Введение к работе
Актуальность проблемы
В основе многих методов медицинской диагностики лежит анализ ферментов и низкомолекулярных метаболитов, содержание которых в крови и других биологических жидкостях изменяется при различных нарушениях обмена веществ (Hai'rigan and Goodacre, 2003). Важным биохимическим маркером являются ферменты, катализирующие расщепление ДНК, в частности, ДНКаза I и ДНК-гидролизующие антитела (ДНК-абзимы). Изменение активности этих ферментов является ранним признаком ряда аутоиммунных и сердечно-сосудистых заболеваний. Показано, что ДНКаза I является селективным маркером инфаркта миокарда (Yasuda et al., 2009), а гитр и свойства ДНК-абзимов служат показателем аутоиммунной патологии (Барановский и др., 2004). Однако до настоящего времени не разработаны доступные диагностические методы, позволяющие быстро и с высокой точностью определять активность ДНК-гидролизующих ферментов в биологических жидкостях.
Не менее значимым диагностическим объектом являются клетки крови и других тканей организма (Znidarcic et al., 2010). Актуальной задачей является разработка экспресс-методов оценки метаболической активности клеток для диагностики их функционального состояния, а также поиска лекарственных средств (Fernie et al., 2004; Quek et al, 2010). В частности, важное значение имеет определение в клетках макроэргических биомолекул, содержание которых отражает энергетический статус клеток и изменяется при патологических процессах, повреждении клеток и апоптозе (Crouch et al., 1993; Eltzschig et al., 2006).
Одним из наиболее актуальных направлений в анализе биохимических маркеров является использование биосенсоров, которые позволяют быстро и селективно исследовать биомолекулы, находящиеся в прямом контакте с преобразователем сигнала (Kerman et а!.. 2003; lost et al., 2011). Исследование ДНК-гидролизующих белков и метаболической активности клеток с помощью биосенсоров особенно востребовано для раннего скрининга заболеваний, а также персональной диагностики состояния здоровья человека. Перспективным подходом в создании подобных биосенсоров является модификация преобразователя биоадгезивными наноматериалами и полимерами, которые обладают способностью связывать биологические компоненты и формировать поверхности, чувствительные к состоянию биомолекул и клеток.
Целью настоящего исследования явилась разработка диагностической системы на основе биоадгезивных материалов для анализа ДНК-гидролизующих белков и метаболической активности клеток человека.
Были поставлены следующие задачи:
-
Изучить сорбционные взаимодействия углеродных нанотрубок с нуклеиновыми кислотами в различной конформации.
-
На основе сорбционных свойств углеродных нанотрубок разработать биосенсор для анализа ДНК-гидролизующих белков. С использованием биосенсора провести сравнительное исследование активности ДНК-гидролизующих белков в сыворотке крови в норме и при патологии.
-
Исследовать возможность оценки метаболической активности животных клеток с помощью биосенсоров, модифицированных биоадгезивными материалами.
Научная новизна
Выяснены особенности адсорбции различных форм плазмидной ДНК на многослойных углеродных нанотрубках. Разработан способ определения активности ДНК-гидролизующих белков в биологических жидкостях на основе электрохимического биосенсора; способ применен для избирательного анализа ДНКазы I и ДНК-гидролизующих антител в сыворотке крови в норме и при аутоиммунном тиреоидите. Предложен способ оценки метаболической активности клеток человека, в том числе содержания в клетках адениновых нуклеотидов, с помощью биосенсора на основе углеродных нанотрубок. Показана возможность применения этого биосенсора для мониторинга метаболической активности клеток человека в составе полисахаридного магрикса.
Практическая значимость
Выявленные сорбционные свойства углеродных нанотрубок применимы для очистки суперскрученной плазмидной ДНК от примесей нуклеиновых кислот и белков для получения генотерапевтических препаратов. Разработанный биосенсор, чувствительный к изменению молекулярной массы ДНК, можно использовать для скрининга заболеваний, сопровождающихся изменением активности ДНК-гидролизующих белков крови, в частности - аутоиммунного тиреоидита. Предложенный способ оценки метаболической активности клеток представляет интерес для диагностики заболеваний, сопровождающихся изменением содержания клеточных метаболитов, а также для оценки токсичности лекарственных средств.
Предложенные клеточные биосенсоры могут быть использованы для мониторинга жизнедеятельности клеток в составе полимерных матриксов.
Апробация работы
Основные результаты работы доложены на Ном Международном симпозиуме по биомедицине (Mugla, Turkey, 2008), 2ой Международной конференции по бионанотехнологии «НаноБио-08» (Санкт-Петербург, 2008), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), I Всероссийском, с международным участием, биологическом конгрессе студентов и аспирантов - биологов «Симбиоз-Россия-2008» (Казань, 2008), V съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2008), Всероссийской конференции «Ломоносов-2009» (Москва, 2009), 1ой Международной летней школе «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах» (Московская область, 2009), 13ом Европейском ежегодном симпозиуме для студентов-биологов «Симбиоз - 2009» (Казань, 2009), Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва - Пущино, 2009), Ной Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010), I Всероссийской Интернет-конференции «Современные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 2010), II Международной специализированной выставке «Нанотехнологии. Казань-2010» (Казань, 2010).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 18 работ.
Структура и объем диссертации
