Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Системная красная волчанка 12
1.2. Этиология системной красной волчанки 13
1.3. Ревматоидный артрит 15
1.4. Этиология ревматоидного артрита 17
1.5. Биологическая роль аутоантител к ДНК в норме и патогенезе аутоиммунных заболеваний 19
1.6. Каталитические ДНК-гидролизующие анитела и их биологическая роль в организме человека 23
1.7. Влияние антител к ДНК на клетки организма 26
1.8. Апоптоз Роль апоптоза в иммунных процессах 32
1.9. Нарушение апоптоза при СКВ и РА 33
Заключение по обзору литературы 36
Глава 2. Материалы и методы исследований 38
2.1. Объект исследования 38
2.2. Выделение AT к нДНК из крови человека 38
2.2.1. Получение сыворотки и осаждение AT сульфатом аммония 38
2.2.2. Обессоливание белков 39
2.2.3. Фракционирование антител сыворотки крови на ДЭАЭ-целлюлозе 39
2.2.4. Получение субфракций AT к нДНК аффинной хроматографией на нДНК-целлюлозе микрокристаллической 40
2.3. Исследование влияния AT к нДНК на клетки in vitro 41
2.3.1. Выделение мононуклеарных клеток, лимфоцитов и моноцитов из периферической крови человека 41
2.3.2. Исследование жизнеспособности клеток 41
2.3.3. Культивирование клеток в присутствии сывороток крови человека 42
2.3.4. Культивирование клеток в присутствии субфракций IgG-AT к нативной ДНК 42
2.3.5. Определение концентрации клеточного белка 43
2.3.6. Определение количества потребления глюкозы клетками 43
2.3.7. Определение продукции перекиси водорода моноцитами 44
2.3.8. Оценка уровня повреждения ДНК клеток 44
2.3.8.1. Оценка уровня повреждения ядерной ДНК методом флуоресцентной спектрофотометрии 44
2.3.8.2. Оценка уровня повреждения ядерной ДНК методом «ДНК-комет» 45
2.3.9. Оценка апоптоза клеток методом проточной цитометрии 47
2.4. Статистическая обработка результатов 48
Глава 3. Результаты исследований 49
3.1. Влияние AT сывороток на МНК здоровых лиц in vitro 49
3.2. Влияние AT сывороток на моноциты здоровых лиц in vitro 50
3.3. Влияние субфракций IgG-AT к нДНК на моноциты здоровых лиц 52
3.4. Генотоксичность субфракций IgG-AT к нДНК 66
3.5. Определение количества клеток на ранней стадии апоптоза после инкубации с IgG-AT к нДНК 76
Глава 4. Обсуждение результатов 82
Выводы 107
Литература 108
- Биологическая роль аутоантител к ДНК в норме и патогенезе аутоиммунных заболеваний
- Влияние субфракций IgG-AT к нДНК на моноциты здоровых лиц
- Генотоксичность субфракций IgG-AT к нДНК
- Определение количества клеток на ранней стадии апоптоза после инкубации с IgG-AT к нДНК
Введение к работе
Актуальность проблемы
Аутоиммунные заболевания (АИЗ) - это заболевания, возникающие вследствие гиперактивности иммунной системы, дисбаланса во взаимодействии ее звеньев и нарушения толерантности к молекулам собственного организма (Ройт, 2007).
Общим признаком АИЗ является гиперглобулинемия и избыточное образование широкого спектра ААТ (Насонов и Сура, 1988). Аутоантитела (ААТ) -это антитела (AT), способные взаимодействовать хотя бы с одним аутоантигеном (антигеном собственных тканей).
При некоторых аутоиммунных патологиях, а также других заболеваниях и физиологических состояниях, таких как стресс, беременность наблюдается повышение содержания в крови больных аутоантител класса IgG к нативной ДНК (IgG-AAT к нДНК), происхождение и биологическая роль которых на сегодняшний день остаются невыясненными.
Системная красная волчанка (СКВ) и ревматоидный артрит (РА) - это хронические тяжелые системные аутоиммунные заболевания с неясной этиологией и обширгюй картиной иммунопатогенеза.
Характерное повышение уровня IgG-AAT к нДНК в крови больных СКВ является одним из диагностических критериев данного заболевания. Российскими учеными было обнаружено, что AT к ДНК при СКВ обладают ДНК-гидролизующей активностью (Gabibov et al., 1994).
PA - распространенное АИЗ, поражающее 0,5-2% взрослого населения в работоспособном возрасте 35-55 лет (Каратеев, 2007). Было показано, что приблизительно у 25% пациентов с РА наблюдаются повышенный уровень AT с ДНК-гидролизующей активностью (Suchkov, 2001; Gabibov et al., 2006).
