушки методом тока короткого замыкания было показано (Наточин, Скульский, 1972), что удаление К+ из раствора со стороны базальной мембраны приводит к снижению "натриевого тока" почти до нуля. После добавления К+ или Rb+ в этот раствор транспорт Na+ восстанавливался; Т1+ ингибировал этот процесс необратимо. Минимальная концентрация Т1+, вызывающая полное прекращение трансэпителиального переноса Na+, составила 0.5-1 мМ (Скульский и др., 1980). С помощью цитохимических методов на коже лягушки было показано (Скульский и др., 1982), что мишенью для токсического действия ТІ являются митохондрии, которые подвергаются набуханию и деструкции. При этом подавлялась активность сукцинатдегидрогеназы и о кетоглутаратдегидрогеназы (на 70-80%) и Ка,К-АТФазы (на 20-30%). При. добавлении Т1+ в конечной концентрации 1 мМ в раствор со стороны серозы происходило ингибирование тока короткого замыкания. Отмывка кожи от Т1+ не восстанавливала однонаправленный транспорт Na+, хотя ингибирование Na,K-АТФазы таллием не было обнаружено. Более того, оказалось, что, как ив других объектах, Т1+ замещает К+ при активации Na,K-ATOa3H в коже лягушки. Авторами было высказано предположение о том, что гидролиз АТФ этим ферментом может происходить при отсутствии активного транспорта ионов Na+ через эпителиальный слой. Для гидролиза АТФ достаточно присутствия ионов ТІ , которые более прочно связываются с активным центров фермента, чем ионы К+ при наличии в среде ионов Na+. И, хотя активный транспорт Na+ через кожу лягушки подавлялся полностью, ионный гомеостаз клеток и активность Na,K-насоса сохранялись. По мнению авторов, это свидетельствует о том, что токсический эффект Т1+ связан с угнетением дыхания, а не с изменением проницаемости клеточных мембран (Лапин и др., 1983).
Ингибиторпое действие Т1+ на транспорт Na4 через кожу лягушки было исследовано в работах Зайске и ВанДрисше (Zeiske, Van Driessche, 1983, 1986). Авторами был сделан вывод о том, что как динамика натриевого тока, так и необратимое ингибирование таллием, обусловлены его действием со стороны цитоплазмы. Было высказано предположение о том, что внутриклеточный Т1+, прочно связываясь с SH-группами белков, воздействует на транспортные механизмы в апикальной мембране.
Структура митохондрий и характеристики митохондриальных мембран
Феномен неселективной поры высокой проводимости (НПВП) (mitochondrial permeability transition pore, — в англоязычной литературе) был впервые описан несколько деятилетий назад как массивное набухание митохондрий) происходящее при кальциевой перегрузке митохондриального матрикса, опосредованное, как предполагали, неспецифическим поврежденем внутренней мембраны митохондрий фосфолипазой Кг (Gunter, Pfeiffer, 1990). Исследования, проведенные Понтером и Ховартом (Hunter, Haworth, 1979) и Кромптоном с коллегами (Crompton et al., 1987) показали, что пора представляет собой неселективный Са2+-зависимый канал, пропускающий вещества с молекулярной массой до 1500 Да. В настоящее время известно достаточно много факторов, которые могут выступать в качестве индукторов открытия поры, как то: перегрузка матриксным кальцием (Са ), особенно на фоне окислительного стресса и окисления пиридиновых нуклеотидов, окисление матриксного глутатиона, увеличение концентрации неорганического фосфата и т.д. (Beraardi, 1999). Ингибиторы адениинуклеотидтранслоказы (АНТ), карбоксиатрактилат и бонгкрекат, фиксирующие АНТ по разные стороны внутренней мембраны митохондрий, действуют на пору по-разному: первый - открывает ее, а второй: закрывает.
