Содержание к диссертации
Введение
1. Аспарагиназа как противолейкозный препарат (обзор литературы) 10
1.1. Бактериальные аспарагиназы и история их изучения 10
1.2. Структурно-функциональные особенности аспарагиназы 15
1.3. Физико-химические свойства 24
1.4. Гидролиз аспарагина определяет противоопухолевое действие аспарагиназы 27
1.5. Глутаминазная активность - основная причина токсичности аспарагиназы 30
1.6. Современные терапевтические аспарагиназы 32
1.7. Актуальность разработки лекарственного препарата на основе аспарагиназы без глутаминазной активности 34
2. Материалы и методы 37
2.1. Генно-инженерные методы клонирования и экспрессии 38
2.2. Выделение рекомбинантного фермента методом колоночной хроматографии 42
2.3. Физико-химическая характеристика аспарагиназы 44
2.3.1 .Электрофорез в полиакриламидном геле 44
2.3.2. Изоэлектрофокусирование 44
2.3.3. Определение аспарагиназной активности 44
2.3.4.Опре деление концентрации белка. 45
2.3.5.0пределение температуры денатурации фермента 46
2.3.6.Определение стабильности фермента в растворе мочевины 46
2.3.7.0пределение стабильности фермента при многократных циклах замораживания - оттаивания 46
2.4. Определение равновесных кинетических констант 47
2.5. Определение цитотоксической активности аспарагиназы 47
2.6. Определение перекрестной иммуноспецифичности аспарагиназ 49
2.6.1. Получение специфических поликлональных антител 49
2.6.2. Определение уровня выработки антител методом прямого иммуноферментного анализа (ИФА) 50
3. Результаты и обсуждение 52
3.1 Получение рекомбинантного штамма-продуцента НрА 52
3.1.1. Клонирование гена НрА 52
3.1.2. Оптимизация генетической конструкции для экспрессии НрА в клетках E.coli 61
3.1.3. Характеристика рекомбинантного штамма продуцента 63
3.1.4. Экспрессия рекомбинантной НрА 64
3.2. Выделение аспарагиназы НрА 64
3.3. Характеристика рекомбинантной НрА 69
3.3.1. Физико-химические свойства 69
3.3.2. Каталитические свойства 74
3.3.3. Цитотоксическая активность 82
3.3.4. Перектестная антигенность НрА и ЕсА 85 3.4. Возможности практического применения НрА 87
Выводы 91
Приложение 1 92
Список литературы 95
- Бактериальные аспарагиназы и история их изучения
- Структурно-функциональные особенности аспарагиназы
- Выделение рекомбинантного фермента методом колоночной хроматографии
- Получение рекомбинантного штамма-продуцента НрА
Введение к работе
Данная работа посвящена одной из актуальнейших проблем современной биохимии, онкологии и медицины - созданию эффективных препаратов, подавляющих рост опухолевой клетки в результате целенаправленного воздействия на ее метаболизм. На сегодня единственным примером практического использования ферментов в онкотерапии является применение бактериальной аспарагиназы в схемах комбинированной химиотерапии острых лимфобластных лейкозов, лимфо- и ретикулобластом (Narta U.K., 2007). В последнее время появились сообщения о попытках использования аспарагиназы для лечения острой миелобластной лейкемии (Perel Y., et al, 2002), болезни Ходжкина и не-Ходжкинской лимфомы (Kobrinsky N.L., et al, 2001), меланосаркомы и множественной миеломы (Wriston J.C., et al, 1985).
Аспарагиназа (L-аспарагин-амидогидролаза; КФ 3.5.1.1.) катализирует гидролиз аспарагина с образованием аспарагиновой кислоты и иона аммония. Именно это свойство аспарагиназы и определяет ее противоопухолевое действие. При введении аспарагиназы в организм человека происходит снижение концентрации аспарагина в крови и тканевой жидкости. В лейкозных клетках, в отличие от нормальных тканей, активность аспарагинсинтазы снижена или полностью отсутствует. При снижении концентрации экзогенного аспарагина леикозные клетки испытывают дефицит этой аминокислоты, происходит ингибирование синтеза белка и нуклеиновых кислот, и, в конечном счете, гибель раковой клетки. Таким образом, достигается избирательная регрессия опухолевой ткани при аспарагиназной терапии.