СКВ и РА снижают качество и продолжительность жизни населения, поэтому входят в число важных биомедицинских и социальных проблем современности. К сожалению, с каждым годом число больных СКВ и РА возрастает (Арлеевская и др., 2010; Невзорова и Винтер, 2006).
Вероятно, развитие АИЗ является следствием сочетания многих факторов, среди которых необходимо выделить наследственную предрасположенность, гормональный статус человека и негативное воздействие физико-химических и биологических факторов окружающей среды. Согласно литературным данным, риск развития аутоиммунной патологии у родственников больных АИЗ в 2 раза вьше, чем в остальной популяции (Silman and Pearson, 2002). Вместе с тем ранняя диагностика СКВ и РА является сложной
задачей, так как симптомы часто неспецифичны и могут наблюдаться при широком спектре как ревматических, так и неревматкческих заболеваний.
В связи с этим важной задачей биохимии является разработка подходов и методов диагностики, прогнозирования течения патологического процесса, контроля эффективности комплексной терапии и мероприятий профилактики АИЗ.
Для решения поставленной проблемы необходим поиск и анализ маркера, обладающего свойствами, специфичными для разных АИЗ, и отражающего изменение иммунного статуса человека задолго до развития полномасштабной картины патологического аутоиммунного процесса
В ряде работ показано, что активность АИЗ (в частности, СКВ) ке всегда коррелирует с уровнем ААТ к ДНК (Villalta et al., 2009; Becker-Merok et al., 2006). У многих пациентов с СКВ в период устойчивой ремиссии заболевания и отсутствии клинического синдрома сохраняется высокий уровень ААТ к ДНК по сравнению с нормой. Кроме того,.повышенный уровень ААТ к ДНК наблюдается и при других АИЗ, например, РА с клиническими проявлениями, отличными от СКВ. Это наводит на мысль, что не только и не столько уровень, а в большей мере свойства ААТ к ДНК определяют течение патологического процесса при развитии АИЗ и могут различаться при разнообразных аутоиммунных патологиях.
ААТ к ДНК, вероятно, являются участниками патологического процесса, но их роль в развитии и течении СКВ, РА и других АИЗ представляется исследователям неоднозначной.
Большинство авторов поддерживают мнение о патогенетической роли гетерогенной популяции ДНК-связывающих и ДНК-гидролюующих ААТ класса IgG в аутоиммунитете (Reefinan et al., 2007; Jacob et al., 2006; Isenberg et al., 2007; Kowal et al., 2004; Невзорова, 2005). Но не исключено, что ААТ к нДНК, как часть пула естественных ААТ, в норме выполняют защитную функцию, способствуя удалению трансформированных и пораженных вирусами клеток, аугоантигенов, образующихся при разрушении тканей, и поддерживая гомеостаз организма (Полетаев и Чурилов, 2009).
В исследованиях последних лет показано, что некоторые ААТ к ДНК способны не только связывать растворимые антигены и рецепторы на поверхности клеток, но и проникать через мембрану внутрь клеток, взаимодействовать с органоидами и локализоваться в ядре, влияя на метаболические процессы (Yanase and Madaio, 2005; Rivadeneyra-Espinoza and Ruiz-Arguelles, 2006; Jang et al., 2009).
Предположительно, IgG-AAT к нДНК могут быть индукторами и участниками аутоиммунного синдрома, приводя к нарушению апоптоза клеток, следствием чего является увеличение содержания апоптотических телец и времени их циркуляции в
кровотоке, что часто наблюдается при СКВ и является, по крайней мере, одной их причин утраты аутотолерантности иммунной системы (Lorenz et а], 2000).
И до сих пор среди исследователей нет единого мнения о роли поликлональных IgG-AAT к нДНК в нарушении баланса клеточной гибели при развитии СКВ и РА.
Целью работы явилось исследование влияния антител класса IgG к нативной ДНК при системной красной волчанке и ревматоидном артрите на мононуклеарные клетки здоровых лиц in vitro.
Были поставлены задачи:
-
Оценить влияние антител к ДНК сывороток крови доноров, больных системной красной волчанкой на стадии обострения и в период ремиссии заболевания, больных ревматоидным артритом и клинически здоровых родственников больных ревматоидным артритом на мононуклеарные клетки здоровых лиц in vitro;
-
Изучить зависимость влияния антител класса IgG к нативной ДНК на жизнеспособность и метаболизм мононуклеарных клеток in vitro от заряда молекулы антител и аффинности к нативной ДНК;
-
Оценить генотоксичность и влияние антител класса IgG к нативной ДНК в норме и при системных аутоиммунных заболеваниях на уровень апоптоза мононуклеарных клеток здоровых лиц in vitro.