Начиная с 90х гг. 20 века, в литературе предполагают, что пора может формироваться путем взаимодействия между адениннуклеотидтранслоказой (АНТ) и митохондриальным циклофиллином (CyP-D) (Halestrap, Davidson, 1990). С другой стороны Кромптон с коллегами (Crompton et al., 1987) создали искусственную пору, используя CyP-D и АНТ в комплексе с вольт-зависимым анионным каналом внешней митохондриальной мембраны. Поскольку скорость транспорта протонов через пору очень высока, ее открытие. сопровождается деполяризацией митохондрий и разобщением окислительного фосфорилирования (Crompton, 1999)
Ингибирование циклоспорином (CsA) используют сегодня в качестве идентификационной характеристики НПВП (Novgorodov et.al., 1990; Zoratti, Szabo, 1995). Этот циклический декапептид ингибирует НПВП в субмикромолярных концентрациях (Bernardy et al., 2001), связываясь с сайтами внутренней мембраны митохондрий, с которыми взаимодействует CyP-D (Crompton, 1999). Открытие поры ингибируется аналогами CsA с тем же сродством, с которым они ингибируют пептидил-пролил цис-транс изомеразную активность митохондриального CyP-D. Эти данные, совместно с данными о том, что различные лиганды АНТ могут либо стимулировать, либо ингибировать открытие поры, позволяют предположить, что НПВП формируется в результате Са-пусковых конформационных изменений АНТ, облегчающих ее связывание.с CyP-D (Halestrap et al., 2002). Эта модель способна объяснить принцип действия широкого ранга известных модуляторов НПВП, оказывающих свои эффекты путем изменения сродства связывания АНТ для CyP-D, - Са2+ и адениновых нуклеотидов.
Совсем недавно из митохондрий, печени крысы был выделен потенциал-чувствительный канал, по своим свойствам напоминающий НПВП (French et al„ 2005). Предполагают, что этот изолированный комплекс может представлять собой ион-проводящий модуль этой поры.
Есть данные (Zoratti, Szabo, 1995) о том, что индукция НПВП можеть быть вызвана изменениями матриксного рН. В частности, защелачивание матрикса может приводить к открытию поры, которая характеризуется большим количеством: субпроводящих состояний (Zorov et al, 1992). Существуют доказательства того, что НПВП может находиться в состоянии как высокой, так и низкой проводимости. В состоянии высокой проводимости НПВП может пропускать вещества с молекулярной массой до 1500 кДа (Crompton, 1999). В состоянии низкой проводимости - только Са2+, К+, Н+, но не сахарозу.
Использование ТІ в исследованиях механизмов митохондриального транспорта изначально было обусловлено несколькими причинами (СкульскиЙ, 1991). Во-первых, как уже упоминалось, сравнение кинетических характеристик ионов, близких по своим физико-химическим свойствам (как Т1+ и К+) может помочь при изучении свойств транспортных структур. Во-вторых, в период становления хемиосмотичеекой теории было принципиально важным разработать адекватный метод регистрации электрического потенциала па внутренней мембране митохондрий (Николе, 1985). Для этой цели были специально синтезированы липофильные органические катионы. Однако оказалось, что они способны не только проникать через мембрану, но и связываться с ней, причем степень связывания также зависит от величины мембранного потенциала (Demura et а!,, 1985). В этой связи-на.Т1+ в качестве индикатора мембранного потенциала возлагали большие надежды. И, в-третьих, известная токсичность таллия требовала знания его способности проникать через биологические мембраны.
При исследовании процесса набухания неэнергизованных митохондрий печени крысы в изотоническом растворе KNO3 было показано (Скульский, 1977; Скульский, Глазунов, 1982), что, несмотря на высокую проницаемость внутренней мембраны для NO3", набухание практически не происходит из-за низкой проницаемости мембраны для К+. Набухание резко ускоряется при добавлении валиномицина, индуцирующего калиевую проницаемость. Напротив, в растворах TINO3 набухание митохондрий происходило и без ионофора, что было расценено как свидетельство высокой пассивной проницаемости внутренней мембраны митохондрий для Т1+( Меіпіск, 1976, Скульский и др. 1980).
