Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ
Термостабильная ДНК-полимераза, выделенная из штамма Therraus aquaticus (Taq-полимераза), в настоящее время широко используется для специфической амплификации выбранных участков ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Способность Taq-полимеразы длительное время сохранять активность в режиме 75-95*С и синтезировать ДНК при этих температурах дает возможность автоматизировать ПЦР. Использование высокоспецифических праймеров и оптимальных условий ПЦР позволяет получить целевой продукт с минимальными неспецифическими заменами нуклеотидов. Кроме того, высокая термостабильность Taq-полимеразы дает возможность успешно использовать ее при секвенировании участков ДНК по методу Сэнгера, т.к. во время секвенирования при повышенных температурах происходит .разрушение вторичной структуры участков ДНК, не прочитываемых ДНК-полимеразами в обычных условиях. Повсеместное применение метода ПНР в молекулярной биологии и генетике, а также для ДНК-диагностики инфекционных и наследственных заболеваний и идентификации личности с помощью генетических отпечатков пальцев, требует использования высококачественного фермента - Taq-полимеразы - ключевого фермента ПЦР. В то же время получение высокоочищенных препаратов Taq-полимеразы из природных штаммов Т.aquaticus связано с трудностями при выращивании этих термофильных бактерий и низким содержанием в них фермента ( < 0,03% клеточного белка), а также с большими потерями фермента в процессе его очистки.
Получение .эффективной экспрессии рекомбинантного гена Taq-полимеразы в клетках E.coli несомненно облегчило бы очистку этого фермента и снизило бы себестоимость его препаратов.
В этой связи представляет практический интерес создание на основе E.coli штамма-продуцента Taq-полимеразы с целью крупномасштабной биотехнологической наработки этого широко используемого фермента для удовлетворения потребностей лабораторий и диагностических центров нашей страны в
высококачественных препаратах Taq-полимеразы.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ. В работе были поставлены следующие экспериментальные задачи:
1. Клонировать ген термостабильной ДНК-полимераэы
Thermus aquaticus.
2. Сконструировать плазмиду, обеспечивающую накопление
Taq-полимеразы в клетках E.coli.
3. Разработать метод очистки рекомбинантной Taq-поли
меразы, экспрессирующейся в клетках E.coli.
4. Изучить основные свойства рекомбинантной Taq-поли
меразы.
5. Изучить возможность использования рекомбинантной
Taq-полимеразы для ПНР и ДНК-диагностики.
Клонирован ген Taq-полимеразы Thermus aquaticus YT-I. На основе E.coli С 600 создан термоиндуцибельный штамм-продуцент Taq-полимеразы.
В ходе выполнения диссертационной работы был разработан эффективный универсальный метод оптимизации экспрессии рекомбинантных генов в гетерологичном генетическом окружении.
Предложенные методы индукции и очистки рекомбинантной Taq-полимеразы позволяют получать высокоочищенные препараты фермента, пригодные для использования в ПЧР и секвенирова-нии по методу Сэнгера, с удельной активностью около 200000 ед/мг.
Препараты рекомбинантной Taq-полимеразы в настоящее время широко используются для ГСІР, секвенирования ДНК и ДНК-диагностики в таких институтах, как Институт общей генетики РАН, Институт молекулярной генетики, ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Научном центре молекулярной диагностики и лечения (ВНШИДЛ), а также в ряде других институтов и за рубежом.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация изложена на
Похожие диссертации на Клонирование и экспрессия в клетках E. coli гена ДНК-полимеразы термофильной бактерии Thermus aquaticus