Научная новизна
Впервые на первичной культуре мононуклеарных клеток здоровых лиц показано, что патогенетический потенциал поликлональных антител класса IgG к нативной ДНК может быть обусловлен изменением их физико-химических и иммунохимических свойств (суммарного заряда молекулы и аффинности к нативной ДНК) при развитии аутоиммунной патологии и отличается в разных группах системных аутоиммунных заболеваний.
Показано, что высокоочигценные свободные от иммунных комплексов антитела класса IgG к нативной ДНК здоровых доноров и больных СКВ на стадии обострения заболевания оказывают сходное влияние на мононуклеарные клетки периферической крови здоровых лиц in vitro. Обнаружено, что положительно заряженные антитела класса IgG к нативной ДНК больных СКВ в активной стадии заболевания обладают более выраженной цитотоксичностью и генотоксичностью по сравнению с антителами доноров.
Поликлональные антитела класса IgG к нативной ДНК больных СКВ в период ремиссии заболевания не оказывают значимого влияния на мононуклеарные клетки здоровых лиц in vitro.
Показано, что наряду с положительно заряженными низкоаффинными
антителами, характерными для доноров и больных СКВ на стадии обострения заболевания, высокоаффинные антитела класса IgG к нативяой ДНК больных ревматоидным артритом проявляют цитотоксичность и генотоксичность в культуре мононуклеарных клеток здоровых лиц in vitro.
Влияние субфракций антител класса IgG к нативной ДНК клинически здоровых родственников больных ревматоидным артритом сходно с влиянием антител больных ревматоидным артритом.
Поликлональные антитела класса IgG к нативной ДНК при системных аутоиммунных заболеваниях приводят к повышению уровня апоптоза мононуклеарных клеток здоровых лиц in vitro.
Практическая значимость
Изучение свойств антител класса IgG к нативной ДНК в культуре мононуклеарных клеток крови здоровых лиц способствует более глубокому пониманию фундаментальных основ работы иммунной системы человека в норме и при патологии. Материалы исследования представляют интерес в области биохимии, молекулярной биологии, иммунологии и могут быть использованы в учебном процессе высших учебных заведений на биологических и медицинских факультетах.
Изменение свойств антител класса IgG к нативной ДНК в норме, при различных аутоиммунных заболеваниях, а также на разных стадиях активности патологического процесса, проявляющееся в воздействии антител на мононуклеарные клетки здоровых лиц, является специфическим маркером, отражающим изменение иммунного статуса, что может быть использовано для создания тест-системы выявления нарушений работы иммунной системы человека
Практическая значимость работы определяется возможностью использования субфракций антител класса IgG к нативной ДНК в качестве инструмента, позволяющего диагностировать, прогнозировать развитие и течение, проводить мониторинг состояния больных аутоиммунными заболеваниями и оценивать эффективность терапии с использованием культуры клеток.
Апробация работы
Основные результаты исследований докладывались на Всероссийской Конференции с элементами научной школы для молодежи «Структура и динамика молекулярных систем» (Казань, 2009), Научно-практической конференции биохимиков, посвященной памяти профессора В.Г. Винтера «История и достижения Казанской биохимической школы» (Казань, 2009), ХШ европейском симпозиуме студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-2009» (Казань, 2009), I Всероссийской виртуальной
интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнсшогии» (Казань, 2010), I и П Международных научно-практических конференциях «Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммунного ответа и развития опухоли» (Казань, 2010,2011).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 2 публикации в рецензируемых изданиях, рекомендованных действующим перечнем ВАК.
Структура и объем диссертации
Биологическая роль аутоантител к ДНК в норме и патогенезе аутоиммунных заболеваний
На сегодняшний день данные о причинах генерации ААТ к ДНК и их биологической роли в норме и патологии АИЗ противоречивы.
ААТ к ДНК были выявлены у клинически здоровых людей и родственников больных СКВ, не имеющих клинических симптомов заболевания. Поскольку данные ААТ являются постоянным компонентом иммунной системы, в литературе они получили название «естественные» ААТ (Rubin and Carr, 1979).