Несмотря на большое число бактериальных аспарагиназ с установленным противоопухолевым действием, только два препарата аспарагиназы Escherihia coli (ЕсА) и Erwinia chrysanthemi (ErA) используются в клинической практике (Wriston J.C., et al, 1985). Широкий спектр функциональных нарушений, индуцированных применением аспарагиназы, включает в себя поражения печени и поджелудочной железы, панкреатит, тромбозы и эмболии, нейротоксичность и подавление иммунной системы. (Narta U.K., 2007). Осложнения аспарагиназной терапии снижают эффективность лечения, особенно в развивающихся странах, где обеспечение адекватной сопроводительной терапии является невозможным (Moola Z.B., et al, 1994).
Основной причиной токсичности аспарагиназы принято считать исчерпание внеклеточного глутамина вследствие частичной глутаминазной активности фермента. Kafkewitz и соавт. суммировали в своем обзоре результаты экспериментальных работ, которые показывают, что дефицит глутамина в организме заметно подавляет функцию иммунной системы, в то-время как дефицит аспарагина такого действия не оказывает (Kafkewitz D., et al, 1983). Поэтому поиск новых аспарагиназ с низкой глутаминазной активностью является актуальной задачей медицинской биологии.
Получение низкотоксичной аспарагиназы является особенно необходимым у нас в стране. В целях уменьшения потребности в сопроводительной терапии и трансфузиях компонентов крови современные отечественные протоколы лечения лейкозов предполагают отказ от высокодозной интенсивной химиотерапии. Напротив, разработанные оригинальные протоколы, как например "Москва - Берлин 91" (ОЛЛ-МБ 91), используют длительное, в течение нескольких месяцев, применение аспарагиназы в малых дозах (von Stackelberg A., et al, 1999). В связи с этим возникают новые требования к препарату аспарагиназы, главным из которых является его низкая токсичность. Применяемые в настоящее время терапевтические аспарагиназы, которые были введены в клиническую практику более 40 лет назад, не удовлетворяют современным требованиям к этим препаратам.
Попытки сделать аспарагиназу менее токсичной традиционно предпринимаются двумя путями. Первый из них предполагает снижение глутаминазной активности направленным мутагенезом аминокислотных остатков, определяющих субстратную специфичность фермента. Глутаминазная активность наиболее удачного мутанта ЕсА N248A была снижена в 2 раза по сравнению с ферментом дикого штамма. (Derst С, et al, 2000). Однако аспарагиназная активность этого производного ЕсА также была снижена и при физиологических условиях составляла не более 12% от первоначальной. Кроме того, была нарушена термодинамическая стабильность каталитически активной конформации. В целом, довольно сложно прогнозировать терапевтический эффект этого производного, а исследование биологического действия ЕсА N248A так и не было проведено.
Второй подход, состоящий в поиске новых аспарагиназ с , Низкой глутаминазной активностью, и был реализован в данной работе.
Цель данного исследования состояла в разработке метода получения рекомбинантной аспарагиназы Helicobacter pylori и характеристике ее терапевтически значимых свойств.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи исследования:
1. Клонирование и экспрессия гена НрА в клетках E.coli. Получение рекомбинантного штамма-продуцента, обеспечивающего устойчивую экспрессию НрА.
2. Разработка лабораторного способа выделения гомогенного препарата НрА, пригодного для создания на его основе крупномасштабного метода получения фермента.
3. Характеристика терапевтически значимых физико-химических и каталитических свойств НрА.
4. Определение цитотоксической активности НрА по отношению к клеткам лейкозов человека.
5. Сравнение антигенности НрА и основной терапевтической аспарагиназы ЕсА.
Научная новизна работы, прежде всего, состоит в выделении и характеристике новой бактериальной аспарагиназы. Впервые клонирован ген периплазматической аспарагиназы из штамма Helicobacter pylori, получен рекомбинантный штамм E.coli, продуцирующий НрА. Разработаны оптимальные условия экспрессии, разработан простой и эффективный способ очистки, что позволило впервые получить гомогенный препарат НрА. Проведена детальная характеристика физико-химических и каталитических свойств НрА. Определены кинетические константы гидролиза основных физиологических субстратов НрА - аспарагина и глутамина. Показано, что глутаминазная активность фермента не превышает 0,01% от аспарагиназной активности. Установлено, что НрА обладает высокой цитотоксической активностью в отношении клеток острого лимфобластного лейкоза MOLT-4, лимфомы Беркитта Raji, а также хронического миелоидного лейкоза К-562. Показано, что НрА вызывает гибель лейкозной клетки по механизму апопотоза. Установлено, что НрА иммунохимически отлична от аспарагиназы E.coli.