Известно, что митохондрии способны к энергозависимому накоплению ацетата калия, приводящего к их набуханию (Меіпіск, 1976). Этот процесс также, резко ускоряется при добавлении валиномищша. В растворах ацетата таллия энергозависимое набухание митохондрий без валиномицина происходит гораздо быстрее, чем в растворах ацетата калия в присутствии валиномицина. Было показано (Скульский и др., 1978), что ТІ4" реагирует на изменения мембранного электрического диффузионного потенциала,, индуцированного добавлением валиномицина (либо протонофора) к неэнергизованным митохондриям в бескалиевой среде инкубации. При этом происходило резкое увеличение накопления Т1+ в митохондриях, уменьшающееся по мере разрядки мембраны.
На основании ранних работ, предполагали, что во внутренней мембране митохондрий имеются, по меньшей мере, две системы переноса катионов в обмен на протоны, одна из которых избирательна для Na+, другая - для К+ и Т1+, причем-обмен катион/протон происходит в гидрофобных участках мембраны, труднодоступных для неорганических катионов без специфических ионофоров (Massari, Azzone, 1970; Massari et al, 1972; Douglas, Cockrell, 1977). Было установлено, что Tl+ и Mg + способны ингибировать вход по конкурентному типу (Barrera, Gomez-Puyou, 1975), причем сродство Т1+ к К+-связывающим участкам мембраны в 7-15 превышало сродство к К+ (Oiwan et al., 1979).
И.А.Скульский (1991) высказал предположение о том, что в мембране митохондрий имеются два механизма транспорта Т1+ : (1) некие мембранные структуры, проницаемые для гидрофильного Т1+ и (2) гидрофобные структуры, в которых осуществляется Т1+/Н+-обмен в присутствии ионофора нонактина. При этом предполагалось, что высокие концентрации Т1+ , которые использовались в экспериментах по набуханию (Saris et al.s 1981), индуцируют ТІ /Н+обмен, чего не происходит при низких концентрациях.
Существовали две точки зрения относительно механизма энергозависимого накопления одновалентных катионов в митохондриях. Одни исследователи считали (Mitchell, 1961; Rottenberg, 1973), что при энергизации митохондрий происходит увеличение электрического мембранного потенциала, благодаря чему идет пассивное накопление катионов из внешней среды в направлении электрохимического равновесия. Согласно другой точке зрения (Pressman, 1969; Massari, Pozzan, 1976), энергизация не приводит к существенному изменению мембранного потенциала, а энергозависимое накопление катионов осуществляется благодаря работе мембранных насосов, способных транспортировать катионы против их электрохимического градиента, т.е. по механизму активного транспорта.
Влияние анионного состава среды на проницаемость внутренней мембраны митохондрий для ТҐ" и К+
При исследовании ионной проницаемости внутренней мембраны на суспензии изолированных митохондрий следует иметь в виду, что отмывание физиологических модуляторов мембранной проницаемости в процессе выделения органелл приводит к тому, что значительная доля специфических мембранных каналов и транспортеров может находиться в латентном состоянии. Одним из экспериментальных подходов, направленных на индукцию проницаемости митохондриальной мембраны, является защелачивание инкубационной среды (Azzi, Azzone, 1967; Nichoolls, Lindberg, 1973). Обнаружено, что при рН среды выше 8.0 активируется К+/Н+-антипорт (Bemardi et al., 1989), увеличивается анионная проницаемость мембраны (Beavis, Garlid, 1987) и индуцируется открытие неселективной поры высокой проводимости (Zoratti, Szabo, 1995).
