Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. Системная красная волчанка 13
1.2. Аутоантитела к ДНК 14
1.2.1. Обнаружение аутоантител к ДНК 14
1.2.2. Биологическая роль аутоантител к ДНК в норме и патогенезе СКВ 16
1.2.3. Получение препаратов аутоантител к ДНК 21
1.2.4. Иммунохимические свойства патологических аутоантител к ДНК 22
1.2.5. Структура патологических аутоантител к нДНК 32
1.2.6. Взаимодействие аутоантител с ДНК 34
1.3. Каталитические антитела 37
1.3.1. Открытие новых функций антител 37
1.3.2. Механизмы каталитического действия антител 39
1.3.3. Причины возникновения природных аутоантител с нуклеазной активностью 41
1.3.4. Биологическая роль природных абзимов 42
1.3.5. Получение препаратов природных каталитических антителе нуклеазной активностью 44
1.3.6. Нуклеазная активность природных каталитических антител...46
1.4. Атомно-силовая микроскопия 51
1.5. Заключение по обзору литературы 56
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 58
2.1. Оборудование и реактивы 58
2.2. Объект исследования 61
2.3. Получение сыворотки крови и осаждение антител сыворотки сульфатом аммония 61
2.4. Обессоливание антител сыворотки крови методом гель-фильтрации на акрилексе Р-6 62
2.5. Фракционирование антител сыворотки крови методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе 62
2.6. Подбор оптимального нДНК-сорбента для аффинной хроматографии антител 63
2.6.1. Ковалентная посадка нДНК эпоксиактивацией на носители и заполнение колонок 63
2.6.1 .а. ДНК-целлюлоза 63
2.6.1.6. ДНК-сефароза 64
2.6.2. Нековалентная посадка нДНК на носители и заполнение колонок 64
2.6.2.а. ДНК-целлюлоза микрокристаллическая 64
2.6.2.6. ДНК-целлюлоза волокнистая 65
2.6.3. Проведение аффинной хроматографии на приготовленных нДНК-сорбентах 65
2.7. Получение антител к нДНК аффинной хроматографией на нДНК-целлюлозе микрокристаллической 65
2.8. Электрофоретический анализ антител в полиакриламидном геле в присутствии Ds-Na 66
2.9. Изоэлектрическое фокусирование 67
2.10. Иммуноферментный анализ 67
2.10.1. Исследование влияния активных форм кислорода на взаимодействие антител с ДНК 68
2.10.2. Статистическая обработка данных 69
2.10.3. Подбор оптимального разведения коньюгата 70
2.11. Выделение плазмидной ДНКрВЯ-322 70
2.11.1. Рост бактерий и амплификация плазмиды 70
2.11.2. Выделение и очистка плазмидной ДНК pBR-322 70
2.11.3. Оценка результатов 71
2.12. Гидролиз ДНК плазмиды pBR-322 антителами к ДНК 71
2.12.1. Изучение зависимости ДНК-гидролизующей активности антител отрН реакционной среды 71
2.12.2. Оценка влияния ионов двухвалентных металлов на активность антител к ДНК 71
2.12.3. Подбор оптимальных концентраций активных форм кислорода и оценка их влияния на активность антител к ДНК 72
2.12.4. Гидролиз плазмидной ДНК pBR-322 антителами к ДНК 72
2.12.5. Определение кинетических параметров реакции гидролиза плазмидной ДНК pBR-322 антителами к ДНК 73
2.12.6. Контроли 74
2.13. Электрофоретический анализ плазмидной ДНК pBR-322 в агарозном геле 74
2.14. Флуоресцентная спектроскопия 75
2.15. Атомно-силовая микроскопия 75
2.15.1. Приготовление образцов 75
2.15.2. Визуализация ДНК и антител 75
ГЛАВА 3. Результаты исследований 77
3.1. Выделение и характеристика антител к нативной ДНК из сывороток крови больных СКВ 77
3.1.1. Выделение из сывороток крови IgG, содержащих антитела к ДНК 77
3.1.2. Фракционирование антител к нативной ДНК методом аффинной хроматографии на ДНК-сорбенте 84
3.1.2а, Приготовление аффинных нДНК-сорбентов 84
3.1.26. Фракционирование антител к нДНК 87
3.2. Исследование ДНК-гидролизующей активности антител к ДНК 90
3.2.1. Изучение влияния состава инкубационной среды на ДНК-гидролизующую активность антител к нДНК 90
3.2.2. Изучение влияния активных форм кислорода на активность антител к нДНК и ДНКаз сывороток крови больных СКВ 92
3.2.3. Кинетические характеристики реакции гидролиза плазмидной ДНКрВК-322 антителами к нДНК 99
3.2.4. Изучение гидролиза плазмидной ДНК pBR-322 антителами к нДНК 103
3.3. Визуализация взаимодействия и активности антител к нДНК с ДНК методом атомно-силовой микроскопии 108
3.3.1. Подбор и оптимизация методики приготовления образцов ДНК для АСМ 108
3.3.2. Подбор и оптимизация параметров сканирования молекул ДНК и обработка полученных изображений 110
3.3.3. Исследование взаимодействия и активности антител к нДНК с ДНК 111
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 125
Выводы 145
Литература ...146
- Биологическая роль аутоантител к ДНК в норме и патогенезе СКВ
- Получение препаратов природных каталитических антителе нуклеазной активностью
- Выделение из сывороток крови IgG, содержащих антитела к ДНК