Практическая ценность результатов данной работы главным образом состоит в их применении для разработки нового противолейкозного препарата. Острый лимфобластный лейкоз является самым частым онкологическим заболеванием в педиатрии. На его долю приходится более 30% всех опухолей у детей (Павлова М.П., 1996). Ежегодно в России регистрируют до 3000 новых случаев этого заболевания (Кривошеина Е.Л., 2005). Установленные в данной работе свойства НрА обеспечат лекарственному препарату на его основе ряд существенных преимуществ перед современными терапевтическими аспарагиназами: (а) низкая токсичность позволит избежать развития множества побочных эффектов, типичных для аспарагиназной терапии; (б) низкая себестоимость его производства как рекомбинантного фермента уменьшит стоимость лечения; (в) отличная от Ее А антигенность НрА указывает на возможность использования фермента для заместительной аспарагиназной терапии. Учитывая, что в нашей стране аспарагиназа никогда не производилась, результаты данной работы представляют интерес в качестве основы для создания первого отечественного препарата для лечения различных форм лейкозов.
Диссертационная работа построена по традиционному плану и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», раздела «Результаты исследования и их обсуждение», выводов и списка цитируемой литературы, включающего 147 источников. Работа изложена на 109 страницах машинописного текста, содержит 32 рисунка и 11 таблиц.
Результаты исследования доложены на конференциях: научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2007), Международной научной конференции «Перспективы современной медицинской науки» (Винница, 2007), , международном конгрессе «ПЕРСПЕКТИВА- 2007» (Нальчик, 2007). По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 5 тезисов докладов. Апробация диссертации состоялась на межлабораторном семинаре ГУ НИИ БМХ РАМН 27 мая 2008 года.
Исследование выполнено на базе ГУ НИИ БМХ РАМН при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований и Международного Научно Технического Центра (США).
Бактериальные аспарагиназы и история их изучения
Фермент, катализирующий гидролиз L-аспарагина с образованием L-аспарагиновой кислоты и аммиака, был впервые обнаружен в начале прошлого века в тканях животных и в экстрактах грибов и впоследствии назван аспарагиназой. У животных высокое содержание аспарагиназы было обнаружено в сыворотке крови морской свинки (Broome J.D., 1961), и всех представителей надсемейства Cavioidea (Old L.J., et al., 1963).
В 1953 году Kidd (Kidd J.G., 1953) показал, что введение сыворотки морской свинки приводит к ингибированию роста некоторых трансплантируемых лейкозов у мышей, а спустя несколько лет Broome установил, что за противоопухолевый эффект ответственна именно аспарагиназа (Broome J.D., 1963). Это открытие и послужило толчком к интенсивному изучению аспарагиназы.
Последующие работы показали, что фермент широко распространен не только у эукариот, но и у бактерий (Wriston J.C. 1985). Было установлено, что бактериальная аспарагиназа встречается в виде двух изоформ (Cedar Н. и Schwartz J.H., 1967). Аспарагиназа 1-го типа является цитоплазматическим ферментом. Она экспрессируется конститутивно и, по-видимому, необходима для утилизации аспарагина в качестве источника углерода (Willis R.C. и Woolfolk С.А., 1974, Spring K.J., 1986). Аффинность цитоплазматического фермента к аспарагину довольно «низкая»: соответствующая Кт лежит в миллимолярном диапазоне. Кинетические исследования аспарагиназы 1-го типа показывают, что это аллостерический фермент с положительной кооперативностью. Примерами в данном случае могут служить аспарагиназы из штаммов Lactobacillus plantarum (Nalepka E.R., et al., 1981), Saccharomyces cerevisiae (Dunlop P.C., et al., 1978), Bacillus coagulans (Law A.S., et al., 1971). Рентгеноструктурный анализ цитоплазматической аспарагиназы I из штамма E.coli (AsnA) позволил идентифицировать аллостерический центр связывания субстрата и выявил изменения в конформации AsnA, происходящие при связывании с субстратом (Yun М.К., et al, 2007).