В литературе сложилось общее мнение, что естественные ААТ к ДНК - это антитела, присутствующие в крови здоровых индивидуумов на относительно постоянном уровне, принадлежащие к Ig изотипов М и G, низкоаффинные к одноцепочечной и двуцепочечной ДНК, не обладающие ДНК-гидролизующей активностью и цитотоксичностью (Pavlovicetal., 2010).
Есть предположение, что естественные ААТ к ДНК играют важную роль в защите организма от чужеродной ДНК, а также могут способствовать удалению аутоантигенов, препятствуя их накоплению в организме и поддерживая таким образом гомеостаз (Pisetsky, 1998). Так профессором Полетаевым и его коллегой была предложена теория, в основе которой лежит предположение, что ААТ, в том числе и ААТ к ДНК, играют в организме роль «ярлычков» для аутоантигенов и соответственно ориентируют фагоциты в процессе элиминации продуктов разрушения отработавших, пораженных вирусами и поврежденных клеток организма. Авторы напоминают, что функция иммунной системы не ограничивается защитой организма-хозяина от вторжений и заключается в том, чтобы поддерживать гомеостаз, а накопление аутоантигенов, образующихся в процессе апоптоза и некроза собственных клеток, представляет не меньшую опасность, чем атака извне (Полетаев и Чурилов, 2009). Большинство исследователей поддерживает мнение о патогенетической роли ДНК-связывающих и ДНК-гидролизующих AT класса IgG в развитии аутоиммунного синдрома, что подтверждается рядом исследований (Reefman et al., 2007; Jacob et al., 2006; Isenberg et al., 2007; Kowal et al., 2004).
AT к ДНК наблюдаются у 70-90% пациентов с СКВ, особенно при развитии нефрита (Pavlovic et al., 2010). Но нефритогенные IgG-AT к ДНК, обнаруживаемые при СКВ и лимфопролиферативных заболеваниях с аутоиммунным синдромом, в отличие от естественных AT к ДНК, проявляют высокое сродство к нативной и/или одноцепочечной ДНК и выраженную ДНК-гидролизующую активность (Pavlovic et al., 2010).
Предположительно, циркулирующие в кровотоке иммунные комплексы ААТ-ДНК могут откладываться в тканях почек и других органов и связывать белки комплемента. Продукты активации комплемента привлекают фагоциты, которые для элиминации комплексов выделяют токсичные вещества, в том числе активные формы кислорода и цитокины, что ведет к разрушению окружающей ткани (Limaye and Mohan, 2004). Повреждение ткани может приводить к экспрессии неоантигенов и образованию новых ААТ, иммунных комплексов и усугублению воспалительного процесса.
Рифман с соавторами показали, что AT к ДНК, опсонизируя поздние апоптотические клетки, изменяют направление с фагоцитоза на воспалительный иммунный ответ, и это является причиной повреждения органов, наблюдаемого при СКВ. Механизм подобного переключения, опосредованного антителами к ДНК, пока не выяснен (Reefman et al., 2007; Frisoni et al., 2005).
У многих пациентов с СКВ в период устойчивой ремиссии заболевания сохраняется повышенный уровень AT к ДНК. Это свидетельствует о том, что не все AT к ДНК являются патогенными и подтверждается в опытах на мышиных моделях СКВ. В литературе отмечено, что для больных СКВ с нефритом характерна более высокая авидность и аффинность сывороточных IgG AAT к нативной ДНК, чем без него (Villalta et al., 2009).
В опытах на мышах показана роль В-клеточного активирующего фактора (BAFF), секретируемого Тг-хелперами в переключении подклассов IgG. Мыши с делецией гена BAFF были менее подвержены волчаночному нефриту, несмотря на достаточно высокий уровень антител, депонированных в почках. Как оказалось, это связано с переключением подклассов с IgG2a на IgGl, которые менее эффективно активируют Fc-рецепторы клеток и комплемент (Jacob et al., 2006; Isenberg et al., 2007).
Способность активировать комплемент или взаимодействовать с Fc-рецепторами зависит напрямую от структуры AT. Даже небольшие изменения аминокислотного состава в антиген-связывающем участке оказывают значительное влияние на функциональные возможности и патогенетический потенциал AT к ДНК.
Например, Mason и его коллеги показали, что введение единичной мутации в легкую цепь человеческого моноклонального антитела IgG-B3, вызывающее замену положительно заряженной аминокислоты аргинина на нейтральный серии, приводит к снижению способности AT связывать двуцепочечную ДНК и нуклеосомы (Mason et al., 2005). Замена только лишь одной или двух аминокислот в последовательности мышиных моноклональных антител R4A приводит к существенным изменениям как их ДНК-связывающей способности, так и опсонизации ими тканей почек мышей-реципиентов in vivo.