- Кинетические характеристики реакции гидролиза плазмидной ДНКрВК-322 антителами к нДНК
Введение к работе
Актуальность проблемы
Одним из направлений современной иммунологии является учение об аутоиммунизации, то есть иммунных процессах, обусловленных антигенами собственных тканей (аутоантигенами), сопровождающихся появлением аутоантител (AAT) или/и аутореактивных лимфоцитов (Christen and von Herrath, 2004). Аутоантитела - Ig, которые взаимодействуют, хотя бы с одним аутоантигеном как в норме, так и при патологии (Lacroix-Desmazes et al., 1998). Один из путей, приведших к возникновению и развитию такого учения, - изучение аутоиммунных заболеваний, при которых иммунная система атакует нормальные, здоровые ткани собственного организма, то есть организм утрачивает толерантность к собственным тканевым антигенам. Общим признаком большинства аутоиммунных заболеваний является В-клеточная активация, приводящая к гиперглобулинемии и избыточному образованию ААТ с разной специфичностью. На сегодняшний день идентифицировано большое количество индивидуальных аутоантигенов, к которым чаще всего обнаруживаются ААТ: белки цитоскелета и другие внутриклеточные компоненты, ДНК, РНК и нуклеопротеины, фосфолипиды, различные ферменты, гормоны, рецепторы различных клеток и т.д. (Сидорик, 1992; Dighiero and Rose, 1999), Большинство исследователей признают в основном агрессивную роль ААТ, Поэтому выявляемые ААТ могут быть показателем иммунологической перестройки и при определённых условиях могут реализовать свои патогенетические возможности.
В исследованиях'последнего двадцатилетия открыта новая функция антител (AT) - способность катализировать различные биохимические реакции, то есть выступать в роли биологических катализаторов (Tramontano et al., 1986; Pollack et al., 1986; Paul et al., 1989). По аналогии с энзимами (англ. enzyme) такие AT были названы абзимы (от англ. antibody enzyme) или каталитические AT. Согласно сложившимся представлениям, наличие в
8 крови абзимов является чётким признаком протекания в организме аутоиммунных процессов.
Системная красная волчанка (СКВ) - одно из наиболее тяжёлых аутоиммунных воспалительных заболеваний соединительной ткани неясной этиологии. Заболеваемость СКВ по различным данным варьирует от 1:10000 до 1:1000 населения (Bongu et al., 2002; Gill et al., 2003). Ежегодно регистрируют до 7 новых случаев СКВ на 100000 населения. В ряде исследований получены данные о существенном повышении уровня распространённости СКВ (более чем в 3 раза) за последние четыре десятилетия; заболеваемость СКВ в 1950-1979 гг. составляла 1.51 случая на 100000 населения, а в 1980-1992 гг. - 5.56 случая на 100000 населения (Scolding and Joseph, 2002).
В патогенезе СКВ важное место отводится иммунным механизмам, многие аспекты которых, несмотря на интенсивное изучение, остаются невыясненными и ряд вопросов, касающихся этиологии, патогенеза и лечения СКВ требуют изучения. Поэтому СКВ к настоящему времени уже является не только медицинской, но биологической и социальной проблемой.
При СКВ наблюдают разноплановые В-клеточные нарушения, обуславливающие гиперактивность В-лимфоцитов, что является одной из характерных особенностей заболевания (Liossis and Zouali, 2004). Эти лимфоциты продуцируют ААТ с широким спектром специфичностей. Характерным признаком СКВ является высокий уровень содержания в сыворотках крови больных по сравнению с нормой AT к нативнои ДНК (нДНК) класса IgG, и определение титра которых имеет важное прогностическое и диагностическое значение. Среди этих AT к нДНК были обнаружены AT, которые обладают ДНК-гидролизующей активностью (Shuster et al., 1992).
Изучению как ДНК-связывающих, так и ДНК-гидролизующих AT посвящено большое количество работ. Многими исследователями признаётся тот факт, что именно IgG-AT к нДНК ответственны за развитие заболевания,
9 тогда как относительно роли ДНК-гидролизующих AT к ДНК однозначного ответа нет. Механизмы реализации патологических свойств ДНК-абзимов и их клиническое значение пока остаются невыясненными. Нельзя исключать того, что при одних заболеваниях КАТ могут играть положительную роль, а при других - отрицательную. Также до сих пор среди исследователей нет единого мнения о происхождении, свойствах, структуре, механизмах действия, биологической роли AT к нДНК при СКВ, в том числе обладающих нуклеазной активностью. Все полученные данные (иммунохимические, ферментативные свойства AT) говорят в пользу того, что популяция IgG-AT к нДНК гетерогенна и с увеличением истории заболевания субпопуляционный состав этих AT может расширяться, однако о составе этих фракций среди авторов также нет общего мнения.