Периплазматическая аспарагиназа 2-го типа является индуцибельным ферментом и синтезируется в клетке преимущественно в анаэробных условиях, когда- бактерия испытывает недостаток Сахаров и/или переизбыток аминокислот (Cedar Н. & Schwartz J.H., 1968). Фермент характеризуется кинетикой Михаэлиса-Ментен, микромолярной аффинностью к аспарагину и высокой скоростью обращения (kcatL"asn 106 с"1, (Derst С, et al, 2000)). Роль этой изоформы аспарагиназы в микробном метаболизме в настоящее время не установлена. Однако именно периплазматическая аспарагиназа обладает противоопухолевым действием, в то время как у цитоплазматического фермента такого свойства не обнаружено (Schwartz J.H., et al, 1966). Поскольку данная работа.посвящена изучению именно периплазматической аспарагиназы, то в дальнейшем для удобства и простоты изложения мы будет употреблять термин «аспарагиназа» только применительно к ферментам 2-го типа.
Первые данные о цитотоксическом и противоопухолевом эффектах бактериальной аспарагиназы были получены для фермента E.coli (ЕсА), который впоследствии стал одним из незаменимых противолеикозных препаратов. Аспарагиназа E.coli эффективно ингибировала рост лимфосаркомы 6C3HED и лейкоза DBA/22 PI534 (Mashburn L.T., Wriston J.I., 1964, 1966). Позднее было установлено, что в основе механизма противоопухолевого действия фермента лежит уменьшение в организме концентрации внеклеточного аспарагина. При этом происходит избирательное ингибирование пролиферации лейкозных клеток, которые отличаются от нормальных тканей крайне низкой активностью аспарагинсинтазы, что и обусловливает их зависимость от уровня внеклеточного аспарагина (Wriston J.C., 1985; Keefer J.F. et al., 1985). С другой стороны формирование резистентности клеток к аспарагиназе также может быть связано с регуляцией аспарагином синтеза аспарагинсинтазы на уровне транскрипции гена этого фермента. Об этом свидетельствуют данные Hutson et al., показавших, что в клетках гепатомы Fao крысы и клетках лейкоза человека линий MOLT-4, NALL-1 и BALL-1 уровень мРНК аспарагинсинтазы и активность фермента резко возрастают после инкубации клеток в присутствии аспарагиназы или в среде, не содержащей аспарагин (Hutson R.G., et al. 1997). Однако результаты современных исследований подвергают сомнению роль индукции аспарагинсинтазы в развитии клеточной устойчивости (Aslanian A.M., et al, 2001, Fine B.M., et al, 2005, Stams W.A., et al, 2003). В настоящее время становится очевидным, что для установления молекулярных механизмов индуцированной лекарственной устойчивости необходимо принимать во внимание не только особенности метаболизма раковой клетки, но и ее микроокружения. (Williams D.A., 2007).
К факторам, определяющим эффективность фармакологического действия аспарагиназы in vivo, следует отнести высокую каталитическую активность и стабильность фермента при физиологических условиях, низкое значение Кт и медленный клиренс из крови, отсутствие потребности в кофакторах и простетических группах. Помимо этого, продукты катализируемой аспарагиназой реакции даже в высоких концентрациях не ингибируют активность фермента и не являются токсичными метаболитами для организма.
Структурно-функциональные особенности аспарагиназы
Бактериальные аспарагиназы (а-амидогидролазы, КФ 3.5.1.1) гидролизуют аспарагин и глутамин с образованием соответствующих кислот и иона аммония.
На основе субстратной специфичности выделяют два класса этих ферментов. Первый класс включает в себя высокоспецифичные аспарагиназы, которые преимущественно используют аспарагин в качестве субстрата. Типичными представителями этого класса являются периплазматические аспарагиназы из штаммов E.coli (ЕсА), Erw. carotovora (EwA), Erw.chrysanthemi (ErA), Wolinella succinogens (WsA). Ферменты второго класса, также именуемые аспарагиназами-глутаминазами, одинаково эффективно дезаминируют как аспарагин, так и глутамин. Наиболее известными примерами таких гидролаз являются аспарагиназы, выделенные из штаммов Psendomonas 7A (PsA) и Acinetobacter glutaminasificans (AgA). Представители обоих классов обладают цитотоксическими свойствами, прежде всего в отношении лейкозных клеток. Однако непосредственное практическое применение нашли только высокоспецифичные аспарагиназы, т.к. высокая глутаминазная активность ферментов 2-го класса оказалась ответственной за токсичность аспаргиназной терапии (Ollenschlager G., et al, 1988). Например, исследование противоопухолевого действия PsA на мышах показало, что именно глутаминазная активность вызывает большинство побочных эффектов (Roberts J., et al, 1979). В то же время, токсичность аспарагиназ с низкой глутаминазной активностью, таких, как ЕсА или WsA, оказывалась существенно ниже, чем у аспарагиназ-глутаминаз (Distasio J.A., etal, 1982).