Анализ последовательности CDR как мышиных, так и человеческих моноклональных AT к ДНК показал высокую частоту встречаемости в данной области определенных аминокислот, особенно аргинина, аспарагина и лизина (Isenberg et al, 2007). Накопление этих специфических аминокислот обусловлено соматическими гипермутациями, что в конечном итоге способствует увеличению аффинности AT и обуславливает выживание В-клеточных клонов. Однако решающее значение в изменении свойств AT к ДНК играет не только наличие и количество, но и фактическая позиция данных аминокислот в CDR молекулы Ig.
Наиболее опасным при СКВ, наряду с развитием волчаночного нефрита, является поражение центральной нервной системы. В работах с СКВ-пациентами и на мышиных моделях волчанки показано, что в развитии когнитивной дисфункции нервной системы при СКВ важную роль играют AT к N-метил-В-аспартатным рецепторам NR2a и NR2b. Как оказалось, эти AT представляют собой субпопуляцию AT к нативной ДНК, которые способны перекрестно реагировать с внеклеточным доменом NR2 рецепторов. Данные рецепторы находятся в мозге повсеместно и играют ключевую роль в процессах обучения, памяти и патологии психозов и депрессии (Lapteva et al., 2006).
Как показано на мышиных моделях, AT к NR2 рецепторам могут оказывать нейротоксический эффект на нейроны преимущественно в области гиппокампа, результатом чего являются когнитивные нарушения. Важную роль в развитии подобного эффекта играет нарушении гематоэнцефалического барьера при СКВ (Kowal et al., 2004).
Обнаружено, что патологические IgG-AAT к нДНК обладаю широкой перекрестной реактивностью. ААТ к ДНК способны взаимодействовать с денатурированными А и D snPHTI полипептидами, ппРНП А2, рибосомальными белками SI, Р и 18S РНК, фактором элонгации-2, фосфорилхолином бактериальной клеточной стенки, фосфолипидами, миозином, РНК-полимеразой, ДНКазой I. Объяснением широкой перекрестной реактивности ААТ к ДНК может являться то, что антитела распознают не последовательность или структурную и химическую гомологию эпитопов, а сходную конформацию. Видимо, молекула-конкурент ДНК должна точно или частично имитировать конформацию и топологическую поверхность ДНК-эпитопа (Невзорова, 2005; Yadav et al., 2011). Группой исследователей во главе с Zhao было показано, что волчаночные ААТ к ДНК взаимодействуют с а-актинином на поверхности мезангиальных и эпителиальных клеток почек и являются по крайней мере одной из причин развития нефрита при СКВ (Zhao et al, 2005).
Леках с соавторами полагают, что в сыворотках крови здоровых лиц существует естественная система ингибирования гиперактивности ААТ. Так как большинство ААТ полиспецифичны (способны реагировать более чем с одним аутоантигеном), составляющими этой системы могут быть не только антиидиотипические AT, но и другие компоненты сыворотки сходной с ДНК конформации. Нарушение в данной системе - одна из вероятных причин проявления патологической активности ААТ и развития аутоиммунного синдрома (Леках и др., 1996).
Исследования последних лет показали, что некоторые AT к ДНК способны проникать через плазматическую мембрану клеток и локализоваться в ядре, влияя на внутриклеточные процессы (Kozyr et al., 2001; Yanase and Madaio, 2005; Rivadeneyra-Espinoza and Ruiz-Arguelles, 2006; Jang et al., 2009).
Влияние субфракций IgG-AT к нДНК на моноциты здоровых лиц
Согласно данным литературы, популяция IgG-AT к нДНК гетерогенна и это, вероятно, сказывается на противоречиях в характеристике свойств и биологической роли ДНК-гидролизующих и ДНК-связывающих AT к нДНК (Barbas et al., 1995; Foster et al., 1994; Невзорова и Винтер, 2006).
Поэтому для исследования влияния AT на моноциты из каждой сыворотки было получено по 4 субфракции свободных от иммунных комплексов IgG-AT к нДНК, различающиеся зарядом (фракции I - основные AT, характеризующиеся общим положительным зарядом, и II - кислые AT с общим отрицательным зарядом) и аффинностью к нДНК - субфракции а, элюированные с нДНК-целлюлозы буфером, содержащим 1М NaCl, и субфракции б, элюированные с сорбента буфером глицин-HCl с рН 2.3, что позволяет сделать предположение об их большей аффинности к антигену -нативной ДНК (рис. 5).