Одним из основных препятствий на пути к выяснению проблемы взаимосвязи каталитической активности AT к нДНК с патогенезом и клиническими проявлениями заболевания является отсутствие единого методического подхода к выделению и очистке разных субпопуляций AT к ДНК из сыворотки крови больных, а это, вероятно, и сказывается на противоречиях в характеристике и биологической роли ДНК-гидролизующих и ДНК-связывающих AT к нДНК при системной красной волчанке.
Кроме того, используемые в настоящее время методы изучения нуклеазной активности AT только косвенно указывают на возможные механизмы реализации их ферментативной активности и не позволяют наглядно обосновать полученные данные. Для изучения механизма действия ДНК-гидролизующих AT используются различные методы (электрофорез ДНК в агарозном геле, флуоресцентная спектроскопия, метод линейного дихроизма, электрофорез в полиакриламидном геле, содержащем ДНК-субстрат), однако они позволяют определять только конечные продукты реакции гидролиза ДНК абзимами, но не промежуточные. Изобретение в 1986 г. атомно-силового микроскопа (Binnig et al., 1986) позволило биологам не только визуализировать отдельные макромолекулы, но и получить
10 информацию о кинетике взаимодействия нескольких макромолекул, что, как правило, недоступно при других методах исследования.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы явилось изучение ДНК-гидролизующей активности антител к нативной ДНК при системной красной волчанке. Были поставлены следующие задачи: выделить из сыворотки крови больных системной красной волчанкой субфракции антител к нативной ДНК класса IgG; изучить физико-химические свойства и ДНКазную активность полученных препаратов субфракций антител к нативной ДНК; изучить взаимодействие ДНК-гидролизующих антител к нативной ДНК с ДНК методом атомно-силовой микроскопии.
Научная новизна
Установлено, что популяция антител к ДНК у больных с дебютом СКВ гетерогенна и состоит из четырёх субфракций IgG-антител к нативной ДНК, различающихся по сорбции на ДЭАЭ-целлюлозе и проявляющих различное сродство к аффинному сорбенту нДНК-целлюлозе. Показано, что ДНК-гидролизующие антитела к нативной ДНК являются металлозависимыми эндонуклеазами, вносят в ДНК преимущественно одпоцепочечные разрывы и проявляют активность в широком диапазоне значений рН.
Установлено, что активные формы кислорода при СКВ активируют термолабильную ДНКазную активность сывороточных нуклеаз в отличие от термостабильной ДНК-гидролизующей активности антител к нативной ДНК, которая не изменяется или ингибируется под действием активных форм кислорода.
Методом атомно-силовой микроскопии получены трёхмерные изображения комплексов ДНК-ДНК-гидролизующее антитело к нативной ДНК с нанометровым разрешением и продемонстрировано, что для
11 ДНКазной активности антител характерен непроцессивный механизм действия.
Установлено, что в активном антигенсвязывающем центре абзимы имеют два участка: первый - «якорная площадка», которая обуславливает специфичность взаимодействия антител с молекулой ДНК, и второй -активный центр, ответственный за проявление энзиматической активности.
Практическая значимость
Разработана методика фракционирования антител к нативной ДНК класса IgG из сыворотки крови больных СКВ, которая позволяет получать четыре субфракции антител к нативной ДНК, различающихся по сорбции на ДЭАЭ-целлюлозе, сродству к аффинному сорбенту нДНК-целлюлозе, и содержащих ДНК-гидролизующие антитела. Оптимизирован метод изучения ДНК-гидролизующей активности антител к нДНК на атомно-силовом микроскопе Solver Р47Н со сканирующей измерительной головкой типа «Смена-Б» (ЗАО «НТ-МТД», Россия). Полученные результаты могут служить теоретической и методической основой для исследований проблем ферментативной активности атител при аутоиммунных заболеваниях человека.
Апробация работы
Основные результаты исследований докладывались на IX международной конференции молодых учёных «Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений» (Казань, 1998); V Международной конференции «Biochemistry of Health and Diseases» (Israel, 1998); Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 1998); Всероссийской научной конференции III Вавиловские чтения «Социум в преддверии XXI века: итоги пройденного пути, проблемы настоящего и контуры будущего» (Йошкар-Ола, 1999); XIII Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-
12 Петербург, 1999); XII юбилейной всероссийской конференции «Ферменты микроорганизмов» (Казань, 2001); II Российской конференции молодых учёных России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2001); III съезда биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); Международной научной конференции «Новая геометрия природы» (Казань, 2003); VII Всероссийской молодёжной научной школы «Когерентная оптика и спектроскопия» (Казань, 2003); XXI Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем» (Яльчик, 2004); VIII Международной молодёжной научной школы «Когерентная оптика и спектроскопия» (Казань, 2004), а также на ежегодных итоговых научных конференциях Казанского государственного университета в 1997-2005 гг.