К сегодняшнему дню определены пространственные структуры 6 бактериальных аспарагиназ: ЕсА, WsA, ЕгА, EwA, PsA, AgA. Ферменты были кристаллизованы как в отсутствие лиганда (AgA и WsA) (Lubkowski J., et al, 1994, 1996), так и в присутствии молекулы L-аспарагиновой кислоты в активном центре (ЕсА и ЕгА) (Swain A.L., et al, 1993; Miller M., et al, 1993). В случае ЕгА и PsA в активном центре находился ион сульфата S04 " (Miller М., et al, 1993; Jakob C.G., et al, 1997). Также были получены кристаллические структуры ковалентных комплексов PsA с необратимыми ингибиторами 6-диазо-5-окси-Ь-норлейцином (DON) и 5-диазо-4-окси-Ь-норвалином (DONY) (Ortlund Е., et al, 2000). Рентгеноструктурный анализ мутантов ЕсА Tyr25Phe (Kozak М., et al, 2000) и Asp90Glu (Kozak M., et al, 2002) позволили определить роль отдельных стадий в механизме ферментативного катализа аспарагиназой, а также зафиксировать ацилирование фермента как промежуточную стадию катализа (T89V, Palm G.J., etal, 1996).
Эти интенсивные исследования позволили детально охарактеризовать общие структурные свойства аспарагиназ. Как было установлено, все бактериальные аспарагиназы кристаллизуются преимущественно как гомо-тетрамеры с 222 симметрией. Каждый мономер состоит из 330 аминокислотных остатков, которые образуют 14а-спиралей и 8 Р-слоев. В третичной структуре мономера четко выделяются два домена. Больший по размеру N-концевой домен связан с С-концевым линкером длиной около 20 аминокислотных остатков (рис. 1А).
В N-домене расположен каталитический «карман» и здесь же находятся высококонсервативные для всех аспарагиназ аминокислотные остатки Ser62ErA, Glu63ErA, Thr95ErA, Asp96ErA, А1а120ЕГл, которые участвуют в связывании субстрата в активном центре, а также активный треонин (Thrl5ErA), который и осуществляет катализ посредством нуклеофильной атаки карбонильного углерода (амидной связи) субстрата (рис. 1, 3) (Palm G.J., et al, 1996). При образовании димера два аминокислотных остатка С-концевого домена другого мономера Gln248EcA и Gln283EcA ограничивают пространство вокруг лиганда. Именно эти остатки определяют стерический размер активного центра, и тем самым величину глутаминазной активности фермента.
Таким образом, образование димера завершает формирование активного центра. При этом каталитический «карман» находится в углублении, вход в который полностью закрывает так называемая подвижная петля активного центра, состоящая из —20 аминокислотных остатков (Lubkowski J., et al, 1994; Aung H.P., et al, 2000). Когда эта петля находится в так называемом «открытом» состоянии, вход в активный центр свободен, и лиганд может либо войти, либо покинуть каталитический «карман» (рис. 1 С).
Выделение рекомбинантного фермента методом колоночной хроматографии
Объединенные фракции после SP-Сефарозы помещали в ячейку-концентратор Amicon объемом 12 мл, содержащую фильтр Millipore (Ultrafiltration membrane NMWL 30000), и центрифугировали (Beckman «Avanti 25», JA-25,5 4000 об/мин). Обессоливание белка проводили либо ультрафильтрацией на ячейке Amicon, либо с помощью гель-фильтрации на колонках PD10 с Сефадексом G-25 («Loba Feinchemie»).