Мы провели сравнительное исследование влияния рН среды инкубации на проницаемость внутренней мембраны дышащих митохондрий для Т1+ и К+ (Рис.17). Как неоднократно упоминалось, внутренняя мембрана нативных (немодифицированных митохондрий) при физиологическом значении рН s 7.2-7.3 практически непроницаема для ионов калия и для большинства неорганических анионов, за исключением SCN" и NO3". Оказалось, что как скорость, так и степень набухания митохондрий в ацетатных солях таллия и калия заметно возрастают при повышении рН в интервале 7.2 - 8.9. При этом митохондрии при инкубации в таллиевой среде набухают в гораздо большей степени, чем в калиевой. Данные, представленные на этом рисунке, свидетельствуюто том, что циклоспорин А частично отменяет стимулирующий эффект повьппения рН на набухание дышащих митохондрий при их инкубации как в калиевой, так ив таллиевой средах. Ингибиторное влияние циклоспорина А на набухание митохондрий в литературе однозначно расценивается как свидетельство открытия неселективной поры высокой проводимости во внутренней мембране (Novgorodov et al., 1990; Zoratti, Szabo, 1995), Таким образом, наши данные указывают па то, что при загцелачивании среды инкубации: стимуляция набухания дышащих митохондрий отчасти связана с индукцией неселективной поры.
Очень существенно, что относительный вклад поры в- общую проницаемость для К4" и Т1+ практически одинаков. В литературе имеются работы, в которых сделан вывод о том, что Т1+, как в высоких (Коротков, Лапин, 2003), так ив низких (Bragadin et al., 2003) концентрациях способен сам по себе индуцировать открытие неселективной поры во внутренней мембране митохондрий печени крысы. Наши данные, полученные с использованием циклоспорина А (Рис. 17), не подтверждают это предположение. В работе группы итальянских исследователей (Bragadin et al., 2003) при использовании ТГ в концентрации 0.2 мМ массивное набухание митохондрий могло быть ассоциировано только с входом в митохондрии сахарозы. Однако, если бы в наших условиях ТІ был способен индуцировать открытие поры такого размера, мы не должны были наблюдать различия в степени набухания как дышащих, так и недышащих митохондрий при их инкубации в таллиевых средах разного анионного состава (Рис. 15 и 16). Возможно, несовпадение результатов, а, как следствие, и выводов, нашей работы с цитированными работами других авторов можно объяснить различиями применявшихся экспериментальных условий.
Из литературных данных известно (Zoratti, Szabo, 1995), что индукция поры во многих случаях вызывается изменениями матриксных рН. В частности, защелачивание матрикса может приводить к открытию поры, которая характеризуется большим количеством субпроводящих состояний (Zorov et al, 1992). Существуют доказательства того, что пора может находиться в состоянии высокой проводимости и в состоянии низкой проводимости. В состоянии высокой проводимости пора может пропускать вещества с молекулярной массой до 1500 кДа (Crompton, 1999). В состоянии низкой проводимости - только Са2+, К " и Н+, но не сахарозу. Таким образом, увеличение скорости набухания дышащих митохондрий при защелачивании среды инкубации частично можно объяснить повышением анионной проницаемости внутренней мембраны митохондрий в результате повышения рН матрикса.
Как следует из данных, представленных на Рис.17, открытие неселективной поры при повышении рН среды объясняет стимуляцию набухания митохондрий лишь отчасти. Для решения вопроса о том, какие еще механизмы могут опосредовать набухание митохондрий в этих условиях, впоследствии мы использовали радиоизотопный метод оценки мембранной проницаемости для Т1+. Результаты этих экспериментов будут представлены и обсуждены при последующем изложении (Рис. 27). 3.1.3. Транспорт Т1+ и КҐ череї К-АТФ-завиеимые каналы
Митохондриальные К-АТФ-зависимые каналы (КАТР-каналы) играют важную роль в клеточной физиологии. Наряду с другими путями транспорта калия, они отвечают за поддержание гомеостаза митохондрий. В отношении этих каналов было известно (Jaburek et al., 1998), что при инкубации свежевыделенных митохондрий в отсутствие Mg и АТФ, по меньшей мере, часть из них находится в открытом состоянии. Поскольку базальная активность КлтФ-каналов в опытах in vitro невелика, для их регистрации приходится использовать специальные приемы. Один из таких приемов был разработан в лаборатории К.Д.Гарлида (Garlid et al., 1992) для доказательства того, что К+ может входить в энергизованные (дышащие) митохондрии печени крысы через КдтФ-каналы. Используя данный метод, эти авторы продемонстрировали АТФ-чувствительные калиевые потоки в митохондриях сердца (Kowaltowski et al., 2001), печени (Hegazy et al., 1991) и мозга (Baigar et al., 2001) крысы.