По материалам диссертации опубликовано 20 работ.
Биологическая роль аутоантител к ДНК в норме и патогенезе СКВ
Вопрос о биологических функциях «естественных» ААТ к ДНК, обнаруживаемых в норме, пока остаётся без ответа.
Pisetsky (1997), основываясь на экспериментальных данных, высказал предположение о том, что ААТ к ДНК в норме играют важную роль как первоначальный элемент в защите организма от чужеродной ДНК (вирусов и бактерий). Кроме того, «естественные» ААТ могут способствовать удалению аутоантигенов (продуктов метаболизма) до увеличения их уровня содержания в организме.
В литературе существует предположение о том, что в норме активность высокоаффинных IgG-AAT к нДНК «замаскирована» и регулируется низкоаффинными «естественными» IgM к дДНК на основе идиотип-антиидиотипического взаимодействия антител. Изменения функционирования этой идиотипической сети могут приводить к нарушению контроля аутореак-тивности, появлению патологических IgG-AAT к нДНК и развитию СКВ (Gilbert et al., 1996; Williams and Isenberg, 1996; Lacroix-Desmazes et al., 1998). На основании данных о том, что в группе СКВ-пациентов с высоким содержанием в крови IgM к нДНК снижен риск развития нефрита, авторы предположили, что IgM к нДНК связывают циркулирующую нДНК и, таким образом, ингибируют формирование патологических IgG-содержащих иммунных комплексов, которые могут индуцировать нефрит (Witte et al., 1998b).
Причины разрушения тканей и развития нефрита при СКВ до конца не ясны и, предположительно, именно IgG ААТ к нДНК могут приводить к разрушению почек одним из четырёх механизмов: 1. Циркулирующие иммунные комплексы ДНК—ААТ могут «запуты ваться» в тканях почти всех органов и активировать белки комплемента. Продукты активации комплемента привлекают фагоциты, которые для эли минации комплексов выделяют токсические вещества (например, АФК) и цитокины, что, в свою очередь, ведёт к разрушению окружающей ткани (Lt maye and Mohan, 2004). Nezlin (2000) с соавт. обнаружили, что перед обост рением СКВ уровень ДНК в циркулирующих иммунных комплексах с IgG ААТ снижается, иногда достигая значений нормы, что может быть вызвано их отложением в тканях. 2. ААТ к ДНК могут формировать иммунные комплексы непосредственно в почках с ДНК, гистонами или/и нуклеосомами, запутавшимися или связавшимися с коллагеном IV типа, фибронектином, ламинином, гепаран сульфатом и другими полианионами базальной мембраны клубочков почек (Foster et al., 1993; Van Bruggen et al., 1997; Limaye and Mohan, 2004). Например, было показано, что предварительная обработка ДНКазой биопсийного материала поражённой кожи больных СКВ и выделенных компонентов базальной мембраны клубочков отменяет взаимодействие сывороточных ААТ к ДНК, реагирующих с этими объектами без предварительной обработки их ДНКазой (Le-fkowith et al, 1996; Swanson et al., 1996; Zeng et al., 2004). 3. Так как патологические IgG-AAT к ДНК обладают перекрёстной реактивностью (см. п. 1.2.4.), то они могут связываться не только с ДНК, но и с антигенами базальной мембраны, тканевыми компонентами клубочков почек IS или сосудистых стенок (ламинином, гепаран сульфатом, а-актинином и др.). Последующее разрушение ткани может приводить к экспрессии неоантигенов (изменённых аутоантигенов) и образованию новых иммунных комплексов (Budhai et al., 1996; Mohan et al., 1999; Deocharan et al., 2002). 4. За последние двадцать лет многими авторами в исследованиях in vitro и in vivo было показано, что некоторые моноклональные и поликлональные IgG-AAT к нДНК больных и мышиных моделей СКВ способны проникать в различные клетки и ядра (почек, селезёнки, сердца, печени, крови и др.) и индуцировать их морфологические и функциональные изменения. При этом у здоровых животных появляются признаки СКВ (протеинурия, нефрит, ги-перклеточность клубочков почек и т.д.) (Madaio et al., 1997; Vlahakos et al., 1992). Кроме того, внутриядерные отложения Ig наблюдаются прямой имму-нофлюоресценцией в почках, коже и других органах у 5-30% больных СКВ с активными проявлениями заболевания (Madaio and Yanase, 1998). Показано, что некоторые патологические IgG-AAT, связываясь с рецепторами цитоплазматической мембраны, остаются на поверхности клеток, что может приводить к нарушению функций клеточной мембраны и/или активации комплемента с последующим лизисом клеток-мишеней (комплемент-зависимая цитотоксичность). Другие патологические A AT к нДНК проникают в клетки и связываются с цитоплазматическими или/и ядерными структурами (Koren et al., 1995; Reichlin et al., 1995). Авторами высказано предположение, что ААТ к ДНК взаимодействуют с разными рецепторами/структурами клеточной мембраны и биологический результат связывания с одним типом рецепторов приводит к проникновению Ig в клетку, а с другим типом рецепторов приводит к отмене этого проникновения. Показано, что проникновение in vitro IgG-AAT к ДНК в клетку и в ядро -энерго-зависимый процесс; не вызвано пассивной диффузией и пиноцитозом; опосредовано антиген связывающим регионом молекул IgG (VH-CDR3), которые взаимодействуют с конститутивными компонентами клеточной поверхности или с экзогенными антигенами, ассоциированными с клеточной мемб 19 раной (Foster et al., 1994; Yanase et al., 1994; Abedi-Valugerdi et al., 1999).
