Введение к работе
Актуальность проблемы. Генетическая стабильность живых организмов в значительной степени определяется функционированием комплекса белков, проводящих репарацию повреждений в ДНК, возникающих под действием экзогенных и эндогенных факторов. Репарация ДНК в клетках тесно связана с другими процессами метаболизма ДНК, такими как репликация и рекомбинация. Некоторые ДНК-полимеразы и белковые факторы участвуют как в репликации, так и в репарации ДНК. Эти процессы взаимно регулируются. Дефекты в системах репарации являются источником множества болезней человека и могут определять предрасположенность к раковым заболеваниям, раннему старению, дефектам роста, изменениям нервной деятельности и иммунных функций организма. Эксцизионная репарация оснований (ЭРО) является одной из основных и наиболее важных систем репарации повреждений ДНК, поскольку ее действия направлены на исправление наиболее многочисленных повреждений, вызываемых эндогенными и экзогенными факторами. ЭРО может протекать по коротко- и длиннозаплпточному путям в зависимости от длины ресинтезируемого фрагмента ДНК. Основные стадии и участники ЭРО хорошо охарактеризованы, но механизмы регуляции ЭРО исследованы в значительно меньшей степени. Информация о механизмах регуляции представляет также практическое значение, так как система ЭРО участвует в исправлении повреждений ДНК, вносимых в терапевтических целях, и возможность регуляции репарации может повысить эффективность лечения. Изучение деталей функционирования белок-нуклеиновых комплексов является важнейшей фундаментальной задачей современной молекулярной биологии и биохимии. Использование метода аффинной модификации является весьма перспективным для изучения сложных многокомпонентных белковых ансамблей.
Цель и задачи работы. Целью настоящей работы являлось исследование взаимодействий FEN1 (флэпэндонуклеаза-1) и XRCC1 (белок, входящий в группу комплементации, которая обусловливает чувствительность клеток к рентгеновскому излучению) с ДНК-интермедиатами и белками ЭРО. В ходе исследования решались следующие задачи: 1) создание ДНК-структур, несущих фотореакционноспособные нуклеотиды в различных положениях, и их применение для изучения взаимодействий FEN1 и XRCC1 с ДНК и белками ЭРО; 2) исследование взаимодействия репликативного белка A (RPA) и FEN1 при помощи метода фотоаффинной модификации и функциональных тестов; 3) конструирование устойчивых к действию FEN1 флэп-структур, в которых олигонуклеотид, формирующий свисающий одноцепочечный участок, содержит модификации в сахарофосфатном остове, и исследование
активности белков ЭРО в отношении флэп-структур с ненуклеотидными вставками; использование фотоактивных ДНК, полученных на основе дуплексов с ненуклеотидными вставками, для фотоаффинной модификации рекомбинантных белков системы ЭРО и белков экстрактов клеток человека; 4) исследование взаимодействия XRCC1 с различными химически активными ДНК-структурами, имитирующими интермедиаты ЭРО, и белками ЭРО в системах, реконструированных из очищенных белков, и в клеточных экстрактах методом аффинной модификации; оценка взаимного влияния 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы (OGG1), АР-эндонуклеазы-1 (АРЕ1) и XRCC1 при взаимодействии этих белков с ДНК-дуплексами, содержащими АР-сайты.
Научная новизна и практическая ценность работы. Предложен
метод ферментативного синтеза ДНК-структур, несущих
фотореакционноспособные группы в различных положениях. Такой подход позволяет конструировать ДНК-дуплексы, имитирующие интермедиаты процессов метаболизма ДНК, которые могут быть использованы для исследования деталей функционирования систем репликации и репарации ДНК. Показано, что ингибирование активности FEN1 репликативным белком А зависит от размера одноцепочечной части флэп-субстрата и обусловлено конкуренцией RPA и FEN1 за связывание с длинными одноцепочечными участками флэп-субстратов. Выявлены некоторые детали взаимодействия XRCC1 с белками и ДНК-интермедиатами ЭРО. Впервые показано, что XRCC1 способен образовывать основания Шиффа с ДНК-дуплексами, содержащими АР-сайты. Показано, что N-концевой и BRCT1-домены XRCC1 участвуют в формировании основания Шиффа с ДНК-дуплексами, содержащими АР-сайты.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ. Результаты работы были представлены на международных конференциях: «3rd International conference on bioinformatics of genome regulation and structure», Новосибирск, 2002; «Targeting RNA: artificial ribonucleases, conformational traps and RNA interference», Новосибирск, 2003; «Chemical and biological problems of proteomics», Новосибирск, 2004; «Conference on DNA Repair and Mutagenesis», Саутгемптон, Бермудские острова, 2004; «International conference on chemical biology», Новосибирск, 2005; «Физико-химическая биология», Новосибирск, 2006; «31stFEBS Congress», Стамбул, Турция, 2006.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов, списка литературы. Она изложена на 163 стр. и включает 43 рисунка, 6 таблиц и список цитируемой литературы из 254 наименований.
![Влияние половых стероидов (этинилэстрадиола и левоноргестрела) на взаимодействие тромбин-фибриноген в кровотоке (экспериментальное исследование) [Электронный ресурс]](/i/i/4500/209024.png "Влияние половых стероидов (этинилэстрадиола и левоноргестрела) на взаимодействие тромбин-фибриноген в кровотоке (экспериментальное исследование) [Электронный ресурс] Матейкович Елена Александровна")