Для оценки влияния AT к нДНК моноциты культивировали в течение 72 часов при 37С в присутствии высокоочищенных субфракций IgG-AT к нДНК здоровых лиц и больных СКВ и РА.
Анализ данных показал, что AT доноров проявляют сходное с СКВ-АТ на стадии обострения заболевания воздействие на моноциты in vitro: приводят к замедлению пролиферации, снижению количества жизнеспособных клеток и потребления ими глюкозы из питательной среды, но действие СКВ-АТ, обладающих ДНК-гидролизующей активностью (Невзорова и др., 2003; Невзорова и Винтер, 2006; Gabibov et al., 2006), более выражено (рис. 6, 7). Отмечено, что наиболее заметное цитотоксическое воздействие оказывают фракции положительно заряженных IgG-AT к нДНК доноров и больных СКВ на стадии обострения заболевания, как высокоаффинные, так и низкоаффинные (субфракции 1а и 16).
Результаты воздействия на клетки субфракций AT к нДНК больных РА и клинически здоровых родственников больных РА свидетельствуют о негативном влиянии на моноциты субфракций 1а, 16 и 116, представляющих собой положительно заряженные низкоаффинные и высокоаффинные положительно и отрицательно заряженные IgG-AT к нДНК. Данные AT родственников и больных РА в период обострения заболевания проявляют цитотоксичность, что отражается в замедлении пролиферации, снижении количества жизнеспособных моноцитов и потребления ими глюкозы из питательной среды (рис. 8, 9). IgG-AT к нДНК больных PA in vitro оказывают более выраженный негативный эффект на моноциты здоровых лиц по сравнению с AT клинически здоровых родственников больных РА.
Обнаружено, что после инкубации моноцитов с положительно заряженными (1а, 16) IgG-AT к нДНК доноров снижается общее содержание белка в клетках, и моноциты начинают продуцировать повышенное количество перекиси водорода. Аналогичные субфракции IgG-AT к нДНК больных СКВ на стадии обострения заболевания оказывают сходный с AT к ДНК доноров эффект на клетки здоровых лиц, но их активирующее воздействие на моноциты более выражено и сравнимо с воздействием ДНКазыЦрис. 10, 11).
В присутствии субфракций 1а, 16 и Пб AT к ДНК больных РА и клинически здоровых родственников больных РА обнаружено снижение содержания общего белка в клетках и усиление продукции перекиси водорода моноцитами. Воздействие IgG-AT к нДНК больных РА сравнимо с AT к ДНК больных СКВ на стадии обострения заболевания и эффектом на клетки ДНКазы I (рис. 12, 13).
Все субфракции IgG-AT к нДНК больных СКВ на стадии ремиссии заболевания не изменяют общего количества, количества жизнеспособных клеток, потребления моноцитами глюкозы и содержание клеточного белка (рис. 6, 7, 10). Интенсивность выделения перекиси водорода моноцитами в присутствии свободных IgG-AT к нДНК больных СКВ в период ремиссии заболевания также не отличается от отрицательного контроля (рис. 11).
Было исследовано воздействие субфракций IgG-AT к нДНК на первичную культуру МНК и культуру лимфоцитов здоровых лиц. Результаты не представлены, так как являются аналогичными и подтверждают результаты цитотоксичности IgG-AT к нДНК сывороток крови больных системными аутоиммунными заболеваниями в культуре иммунокомпетентных клеток здоровых лиц.
Поскольку результаты воздействия субфракций IgG-AT к нДНК на МНК, моноциты и лимфоциты in vitro являются аналогичными, на следующих этапах в качестве клеточной модели для исследования была использована общая фракция МНК.
Генотоксичность субфракций IgG-AT к нДНК
Изменение структуры ДНК клеток под воздействием очищенных субфракций IgG-AT к нДНК было исследовано методами флуоресцентной спектрофотометрии и щелочного гель-электрофореза лизированных единичных клеток - «ДНК-комет». Визуально оценив полученные под флуоресцентным микроскопом изображения, вычисляли индекс «ДНК-комет» (Идк) для каждой исследуемой группы. При вычислении Идк учитывали форму «головы кометы», длину и ширину «хвоста кометы»,
Структуру И ПЛОТНОСТЬ ДНК В «ГОЛОВе» И «ХВОСТе КОМеТЫ». Повышение Идк свидетельствует о наличии повреждений в молекуле ДНК клеток при воздействии IgG-AT к нДНК (Сорочинская и Михайленко, 2008).