Электрофорез проводили по методу Леммли. Гель толщиной 0,75 мм, содержащий 10-12% ПАА, окрашивали Coomassie brilliant blue G-250 , используя фиксирующий раствор (0,5% Coomassie G-250, 10% ледяная уксусная кислота, 20% этанол) в течение 30-40мин. Отмывали гель водой, при необходимости подвергали кратковременному кипячению. В качестве маркеров использовали белковые стандарты («Pharmacia Biotech») в интервале молекулярных масс 10 - 250 кДа.
Изоэлектрофокусирование проводили на колонке LKB8100 Ampholine фирмы «LKB» (область рН 7 - 9) согласно Остерману Л.А., 1983. ИЭТ модифицированного фермента была сопоставлена с ИЭТ, предсказанной на основании нуклеотидной последовательности гена НрА с помощью программы GeneRunner.
Активность рекомбинантной L-аспарагиназы определяли методом прямой несслеризации (Meister А., 1955), который основан на измерении концентрации аммиака, высвобождаемого при гидролизе L-аспарагина. Для этого в 450 мкл 0,0125 М боратного буфера, рН 8,5, содержащего 40 мМ L-аспарагин, вносили 2-20 мкл образца и инкубировали смесь при 37С в течение 2-10 мин. Реакцию останавливали добавлением 250 мкл 20%-ного раствора ТХУ, после чего 250 мкл полученной смеси переносили в 2 мл дистиллированной воды и добавляли 250 мкл реактива Несслера. Аналогично готовили контрольные пробы. Интенсивность окрашивания измеряли на фотоэлектрическом фотометре КФК-3 при 500 нм.
За единицу активности L-аспарагиназы (ME - международная единица) принимали количество фермента, которое катализирует высвобождение 1 мкмоль аммиака за 1 мин при 37С. Удельную активность выражали в единицах активности L-аспарагиназы в расчете на 1 мг белка.
Качественное определение L-аспарагиназы во фракциях после колоночной хроматографии проводили с помощью планшетного микрометода, как описано в работе (Борисова А., 2003). Метод включает инкубацию 10-50 мкл аликвоты белковой фракции и 50 мкл аспарагина (30 мг/мл в 0,0125 М боратном буфере, рН 8,5) в лунках планшета при 37С в течение 10-20 мин, с последующим определением ионов аммония методом прямой несслеризации. Контрольные пробы раствор L-аспарагина.
Белок определяли модифицированным методом Лоури (Hartree E.F., 1991). В ряде случаев концентрацию белка определяли методом Бредфорда (Досон Р., и др., 1991), измеряя оптическую плотность растворов в 96-ти луночных планшетах при длине волны 540 нм на многоканальном спектрофотометре «Multiscan ЕХ». Для обоих методов калибровочную кривую строили по раствору БСА в интервале концентраций белка 10-300 мкг. Также концентрацию очищенной аспарагиназы измеряли спектрофотометрически по поглощению при длине волны 280 нм. Коэффициент экстинкции принимали равным є0 %28о =0,61 («ProtParam», www.expasy.org).
Аликвоты аспарагиназы, содержащие 50-75 мкг белка, добавляли к 450 мкл фосфатно-солевого буферного раствора, рН 7,0, предварительно прогретого или охлажденного до необходимой температуры, при которой смесь инкубировали в течение 15 мин.
Получение рекомбинантного штамма-продуцента НрА
Цель данной работы состояла в получении аспарагиназы с низкой глутаминазной активностью. В настоящее время только один фермент из штамма Wolinella succinogens (WsA) претендует на звание аспарагиназы, свободной от глутаминазной активности (Distasio J., et al, 1982). В работе, посвященной выделению и характеристике этого нативного фермента, указывалось, что скорость гидролиза глутамина составляет 0,015 % от его аспарагиназной активности. Однако эти данные не были подтверждены для рекомбинантного фермента, экспрессированного в E.coli (Derst С, et al, 2000). Тем не менее, за отсутствием другой отправной точки, было решено получить фермент, наиболее гомологичный WsA. Поиск по подобию в базе белковых и транслированных нуклеотидных последовательностей GeneBank, (доступной на сервере NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov) программой BLAST с использованием аминокислотной последовательности аспарагиназы WsA (САА61503) показал, что аспарагиназа штамма Helicobacter pylori (NP_223379) является одним из 10 наиболее близких гомологов WsA (рис. 11). Степень идентичности НрА и WsA составляет 53% , а гомологии — 73% (табл. 3). Геномная ДНК этого микроорганизма была любезно предоставлена доктором К. Мамонолиевым (ЗАО «ПИННИ», www.pynny.ru).