В наших экспериментах мы воспроизвели, методику Тарлида и соавторов (Garlid et ai., 1992) для сравнительного исследования возможности транспорта Т1+ через КдтФ-каналы с помощью регистрации изменений объема митохондрий по светорассеянию. Для этого использовали среду с пониженной осмолярпостыо, поскольку скорость калиевого уиипорта увеличивается в гипотоничпой среде (Garlid et al., 1992). Сначала мы повторили эксперименты в калиевой среде, чтобы убедиться в воспроизводимости результатов для К в наших экспериментах.
Данные об изменении степени набухания митохондрий в ацетатных средах с калием и таллием представлены на Рис.18 19, соответственно. Транспорт Т1+ в митохондрии изучали в среде, содержащей: митохондрии печени крысы 1 мг белка/мл, Т1-ацетат (25 мМ), ЭГТА (0.1 мМ), трис-ацетат (5 мМ), MgCh(0.1 мМ), ротенон (2 мкг/мг), цитохром С (10 мкМ) и сахарозу (100 мМ), рН 7.4, 25С.
Среда для изучения транспорта калия содержала: КС1 (45 мМ), К-ацетат (25 мМ), ЭГТА (0.1 мМ), трис-ацетат (5 мМ), MgCh (0.1 мМ), ротенон (2 мкг/мг белка), цитохром С (10 мкМ), рН 7.4, 25С [10]. В качестве субстрата окисления использовали аскорбат (2.5 мМ) в присутствии N,N,N ,N evpaMeTiui-n-фенилендиамина (ТМФД, 0.25 мМ).
Влияние ионофоров на энергозависимое накоплениеTl+, Cs+ и Rb+ в митохондриях печени крысы
Для сравнительного исследования транспорта Т1+ и К+ в изолированных митохондриях печени крысы мы использовали два способа оценки мембранной: проницаемости1 - метод- регистрации объема матрикса по изменению светорассеяния и радиоактивный метод определения уровня накопления в митохондрий. В первом случае суспензия митохондрий инкубируется в среде, содержащей исследуемые катионы в макроконцеїпрациях, и объем матрикса изменяется в процессе инкубации. Во втором методе используются микроконцентрации. Т1+ и Cs " и Rb+ (как аналогов К+), поэтому митохондрии сохраняют свой объем практически неизменным. Тем; не менее, результаты, полученные разными методами и в разных условиях, в качественном отношении очень хорошо согласуются.
В своей работе мы параллельно исследовали проницаемость внутренней мембраны для Т1+ и К+ и воспроизвели литературные данные, характеризующие механизмы митохондриалыюго транспорта ионов калия, что дает нам основания для заключения о способности ионов:таллия использовать их при транспорте через внутреннюю мембрану.
Наши результаты, полученные с использованием метода светорассеяния, подтверждают гораздо более высокую пассивную проницаемость мембраны митохондрий для Т1+ по сравнению с К как в присутствии, так и в отсутствие субстратов окисления. Тем не менее, даже на фоне высокой проникающей способности ионов таллия, оказалось возмояшым увеличить ее в эксперименте. В частности, защелачивание среды инкубации приводит к резкому возрастанию как степени набухания неэнергизованных митохондрий, так и уровня накопления ТІ в их матриксе. Поскольку скорость набухания уменьшалась при введении циклоспорина А, часть стимулирующего влияния, но вышениярН среды может быть отнесена на счет индукции открытия неселективной поры высокой проводимости. Как показали данные, полученные с использованием радиоизотопов, вклад в повышение мембранной проницаемости при защелачивании среды вносит также активация KVtT обмена посредством антипортера, ингибируемого хинином. Отметим, что in vivo этот механизм, как принято считать (Garlid, Paucek, 2003), обеспечивает откачку ионов калия из митохондрий. Однако в случае, когда на мембране деэнергизованных митохондрий создается направленный наружу градиент протонов, он может выступать в качестве движущей силы для транспорта К (а, как мы показали, и Т1+) внутрь митохондрий (Bernardi, 1999).