Возможный механизм проникновения в клетку ААТ к ДНК через Fc-рецептор, предложенный Alarcon-Segovia и др. (1978), в настоящее время подвергается сомнению, так как Р(аЬ)2 -фрагменты патологических ААТ способны проникать в клетку и локализоваться в ядре (Vlahakos et al., 1992; Yanase et al., 1994). Некоторые исследователи продемонстрировали, что прохождение одних ААТ к ДНК в клетку опосредовано взаимодействием ААТ с ДНК, находящейся на поверхности клеток, тогда как для других ААТ к ДНК ДНК клеточной поверхности не играет важной роли во взаимодействии ААТ с клетками, так как после обработки клеток и/или ААТ ДНКазой, ААТ не утрачивают способности связываться и/или проникать в клетки (Koren et al., 1995; Chan and Cheng, 1997; Abedi-Valugerdi et a!., 1999). Было показано, что ААТ могут связываться с белками клеточной поверхности, имеющими молекулярную массу от 20-28 до 150-180 кДа (Chan and Cheng, 1997; Moscato et al., 2002). Результаты исследований Yanase и др. (1997) показали, что проникновение в клетку ААТ к ДНК инициируется взаимодействием этих ААТ с мембранным белком с молекулярной массой 110 кДа, который был идентифицирован как миозин 1. Seddiki и др. (2001) обнаружили другой 50 кДа белок - калретику-лин, с которым могут реагировать IgG ААТ к нДНК, проникающие в клетки.
Получение препаратов природных каталитических антителе нуклеазной активностью
Получение гомогенных препаратов природных абзимов с высокой активностью является одной из самых сложных проблем. Кроме того, что в крови содержатся поликлональные AT, состоящие из большого числа Ig, имеющих сродство к различным антигенам, необходимо учитывать тот факт, что природные абзимы могут иметь различное происхождение и их взаимодействие с каким-либо иммобилизованным субстратом может отличаться на порядки.
Таким образом, при очистке абзимов на первых стадиях необходимо отделять AT от антигенов, затем выделять фракцию AT, имеющих повышенное сродство к потенциальному субстрату, а затем отделять фракцию абзимов от AT, имеющих сродство к тому же лиганду, но не обладающих каталитической активностью. Разработанные к настоящему времени различные методы очистки позволяют осуществить все описанные выше этапы, кроме этапа разделения абзимов и AT без каталитической активности.
Общая схема выделения включает стадии, традиционные для аффинной очистки молекул IgG-AAT к ДНК, а именно аффинную хроматографию на протеин-А- или протеиH-G-сефарозе, и стадию, используемую для очистки ДНК-связывающих ААТ, — элюцию буфером с высокой ионной силой сорбированных ААТ с ДНК-колонки. Проводимые исследования получаемых индивидуальных суммарных препаратов ААТ больных позволили авторам предполагать о гетерогенности природных поликлональных абзимов (Барановский и др., 1998; Baranovskii et al., 2001). Однако попытки разработать метод фракционирования ДНК-абзимов предпринимались только некоторыми авторами.
Проводимая после хроматографии на протеин-А-сефарозе ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе, которая позволяет разбить иммунные комплексы ДНК-АТ и разделить AT по заряду, была использована только для дополнительного разделения AT по классам (IgG, IgM, IgA), после которой ДНК-абзимы выделяли или из связавшейся или несвязавшейся с анионообмен-ником фракции AT. Некоторыми авторами для дополнительной очистки ДНК-абзимов применяется гель-фильтрация в условиях «кислого шока» рН 2.3, однако этими же авторами было показано, что сразу после обработки AT кислыми буферами активность ДНК-абзимов в реакции гидролиза существенно уменьшается (Невинский и др., 20006; Бунева и др., 2003; Дубровская и др., 2003).
