Введение к работе
Актуальность темы исследования. Первичное преобразование световой энергии в энергию разделенных зарядов, запускающее всю последовательность реакций фотосинтеза - глобального биосферного фотопреобразующего процесса - протекает в специализированных мембранных пигмент-белковых комплексах, называемых реакционными центрами фотосинтеза (РЦ). Для наиболее изученных в настоящее время в структурном и функциональном отношении РЦ пурпурных бактерий последовательность реакций переноса электрона может быть выражена схемой
P* ^ P+Ba- ^ P+Ha- ^ P+Qa-, где P - первичный донор электрона, димер молекул бактериохлорофилла (БХл) a (P - синглетно-возбужденное состояние P), Ba - первичный акцептор электрона, мономерный БХл, Ha - промежуточный акцептор электрона (бактериофеофитин, БФео), Qa - первичный хинонный акцептор. Квантовый выход процесса разделения зарядов с образованием ион-радикальной пары P+QA- практически равен 1 [Шувалов, 1990]. Высокая эффективность и направленность первичного разделения зарядов в РЦ в значительной степени определяются как свойствами самих кофакторов переноса электрона в нейтральном и ион-радикальном состояниях, так и их взаимодействиями между собой и с белковым окружением. Детальное исследование таких свойств и взаимодействий имеет принципиальное значение для понимания механизма фотосинтетического разделения зарядов в РЦ на молекулярном уровне и является актуальной задачей.
Перспективным подходом к изучению электронных свойств кофакторов и их межмолекулярных взаимодействий является исследование РЦ с модифицированным составом пигментов и/или с изменениями в аминокислотной последовательности субъединиц. Ценная информация о том, какие особенности структуры и свойств кофакторов были эволюционно отобраны и закреплены в природных группах микроорганизмов в качестве консервативных элементов, а какие были модифицированы с сохранением функции РЦ, может быть получена на основе сравнительных исследовании РЦ дикого типа, принадлежащих к различным родам фотосинтезирующих бактерий. Большое внимание в этом отношении привлекают РЦ нитчатой аноксигенной фототрофной бактерии Chloroflexus (Cf.) aurantiacus, которые близки к РЦ пурпурных бактерий по глобальной организации кофакторов и первичной фотохимии, но значительно отличаются от них по составу белка и пигментов. В частности, РЦ Cf. aurantiacus состоит из двух белковых субъединиц (L и M) и содержит 3 БХл и 3 БФео [Feick et al., 1995], тогда как РЦ Rhodobacter (Rb.) sphaeroides включает три субъединицы (L, M и H), несущие 4 БХл и 2 БФео [Шувалов, 1990]. Несколько функционально важных аминокислот, характерных для РЦ пурпурных бактерий, отсутствуют в аминокислотной последовательности РЦ Cf. aurantiacus [Ovchinnikov et al., 1988a,b; Shiozawa et al., 1989]. Исследования РЦ Cf. aurantiacus, однако, осложнены отсутствием данных об их кристаллической структуре. Использование спектральных методов остается одним из основных подходов к выяснению структурной организации и свойств кофакторов переноса
электрона в РЦ Cf. aurantiacus.
Фотоиндуцированная дифференциальная инфракрасная спектроскопия с Фурье преобразованием (ИК-Фурье-спектроскопия) обладает чрезвычайно высокой чувствительностью к молекулярным взаимодействиям, позволяя выявлять изменения на уровне отдельных химических связей в хромофорах и белковых субъединицах РЦ в ответ на процессы переноса электрона и разделения зарядов [Lutz and Mantele, 1991]. Это делает дифференциальную ИК-Фурье- спектроскопию одним из наиболее адекватных методов для изучения структурной и электронной организации кофакторов переноса электрона в различном окружении и в различных редокс-состояниях в РЦ Cf. aurantiacus.
Точечные мутации аминокислот в окружении кофакторов дают ценную информацию об особенностях пигмент-белковых взаимодействий и их роли в «подстройке» спектральных и окислительно-восстановительных свойств молекул- переносчиков электрона. Характерной особенностью РЦ и других фотосинтетических комплексов является тот факт, что молекулы (бактерио)хлоринов нековалентно связаны с белком. Однако недавно в нашей лаборатории были получены РЦ точечного мутанта Rb. sphaeroides I(L177)H, в которых одна из молекул БХл необычно прочно, возможно, ковалентно связана с L-субъединицей белка [Fufina et al., 2007]. В отсутствие кристаллографических данных большой интерес представляло исследовать особенности пигмент- белковых взаимодействий, вызванных замещением изолейцина L177 на гистидин, методами фотоиндуцированной дифференциальной ИК-Фурье-спектроскопии и кругового дихроизма (КД).
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - исследование электронных свойств и молекулярных взаимодействий кофакторов переноса электрона в нативных и генетически модифицированных реакционных центрах фотосинтезирующих бактерий методом фотоиндуцированной дифференциальной ИК-Фурье-спектроскопии.
В работе были поставлены следующие задачи:
-
Методом фотоиндуцированной дифференциальной ИК-Фурье- спектроскопии исследовать молекулярные и электронные свойства катион- радикала первичного донора электрона P+ в РЦ Cf. aurantiacus при комнатной и криогенной температурах.
-
Исследовать взаимодействия бактериофеофитинового акцептора электрона HA с белковым окружением в нейтральном и анион-радикальном состояниях в РЦ Cf. aurantiacus.
-
Изучить особенности структуры и взаимодействий первичного донора электрона P в мутантных РЦ Rb. sphaeroides I(L177)H с прочно связанной молекулой бактериохлорофилла.
Научная новизна и практическая значимость работы. На основе сравнения фотоиндуцированных дифференциальных ИК-Фурье-спектров P+QA- /PQa РЦ Cf. aurantiacus и Rb. sphaeroides R-26 получены новые доказательства в пользу димерной структуры P+ в РЦ Cf. aurantiacus и охарактеризованы его электронные и молекулярные свойства. Впервые зарегистрирован фотоиндуцированный HA-/HA дифференциальный ИК-Фурье-спектр для РЦ Cf. aurantiacus. Выявлены особенности HA-/HA ИК-Фурье-спектра РЦ Cf. aurantiacus по сравнению с исследованными ранее спектрами нативных и мутантных РЦ пурпурных бактерий. На этой основе получены новые данные о взаимодействиях бактериофеофитинового акцептора электрона с белковым окружением в нейтральном состоянии HA и их изменениях в анион-радикальном состоянии HA-. Получены новые данные о структуре первичного донора электрона в мутантных РЦ Rb. sphaeroides I(L177)H с прочно связанной молекулой БХл. Показано, что в данных РЦ первичный донор электрона сохраняет димерную структуру. Предложен возможный механизм образования ковалентной связи между L- субъединицей белка РЦ и БХл, основанный на реакции переэтерификации серина L244 и 17 -эфирной группы молекулы Pa.
Результаты диссертационного исследования представляют также интерес с прикладной точки зрения и могут быть использованы при разработке высокоэффективных искусственных преобразователей солнечной энергии, включающих в своем составе фотосинтетические РЦ, или использующих принципы функционирования природных фотосинтетических систем.
Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены на следующих российских и международных конференциях: "Биология - наука ХХІ века" (Пущино, 2005); "Ломоносов-2009" (Москва, 2009); VI Съезд Российского фотобиологического общества (Шепси, 2011); XX Пущинские чтения по фотосинтезу (Пущино, 2012).
По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 3 в рецензируемых журналах.
Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, объекты и методы исследования, результаты и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа содержит 38 рисунков и 1 таблицу. Список литературы включает 249 источников.