Увеличение мембранной проницаемости для ионов таллия (как и калия) оказалось возможным выявить и на энергизованных митохондриях. Повышение степени набухания при инкубации митохондрий в гипотоничной среде, содержащей соли как калия, так и таллия, блокируется пальмитоил-КоА или АТФ (эффект которого отменяется ГДФ), что свидетельствует об участии АТФ-чувствительных калиевых каналов в транспорте Т1+ в матрикс. Применение ионофоров, увеличивающих доступ катионов в липидную часть мембраны, позволило нам обнаружить конкуренцию между радиоизотопами ТІ , с одной стороны, и Cs+ и Rb+, с другой стороны, за общие места связывания. Поскольку за эти места связывания конкурирует также липофильный: органический катион тетрафенилфосфоний, известный как мощный ингибитор митохондриальных АТФ-чувствительных калиевых каналов (Garlid, Paucek, 2003), мы заключаем, что ионофоры могут доставлять неорганические катионы ко входу в калиевые каналы, находящиеся в латентном состоянии в гидрофобной области мембраны.
Как пассивная диффузия, так и транспорт через АТФ-чувствительные калиевые каналы должны проходить по механизму электрофоретического унипорта. Наши данные свидетельствуют о том, часть потока Т1+ как энергизованные, так и деэнергизованные митохондрии действительно зависит от величины мембранного электрического потенциала, увеличиваясь при его повышении. Однако использование коэффициента распределения меченого Т1+ в качестве меры мембранного электрического потенциала в митохондриях вряд ли возможно из-за того, что кроме пассивного пути проникновения через внутреннюю мембраны ионы таллия могут двигаться в обоих направлениях при участии специализированных транспортных структур.
В заключение отметим, что поскольку наши результаты получены на суспензии изолированных митохондрий при разных экспериментальных условиях, в настоящее время представляется невозможным оценить вклад каждого из этих путей в общую проницаемость митохондриальной мембраны для неорганических катионов и, в частности, для ионов таллия. Эта проблема, как и, вопрос о возможных механизмах регуляции этой проницаемости in vivo, остаются предметом дальнейших исследований в данной области. 1. Проницаемость внутренней мембраны изолированных митохондрий печени крысы для Т1+ намного превышает ее проницаемость для К+, в результате чего значительное увеличение объема митохондрий, независимо от присутствия субстратов дыхания, наблюдается при инкубации в нитратной и ацетатной средах с Т1+ (но не с К+) даже в отсутствие ионофоров. 2. Скорость и степень набухания неэнергизованных митохондрий в нитратной и ацетатной средах как с Т1+, так и с К+, резко возрастают при повышении рН среды в интервале 7.2 - 8.9 или при снижении ее осмолярности. 3. Стимуляция набухания неэнергизованных митохондрий при защелачивании калиевой и таллиевой сред частично отменяется циклоспорином А, что однозначно указывает на вовлечение в этот процесс песелективной поры высокой проводимости внутренней мембраны митохондрий.. 4. Защелачивание среды приводит к активации хинин-чувствительного К+/Н+-антипортера, который облегчает вход К и Т1+ в неэнергизованные митохондрии, движущей силой которого служит химический градиент протонов. 5. При инкубации энергизованных митохондрий в гипотоничной среде выявляются АТФ-зависимые калиевые (КДТФ-) каналы, относительный вклад которых в проницаемость внутренней мембраны для К+ и Т1+ практически одинаков. При введении, в среду ионофоров происходит увеличение проницаемости мембраны для К+ и ТҐ вследствие повышения доступности латентных КАТФ-каналов в гидрофобной области мембраны.
Похожие диссертации на Сравнительное исследование транспорта таллия (Т1+) и калия (К+) через внутреннюю мембрану митохондрий печени крысы