Попытки получить отдельные субфракции AT, связавшихся с ДНК-сорбентом и имеющих различное сродство к ДНК, с использованием градиента концентраций NaCl приводило к распределению белкового материала по всему градиенту концентраций (Гололобов и др., 1993; Nevinsky and Buneva, 2002). Изучение специфичности и иммунологических характеристик не показало каких-либо существенных различий между ними. В итоге авторы получали один препарат IgG-AAT к ДНК.
Таким образом, анализ литературы свидетельствует о том, что пока нет единого методического подхода, позволяющего выделить разные субфракции ДНК-абзимов, имеющих различные физико-химические и иммунологические характеристики.
Нуклеазная активность AT (ДНК- и РНК-гидролизующая) сыворотки крови классов IgG и IgM изучается при аутоиммунных заболеваниях (СКВ, аутоиммунном тиреоидите, полиартрите, рассеянном склерозе и др.), лимфопролифе-ративных, некоторых вирусных заболеваниях (СПИДе, различных формах вирусного гепатита - заболеваниях, протекающих с нарушением иммунного статуса), онкологических и спонтанных мышиных моделях СКВ, в основном, двумя группами российских учёных под руководством Габибова А.Г. и Невинского Г.А. Авторами проводится обширный комплекс исследований, подтвердивших наличие нуклеазной активности именно у AT (ВЭЖХ-очистка, аффинная хроматография на протеине-А- и ДНК-сорбентах, сохранение активности у Fab-фрагментов и её отсутствие у Fc-фрагментов AT, сохранение активности после обработки AT буфером с кислым рН («кислый шок») и т.д.) (Шустер и др., 1991; Гололобов и др., 1993; Gololobov et al., 1995; Александрова, 1996; Барановский и др., 1998; Власов и др., 1998; Дубровская и др., 2003). Следует отметить, что AT из сыворотки крови здоровых доноров, а также больных гриппом, пневмонией, туберкулёзом, тонзиллитом, язвой 12-пёрстной кишки и некоторыми онкологическими заболеваниями (рак матки, молочной .железы, кишечника), протекающих без нарушения иммунного статуса, достоверно тестируемой ферментативной активностью не обладают (Барановский и др., 1997).
Полученные результаты подтвердили определённую общность в экспериментальном подходе к регистрации ДНК-абзимов: использование чувствительных методов оценки абзимной активности (электрофорез в агарозном геле, метод линейного дихроизма), где субстратом является плазмидная суперскрученная ДНК, в которой может быть выявлен даже единственный ник-разрыв.
Исследования показали, что вносимый антителами разрыв носит преимущественно одноцепочечный характер (Шустер и др., 1991; Козырь и др., 1996). Однако эти же исследователи показали, что гидролиз некоторыми антителами приводит к появлению в продуктах реакции кольцевой и линейной формы плазмидной ДНК (Гололобов и др., 1993; Gololobov et al., 1995). Массовое соотношение субстрат:абзим находится в пределах от 1:1 до 1:100, время инкубации варьирует от 1 часа до 1 суток, рН реакционной смеси от 7.5-8.0 (Gololobov et al., 1995; Козырь и др., 1996; Барановский и др., 1997; Власов и др., 1998) до 6.8-9.2 с очень незначительным максимумом в области 7.0-8.6 (Барановский и др., 1998; Генералов, 2000). ДНК-абзимы характеризуются различной зависимостью активности от ионов двухвалентных металлов (Шустер и др., 1991; Барановский и др., 1998; Генералов и др., 2000). Гололобов и др. (1993) отметили, что фосфат ион ингибирует катализ антителами в концентрации 10 мМ, а в концентрации 1 мМ наблюдается некоторое ускорение реакции. Отмечено, что активация наступает при действии АТФ и дезоксинуклеотидтрифосфатов. Ионы F оказывали ингибирующее действие в концентрации 10 мМ.
Кинетические исследования показали, что хотя каталитическая эффективность абзимов ниже, чем у нативного фермента, но она всё равно достаточно высока. Сродство AT к субстрату было также высоко.
Выделение из сывороток крови IgG, содержащих антитела к ДНК
Перед микроскопированием исследуемые пробы разводили 25 мМ трис-HCl-буфером, рН 7.5, 5 мМ MgCb до конечной концентрации 0.125-1.0 мкг/мл ДНК эритроцитов цыплёнка, 2.5-5.0 мкг/мл плазмидной ДНК или 25 мкг/мл AT. 2 Мкл исследуемого образца наносили на свежесколотую пластинку слюды (1x1 см), инкубировали 3-5 мин при комнатной температуре, промывали 1 мл бидистиллированнои деионизованнои стерильной воды и высушивали на воздухе, а далее над силикагелем.
Визуализацию ДНК и AT проводили в полуконтактном режиме на воздухе при комнатной температуре. Параллельно с измерением топографии поверхности (высоты) также фиксировались изменения амплитуды колебаний кантилевера. Сканирование проводили с разрешением 512x512 точек. Обработку АСМ изображений (вычитание постоянного наклона, устранение искажений, связанных с неидеальностью сканера, усреднение по строкам) и определение размеров сканированных объектов проводили с помощью программного обеспечения для зондовых микроскопов компании «НТ-МТД» (Россия) Nova КС 1.0.26.578.