Бактериальные аспарагиназы 2-го типа являются периплазматическими ферментами, которые характеризуются наличием сигнального пептида. Наличие сигнального пептида в аминокислотной последовательности НрА было предсказано с вероятностью 0,98 программой SignalP 3.0 (www.cbs.dtu.dk/sei-vices/SignalP; Nielsen Н., et al, 1997; Bendtsen J.D., et al, 2004) (рис. 12). Положение сайта протеолиза между Glu20 и Asn21 аминокислотными остатками было определено с вероятностью 0,965.
На основе анализа нуклеотидной последовательности mRNA аспарагиназы НрА (NM_001065) были подобраны следующие праймеры
НрА-М (EcoRI) 5 СТд дАА ТТС АТд АдА АТд ТТТ ТТд AAA Т-3 НрА- М (Ndel) 5 -CAT CAT АТд дСТ САА ААТ ТТА ССС АСС АТТ дС-3 НрА- М {Ncol) 5 -САд ССА Тдд СТС AAA АТТ ТАС ССА ССА ТТд С-3 НрА-Р (Ecorl) 5 -CTG GAA ТТС ATG AGA ATG ТТТ TTG AAA Т -3 НрА-Р (Ndel) 5 СА CAT АТд АдА АТд ТТТ ТТд AAA ТТд-3 HpA-R (NotI) 5 -Т дСд дСС дСТ ТАА ТАС ТСТ ТСА ААС АТТ ТС-3 для амплифицикации гена предшественника аспарагиназы (НрА-Р) и фрагмента гена, соответствующего процессированой (без сигнального пептида) форме фермента (НрА-М) (рис. 10). Обратный праймер HpA-R использовался для амплификации обоих форм. Сайты рестрикции, введенные в праймеры, выделены жирным шрифтом. Фрагменты ожидаемого размера были амплифицированны после оптимизации параметров ПЦР (рис. 13). Условия амплификации гена НрА суммированы в табл. 4 и 5. Температура отжига, равная 54С, обеспечивала максимальный выход ПЦР-продукта, тем не менее, эффективность амплификации полноразмерной формы гена НрА была существенно ниже, чем для его процессированной формы. Добавления диметилсульфоксида или глицерина в реакционную смесь в качестве ПЦР-энхансеров не увеличивали выход амплификата.
После экстракции из 1% агарозного геля фрагменты ДНК были клонированы в ТА-вектор pGEM Easy {«Promega»). Селекция клонов, предположительно содержащих целевые амплификаты, была проведена с помощью бело-синего теста (Zhou M.-Y., et al, 1995; Kobs G., 1997).
Рестрикция ферментом EcoRI плазмиды pGEM Easy, выделенной из отобранных трансформантов, показала наличие вставки размером -1 кб (рис. 14). Вектор, несущий полноразмерный ген НрА, был обозначен pGEM/HpA-P, а плазмида, содержащая фрагмент гена, соответствующий процессированой форме аспарагиназы, была названа pGEM/HpA-M.
EcoRI/NotI фрагменты pGEMEasy/HpA-P были клонированы в экспрессирующий вектор pACYCI77. Эта плазмида была специально оптимизирована для экспрессии аспарагиназы EwA (Соколов Н.Н., 2005). Поскольку имевшийся в распоряжении вектор pACYC177 уже содержал ген аспарагиназы EwA, результирующие трансформанты были протестированы с помощью ПЦР на наличие гена аспарагиназы НрА (рис. 15В). В качестве контроля эти же колонии были проверены с помощью ПЦР на отсутствие гена аспарагиназы Erw.carotovora (рис. 15А). Клон №5 давал сильный ПЦР
Похожие диссертации на Клонирование, экспрессия и характеристика L-аспарагиназы Helicobacter pylori с противоопухолевой активностью
![Изучение белковых антигенов Helicobacter pylori на основе моноклональных антител [Электронный ресурс]](/i/i/4283/202634.png "Изучение белковых антигенов Helicobacter pylori на основе моноклональных антител [Электронный ресурс] Вечканов Евгений Михайлович")
