Введение к работе
Актуальность работы. Основной проблемой современной «глицины является диагностика и лечение неопластических заболеваний человека.
Известно, что молекулярной основой опухолевой трансформации является механизм непостоянства гекона. Доказано, что транс.тока-цки генетического материала в результате гомологичной и кегоко-догичной рекомбинации приводят к активации клеточных онкогеиоз и неопластичесхоЯ трансфорнации клеток. Вазиейшии этапом генетической рекомбинации является сочетакная реакция разрыва-воссоединения ДНК с участием <5еряектов. способных разрезать ДКК. Одними из ферментов, способных гидролиэов&ть фосфодиэфирнуп связь с ее послсгдупвии легированиям является топоизонеразы клеточных ядер.
ДНК—топоизоперязы относятся к группе воладезоксинуклеотидал-трансф?раз СК*~5.99.1. 3. 5. ДШС-топоизонераэы Г типа характеризуется способностью разрезать и легировать одну из неггей 2-ух цепочечной ДНК. ДНК—тогоиэонераэы II типа катализируют реакцию разрезг-кия—воссоединения 2-ух цепей ДНК. Продуктоя действия обеих типов ферментов на кольцевые молекулы ДЯК яв.иявтся топологические изомеры Скзокеры полргзгнкяэ этих молекул: узлы, полукатенакы, кате-наны и т.д. Фермент обнаружен во всех таксонях эукариот.
В настоящее время существуют несколько моделе." реконби нации ДНК. предусматризгюсих участие ДНК-топоизочераз в этон процессе. Известно, что ДНК-топоизоме?ази уіаствуат в осиовніо: генетических процессах - рекомбинации и репарации. Иііфоргап.ик о топоизо— перазах достаточно полка - они изолированы из многие эукарнсти-чеспих источников, изучены их свойства, определена их аминокислотная последовательность и клонїіроеаим гены и? ряда органнзмоз. Однако, несмотря на относительно дяиику» истерия исследования топоизопераз и многочисленные литературные данные,. представления о роли этих ферментов' в функции геьаяа в норне н яри патоідагичес-ких состояниях Р значительной степени поверхностич. Полностью отсутс1ву»т данные о изменении активности топон:»оиеразы I типа в процессе рззвилия канцерогенеза. Изучение же і.олекулярпих механизмов участия топоизомораэ при onyxojjeoS трансформации необходимо для разработки принципиально новых способов диагностики и коррекции генетических нарушений, приводящих к опухолевому
перерождению тканей.
Такий образен исследование изкенения активности ДНК-топоизо-пераз при различных типах опухолевой трансформации является одной из актуальных задач биологической и медицинской хинин.
Цель и задачи исследования. Основной цель» работы являлось исследование важнейшего фчрнеита функционирования генома - ДНК-топоизоиеразы I типа в норне и при опухолевой трансформации клеток, а такасе возкоаиости использования полученных данных с целью создания теста для диагностики неоплазий. В качестве основных объектов исследования использованы печень крыс, фибробласты крыс и клетки яичников китайского хомячха.
В соответствии с цель» исследования были поставлены следу»- ~ roe задачи:
получить препарат ядерной ДНК-гопоизокерэзы I типа из ялеточиых ядер печени крыс, свободный от эндонуклеазиой активности и стандартизованный по изозлектрической точке;
определить изменение активности ДНК-топоизонеразы I типа в клеточных ядрах гепатои при опухолевой трансформации в процессе хини-чески индуцированного диэтилнитрозамином канцерогенеза, регенерации и онтогенеза у крыс;
исследовать изменение активности ДНК-топоизонеразы I типа в культурах фибробластов крыс, находящихся на стадиях последовательной опухолевой трансформации;
использовать очинённый препарат ДНК-топоизонеразы I с цель» разработки теста для диагностики системной склеродермии в группе диффузных заболеваний соединительной ткани.
Научная новизна. Впервые исследовано изменение активности топоизонеразы I типа на различных стадиях опухолевой трансформации.
Основным результатом диссертационной работы явилось доказательство участия топоизонеразы I типа в процессе опухолевой, транс-форнации клотск. основанное на обнаруженном нами снижении активности топоизонеразы I типа при иннортализации и трансформации клеток в нескольких испытанных моделях, а также на выявленной нами увеличении актнзиости при обратной трансформации, индуцированной дибутирилцякло-АИФ.
Определена активность топоизонеразы I типа р клеточных ядрах нормальной печени, химически индуцированных гепатои, регенерирую-
«чей и эмбриональной печени. Обнаружено снижение активности топо-
кэомеразы I типа как в опухолевых клетках в зависимости от степени дифференцирован, таг и в нормальных клетках печени в завискиос-ти от стадии регенерации.
Получены косвенные данные, указывающие на роль фасфорнлирова-кия я регуляции активности топоизомер*зы I типа р процессе хищнического канцерогенеза.
В эмбриональных фибробластах крыс снижению активности топо-изомеразьг I типа совпадало со ста/г»ей имиортялмзаоии клеток и продолжало сни:=аться при первой трангфекцни огастгеяон гаи-
Разработана схема выделения топоизокеразы І тяла из ядер печени крыс, погсоллвіщя получить препарат фермента, стандартизованный по изозлектрической точке и близкий с аяедтрофоретичес-коЯ гомогенности. '
Практическая новизна. Показано, что топсизонераза I выступает маркером ияиорталчзации и первичной трансформаиии с образовакиея высокодиу)фервкчированиых клеток.
Выявлена корреляция между массой опухолевой ткани и активность» тспоизокерази I типа в окрухаютей гепатолу ткани, что указывает иа во-яохность использования данного подхода для оценки активности тоггоизонеразы Г типа в биопсийноя материале при раке печени человека.
Определение активности топокгонеразы I типа целесообразно проводить для диагностики опухолевых заболеваний чрлосека в комплексе различных диагностических тестос с цель» гобып~ккк точкости постановки диагноза.
Разработанный метод количественного определения активности топоизочеразы I типа в гикроксга'чэствзх исследуемых тканей был использован для исследования изменения активности топоиэомеразы I на поделях,канцерогенеза.
Предложен тест для диагностики систепной склеродермии среди других системных заболеваний соединительной тхани. который прошел испытания в клинической практике С в НИК рс-внатологии Р/?Ж.
Апробация работы состоялась ЗА марта 1993 года на яєхлабора-торной научной конференции ЙБМХ РАМН.
Материалы диссертации докладывались иа V Всесоязнон биохимической съезде СКиев. 1966.3, Всесоюзном симпозиуме по биохимии
сельскохозяйственных зивоткых СТашкент, 19863, Совещании по иоле— кулярнын неха::изагп канцерогенеза СПущико. 19673, IX Всесоюзной синпозиупе "Структура и функция клеточного ядра" СЧерноголовка. 19873, Международной конференции по склеродермии и схлеродермия-подобнілі заболеваниям С Варшава, 19913. IV Всесоюзной съезде ревматологов СМинск, 19913.
Структура и объен работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, кетоднческой части и результатов собственных исследований. Работа изложена на 144 страницах текста, содержит 20 рисунков и 20 таблиц. Список литературы включает 239 источника.
По материалам диссертации опубликованы 12 работ, в.тон числе 2 в зарубегяых журналах.