Для подсчета длины (нм) молекул ДНК использовали программу DNA Processing Application 2.6. Характер распределения данных в полученных выборках индивидуальных значений длины молекул ДНК анализировали с применением структурного среднего - медианы (Me). Для оценки различий между отдельными выборками использовали непараметрические ранговые критерии: Краскелла-Уоллиса (для общей характеристики выборки), Т-критерий Манна-Уитни и Дана (для парных сравнений различных выборок) (Лакин, 1990; Ак-берова, 2004а; Акберова, 20046). Объём каждой выборки (численность группы) более 100 молекул ДНК. Некоторые аутоиммунные заболевания связаны с появлением в крови больных большого количества ДНК-связывающих и ДНК-гидролизующих AT, поэтому вероятность обнаружения природных вариантов AT к нДНК в сыворотках крови этих больных является наибольшей. Одной из особенностей больных СКВ является повышенный уровень в их крови содержания AT против нДНК Ig класса G, которые и ответственны за поражение и разрушение органов и тканей. Этот факт послужил отправной точкой поиска у пациентов с СКВ AT к нДНК, обладающих ДНК-гидролизующей активностью. В работе были использованы сыворотки крови первично выявленных больных СКВ в период обострения заболевания, так как, вероятно, гетерогенный состав AT на начальном этапе заболевания не очень широк, но, в тоже время, уровень AT к нДНК в крови больных высок. Выделение IgG-AT к нДНК из сывороток крови проводили согласно схеме, представленной на рис. 2. Так как патологические AT к нДНК являются одной из фракций IgG, то для получения образцов AT к нДНК на первых этапах уделяли основное внимание обнаружению и выделению IgG, содержащих AT к нДНК с ДНК-гидролизующей активностью, из сывороток крови больных СКВ. Для получения препаратов IgG, содержащих AT к нДНК, на первой стадии выделения использовали осаждение Ig из сыворотки крови сульфатом аммония. После осаждения IgG сульфатом аммония AT обессоливали гель-фильтрацией на акрилексе Р-6, которая даёт возможность получать гомогенные препараты AT сыворотки с минимальными потерями. Полученный после обессоливания препарат белков, содержащий IgG, подвергали дальнейшему фракционированию на слабом анионообменнике -ДЭАЭ-целлюлозе. Как было установлено для данных условий эксперимента, при хроматографическом разделении белков сыворотки крови на ДЭАЭ-целлюлозе, 50-60% нанесённого белка не сорбируется, 30-50% фиксируется на колонке. На рис. 3 представлен типичный профиль фракционирования AT больных СКВ на ДЭАЭ-целлюлозе. Таким образом, в результате фракционирования обессоленные белки сыворотки крови разделяются по сродству к анионообменнику на две фракции. Фракция белка, не сорбируемая на ионообменнике, выходящая одним пиком, обозначена как фракция I. Применение подобранного градиента концентраций NaCl от 0.03 до 0.3 М позволило разделить белки, связавшиеся с анионообмен-ником, на четыре перекрывающихся пика (на рис. 3 пики обозначены как №1-4). Белки, связавшиеся с анионообменником, были названы фракцией П. Для анализа состава отдельных пиков обеих фракций, полученных после ионообменной хроматографии, с целью определения содержания в них максимального количества IgG-AT к нДНК с ДНК-гидролизующей активностью использовали препараты белков, соответствующие максимальному значению оптической плотности при длине волны 280 нм каждого пика. Согласно полученным данным электрофоретического анализа в ПААГе (рис. 4), обе фракции после хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе содержат IgG с молекулярной массой 150 кДа. Пик фракции I (рис. 4, дорожка 1) - только IgG с молекулярной массой 150 кДа, соответствующий коммерческому препарату IgG (дорожка 2), и не содержит примесей других сывороточных белков. Электрофоретическое разделение белков пиков фракции II (рис. 4, дорожки 4-7) приводит к окраске серебром нескольких белков, в том числе и IgG, концентрация которого по мере увеличения градиента NaCl в элюирую-щем буфере уменьшается. Три первых пика фракции II (дорожки 4-6) содержат максимальное количество IgG. В дорожке 7, что соответствует «пику 4».
Кинетические характеристики реакции гидролиза плазмидной ДНКрВК-322 антителами к нДНК
При исследовании биообъектов важную роль в получении качественного АСМ-изображения играет приготовление образцов. Универсальной методики приготовления образцов пока не существует, поэтому использование какой-либо методики определяется спецификой задач.
Процедура подготовки образцов для АСМ заключается в их иммобилизации на ровной подложке. Материал подложки можно варьировать в зависимости от поставленных задач. Традиционно в качестве субстрата используются подложки из слюды, графита и других слоистых материалов, а также различные стёкла, полимерные материалы и металлические поверхности (Muller et al., 1997). Поэтому для визуализации ДНК методом АСМ необходимо было подобрать носитель-подложку для закрепления молекул ДНК.