Обнаружено изменение флуоресценции комплекса ЭБ-ДНК хроматина клеток после инкубации с IgG-AT к нДНК доноров и больных СКВ на стадии обострения заболевания (рис. 14). Повышение флуоресценции ЭБ-ДНК в данных образцах свидетельствует об изменении конформации клеточной ДНК, возможном снятии суперспирализации, обусловленным гидролизом ДНК, что приводит к деконденсации хроматина. Полученные результаты также иллюстрируют более заметное негативное воздействие субфракций положительно заряженных IgG-AT к нДНК и выраженный генотоксический эффект AT к ДІЖ больных СКВ на стадии обострения заболевания.
Полученные после проведения электрофореза лизированных клеток микрофотографии «ДНК-комет» подтверждают результаты флуоресцентной спектрофотометрии. С использованием критерия Крускала-Уоллиса (а = 0.05) выявлено, что наибольшие повреждения ДНК наблюдаются в МНК, инкубированных с положительно заряженными высокоаффинными и низкоаффинными IgG-AT к нДНК (субфракции 1а и 16) доноров (рис. 15а, б, 16) и больных СКВ в период обострения заболевания (рис. 16; 17а, б). Действие СКВ-АТ к нДНК в активной стадии, характеризующихся высокой ДНКазной активностью и цитотоксичностью, сравнимо с разрушающим воздействием на структуру ДНК перекиси водорода, использованной в качестве положительного контроля в данном эксперименте (рис. 16; 17е).
На полученных под флуоресцентным микроскопом изображениях видно образование широких диффузных «хвостов комет» с практически полным отсутствием «головы комет» в препаратах МНК, инкубированных с положительно заряженными IgG-AT к нДНК больных СКВ на стадии обострения заболевания, что свидетельствует об апоптозе клеток.
Цитотоксичные субфракции AT к ДНК больных РА и клинически здоровых родственников больных РА приводят к повышению флуоресценции комплекса ЭБ-ДНК хроматина клеток (рис. 18) и Идк (рис. 19). Повреждающее воздействие на ДНК клеток, наряду с положительно заряженными IgG-AT к нДНК, характерными для доноров и больных СКВ на стадии обострения заболевания (субфракции 1а), оказывают высокоаффинные к нДНК IgG-AT клинически здоровых родственников (рис. 19; 20а, б, г) и больных РА (рис. 19; 21а, б, г), как положительно, так и отрицательно заряженные (субфракции 16, Пб). При визуальной оценке данных образцов выявлено образование выраженных «хвостов комет», что свидетельствует о деградации ДНК хроматина.
Действие отрицательно заряженных IgG-AT к нДНК (субфракции Па и Пб) доноров (рис. 15в, г, 16) и больных СКВ (рис. 16; 17в, г) и низкоаффинных отрицательно заряженных IgG-AT к нДНК (субфракции Па) родственников (рис. 19; 20в) и больных РА (рис. 19; 21в), а также всех субфракций AT к нДНК больных СКВ на стадии ремиссии заболевания (рис. 16; 22 а, б, в, г) не отличается от отрицательного контроля (рис. 16; 22д).
С использованием программного обеспечения TriTek CometScore 1.5.2.6. (USA) вычисляли момент «хвоста комет», представляющий собой произведение длины «хвоста комет» на % содержания ДНК в «хвосте комет», выражаемый в условных единицах. Повышение показателя момента «хвоста комет» свидетельствует об интенсификации повреждения ДНК клеток.
Результаты изменения структуры ДНК, полученные с помощью компьютерной программы, подтверждают результаты визуального анализа «ДНК-комет» (рис. 23): положительно заряженные субфракции IgG-AT к нДНК доноров и больных СКВ на стадии обострения заболевания проявляют генотоксичность в культуре МНК здоровых лиц.
Спектр генотоксичных субфракций IgG-AT к нДНК в сыворотке крови родственников и больных РА шире, чем в норме и при обострении СКВ. Наряду с положительно заряженными, высокоаффинные IgG-AT к нДНК больных РА и клинически здоровых родственников больных РА приводят к повреждению ДНК клеток in vitro (рис. 24). Остальные исследованные субфракции IgG-AT к нДНК не проявляют генотоксичности в культуре МНК.
Определение количества клеток на ранней стадии апоптоза после инкубации с IgG-AT к нДНК
Количество клеток, находящихся на ранней стадии апоптоза после 72 часов инкубации с субфракциями IgG-AT к нДНК определяли на проточном цитофлуориметре стандартным методом по уровню связывания FITC аннексином V фосфотидилсерина, экспрессированного на внешней стороне мембраны клеток, и способности МНК исключать PI. В качестве положительного контроля в данном эксперименте использовали глюкокортикостероид дексаметазон, обладающий выраженным проапоптотическим действием на иммунокомпетентные клетки.