Важную роль играет не только подбор подложки, но и её подготовка таким образом, чтобы исследуемые молекулы прочно фиксировались на ней и сохраняли свою конформацию по сравнению с таковой в растворе. Применительно к исследованиям нуклеиновых кислот во многих случаях бывает важно, чтобы макромолекулы адсорбировались на подложку в расправленном состоянии. Существует несколько методов приготовления образцов нуклеиновых кислот. Метод осаждения ДНК на поверхность слюды с использованием ионов металлов Mgf , Ni , Zn , Со , La , Zr исторически был самым первым, при помощи которого были получены надёжные результаты. Ионы металлов, по-видимому, служат связующими мостиками между отрицательно заряженной слюдой (в водных растворах) и отрицательно заряженными фосфатными группами молекулы ДНК.
На сегодняшний день использование катионов металлов для связывания ДНК с подложкой является наиболее распространенной методикой приготовления образцов для АСМ-исследований, что объясняется её простотой и высокой воспроизводимостью результатов. Поэтому именно этот метод был использован нами для приготовления образцов ДНК.
Для выбора подложки были использованы: пластина Gel Bond, на которую путём особой обработки прочно закреплён тонкий слой гидрофильного полисахарида - агарозы; покровное стекло; свежесколотая слюда - гид-роксил- и фтор-содержащий алюмосиликат. Для дальнейших АСМ-исследований в качестве подложки была выбрана слюда, так как при приготовлении образцов молекулы ДНК не прикреплялись на относительно инертное стекло, а слой агарозы на пластине Gel Bond набухал, что приводило к значительной деформации поверхности, поэтому визуализировать молекулы ДНК представлялось сложной задачей. Следует заметить, что при нанесении ДНК на поверхность свежесколотой слюды, в отличие от стекла и пластин Gel Bond, наблюдалось высокое смачивание и растекание препарата, что способствовало расправлению ДНК на подложке.
В дальнейшем, иммобилизуя ДНК на поверхность слюды с использова-ниєм различных разведений ДНК в присутствии катионов Mg в рабочем растворе, были подобраны оптимальные концентрации препаратов ДНК. Оптимальной считали ту концентрацию раствора ДНК, которая после иммобилизации ДНК на слюде позволяла визуализировать отдельно лежащие на поверхности в расправленном состоянии молекулы ДНК.
Сканирование молекул ДНК и AT, иммобилизованных на слюде, проводили полуконтактным методом на воздухе. При использовании этого метода возбуждаются вынужденные колебания кантилевера вблизи резонанса с заданной начальной амплитудой. При приближении зонда к поверхности амплитуда колебаний уменьшается до установленной оператором величины рабочей амплитуды. Кантилевер подводится к поверхности так, чтобы в нижнем полупериоде колебаний происходило касание зондом кантилевера поверхности образца.
Параметры АСМ-изображений рисунков 32-35 получены в топографическом режиме (регистрация изменений высоты исследуемой поверхности при поддержании постоянной амплитуды колебаний кантилевера) и в режиме регистрации изменения амплитуды колебаний кантилевера. В силу высокой чувствительности амплитуды к среднему значению расстояния между зондом и образцом, можно получать информацию о топографии поверхности с достаточно высоким пространственным разрешением. Поэтому АСМ-изображения, полученные измерением изменения амплитуды колебаний кантилевера, в силу разности высот подложки и молекул ДНК или AT, характеризуются лучшим контрастом в сравнении с топографическими, позволяя более чётко различать на АСМ-изображении молекулы ДНК и AT.
Величина перемещения зонда по нормали к поверхности записывается в память компьютера и интерпретируется как рельеф исследуемого образца — «топографическая карта», где, чаще всего, более светлые участки на АСМ-изображении соответствуют большим значениям высоты и отклонения.
На качество и воспроизводимость результатов сканирования полуконтактным методом существенно влияют используемая начальная и рабочая амплитуда колебаний кантилевера. Для определения оптимальных параметров сканирования использовали амплитудную кривую - зависимость амплитуды колебаний зонда от расстояния между зондом и поверхностью. Типичная амплитудная зависимость, снятая на участке слюды, свободном от молекул, показана на рисунке 25. До расстояния, равного начальной амплитуде колебаний, зонд не чувствует поверхность, и амплитуда не меняется. Начиная с этого расстояния, по мере приближения зонда к поверхности амплитуда уменьшается линейно и на этом участке кривой между зондом и поверхностью определяется силами притяжения. На определенной высоте происходит скачок амплитуды, что связано с наличием двух режимов взаимодействия - режима притяжения и режима отталкивания. При дальнейшем приближении зонда амплитуда уменьшается до нуля и взаимодействие между зондом и поверхностью на этом участке кривой определяется силами отталкивания (Малюченко и др., 2003).