Анализ данных проточной цитометрии показал, что наибольшее количество МНК, находящихся на ранней стадии апоптоза (-10%), сравнимое с положительным контролем (дексаметазоном), наблюдается после культивирования клеток с субфракциями IgG-AT к нДНК больных СКВ на стадии обострения заболевания (таблица 3). В таблице представлены результаты, выраженные в % относительно уровня спонтанного апоптоза в отрицательном контроле (ФСБ), принятого за ноль.
Среднее количество клеток, находящихся на ранней стадии апоптоза после культивирования МНК с субфракциями IgG-AT к нДНК доноров, больных РА и клинически здоровых родственников больных РА, в среднем выше на 6% по сравнению с отрицательным контролем. На рисунке 25 представлена типичная диаграмма распределения популяций МНК после инкубации с субфракциями IgG-AT к нДНК.
Известно, что IgG-AAT к нДНК обнаруживаются в крови здоровых людей, но их уровень значительно повышен при СКВ - аутоиммунном заболевании соединительной ткани неизвестной этиологии (Ardoin and Pisetsky, 2008; Crow, 2009; Gabibov et al, 2006).
Пиковый уровень ДНК-гидролизующей активности ААТ к ДНК, как правило, наблюдается в период обострения СКВ. Состояние данных пациентов характеризуется максимальным индексом активности СКВ и заметными иммунологическими нарушениями. Напротив, минимальный уровень содержания и ДНКазной активности ААТ к ДНК обнаружен в период ремиссии заболевания и отсутствии клинического аутоиммунного синдрома (Gabibov et al, 2006).
Большинство исследователей поддерживают мнение о патогенетической роли ДНК-связывающих и ДНК-гидролизующих ААТ класса IgG в аутоиммунитете (Reefman et al., 2007; Jacob et al., 2006; Isenberg et al., 2007; Kowal et al., 2004). Так в исследованиях последних лет было показано, что ААТ к ДНК способны проникать через мембрану внутрь клеток, взаимодействовать с органоидами и локализоваться в ядре, влияя на внутриклеточные процессы (Yanase and Madaio, 2005; Rivadeneyra-Espinoza and Ruiz-Argiielles, 2006; Jang et al., 2009). Но не исключено, что ААТ к нДНК, как часть пула естественных ААТ, в норме выполняют защитную функцию, способствуя удалению трансформированных и пораженных вирусами клеток, аутоантигенов, образующихся при разрушении тканей, и поддерживая гомеостаз организма (Полетаев и Чурилов, 2009).
И до сих пор среди исследователей нет единого мнения о причинах генерации, механизме действия и биологической роли IgG-AT к нДНК в норме и патогенезе АИЗ (Полетаев и Чурилов, 2009; Невзорова и Винтер, 2006; Yung and Chan, 2008).
Для исследования воздействия IgG-AT к нДНК были выбраны МНК, лимфоциты и моноциты здоровых лиц, так как они представляют собой важные составляющие иммунной системы и могут являться индукторами воспалительного процесса, характерного для СКВ и РА.
От нормальной функциональной активности моноцитов (макрофагов) зависит способность иммунной системы к своевременному ответу на генетически чужеродные объекты, так как они являются компонентом антигенпрезентирующей системы и осуществляют процесс фагоцитоза. Кроме того, моноциты защищают организм от «внутренней измены», элиминируя аутоагрессивные лимфоциты, старые, поврежденные и трансформированные клетки. Слаженное взаимодействие Т-, В-лимфоцитов и макрофагов обеспечивает не только адекватность иммунного ответа, но и своевременное его подавление после обезвреживания и элиминации патогена, что в норме должно завершиться полным выздоровлением (Ройт, 2007). Нарушение гармоничного взаимодействия данных звеньев иммунной системы, аномалии апоптоза на уровне позитивной и негативной селекции лимфоцитов неизбежно влекут за собой развитие разнообразных форм иммунонедостаточности.
В литературе показано, что моделирование у мышей ингибирования апоптоза путем трансфекции антиапоптотичесих генов приводит к развитию системных аутоиммунных процессов даже чаще, чем злокачественных новообразований (Ярилин, 2003 б). С другой стороны, при СКВ наблюдается усиление апоптоза МНК in vitro, что также может вносить вклад в развитие патологического процесса. Но что является индуктором изменения баланса клеточной гибели при СКВ остается невыясненным.
