Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Общая характеристика хеликобактерий 14
1.1. История открытия, систематика и филогения Helicobacter pylori 14
1.2. Особенности клеточной и молекулярной биологии Helicobacter pylori 18
1.3. Факторы вирулентности и генетический полиморфизм штаммов Helicobacter pylori 29
Глава 2. Феноменология язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, ассоциированной с Helicobacter pylori 37
2.1. Особенности микробиоценозов желудка у больных язвенной болезнью 37
2.2. Особенности индуцированных Helicobacter pylori поражений слизистой оболочки желудка у больных язвенной болезнью: патофизиологические, цитологические и ультраструктурные аспекты 43
2.3. Полиморфизм генов ключевых иммуномедиаторов {IL-1 и IL-10) и его особенности при язвенной болезни 48
2.4. Контроль инфекций Helicobacter pylori: проблемы и перспективы 57
Экспериментальная часть 61
Глава 3. Материалы и методы 61
3.1. Особенности клинического материала 61
Выделение и очистка ДНК из проб 61
Выделение ДНК из крови 62
Выявление Helicobacter pylori в клиническом материале методом ПЦР 63
Выявление генов патогенности клинических изолятов Helicobacter pylori методом ПЦР 64
Выявление полиморфных вариантов генов IL-1 и IL- 10 65
Выявление Mycoplasma hyorhinis в клиническом материале методом ПЦР 67
Определение нуклеотидных последовательностей 67
Электронно-микроскопическое исследование образцов слизистой оболочки желудка больных язвенной болезнью 68
Статистическая обработка данных 68
Результаты исследований и их обсуждение 70
Частота встречаемости Helicobacter pylori и генотипы штаммов хеликобактера у больных язвенной болезнью 70
Распределение генотипов IL-1 и IL-10 у больных язвенной болезнью и представителей контрольной группы 80
Ассоциация генотипов H.pylori с полиморфными вариантами генов цитокинов IL-1 и IL-10 у больных язвенной болезнью 92
Частота встречаемости Mycoplasma hyorhinis в биоптатах больных язвенной болезнью и особенности генотипов H.pylori и полиморфных локусов генов цитокинов (IL-1 и IL-10) в случае сочетанной (Hpyhri+M. hyorhinis) инфекции 95
4.5. Особенности ультраструктуры эпителия слизистой желудка у больных язвенной болезнью желудка с разными генотипами H.pylori и полиморфных локусов генов цитокинов (IL-1 и IL-10) при наличии и отсутствии сочетанной (H.pylori+M. hyorhinis) инфекции 101
4.6. Особенности морфометрических показателей язв у больных с различными генотипами полиморфных локусов генов цитокинов {IL-1 и IL-10), штаммов H.pylori, а также в случае сочетанной (H.pylori+M.hyorhinis) инфекции ПО
Заключение 119
Выводы 122
Список литературы 124
Приложение 155
- История открытия, систематика и филогения Helicobacter pylori
- Факторы вирулентности и генетический полиморфизм штаммов Helicobacter pylori
- Особенности индуцированных Helicobacter pylori поражений слизистой оболочки желудка у больных язвенной болезнью: патофизиологические, цитологические и ультраструктурные аспекты
- Выявление Mycoplasma hyorhinis в клиническом материале методом ПЦР
Введение к работе
Актуальность проблемы. Helicobacter pylori является одной из наиболее изучаемых бактерий в мире в настоящее время. Носителем H.pylori является почти каждый второй житель планеты. Инфицирование возможно как непосредственно от человека или животных, так и опосредованно, в том числе через эндоскопические аппараты и стоматологические инструменты [Fontham, 1995; Feldman, 1998; De Schryver et al., 2001].
Для большинства инфицированных характерно бессимптомное носительство. Вместе с тем предполагается наличие взаимосвязи между инфекцией H.pylori и рядом заболеваний у человека [Bohr et al., 2007]. Однако пока доказана связь инфицирования слизистой оболочки желудка (СОЖ) человека H.pylori с гастродуоденальной патологией – В-клеточной лимфомой, хроническим гастритом, а также язвенной болезнью (ЯБ) желудка и двенадцатиперстной кишки [Van Doorn et al., 1998] – одним из наиболее распространенных заболеваний желудочно-кишечного тракта у человека [Ивашкин и др., 2003; Григорьев, Яковенко, 2004].
Основным документом, определяющим показания и подходы к лечению язвенной болезни желудка (ЯБЖ) и двенадцатиперстной кишки (ЯБДК), ассоциированной с H.pylori, является Маастрихтский консенсус II и III [Malfertheiner et al., 2002, 2005]. Однако в большинстве случаев результат применения соответствующих схем лечения не достигает необходимых 80% [Malfertheiner et al., 2005]. Основными причинами недостаточной эффективности предлагаемых методов лечения считают неизученность молекулярно-генетических аспектов заболевания ЯБ, ассоциированной с H.pylori, в том числе молекулярно-генетических основ восприимчивости и чувствительности к персистенции H.pylori у разных индивидов [Ando et al., 2007], а также отсутствие учета региональных особенностей хеликобактерных инфекций [Абдулхаков, 2006].
Различия восприимчивости и чувствительности к персистенции H.pylori связывают с вариабельностью генотипов хеликобактера в отношении факторов вирулентности, а также полиморфизмом генов иммунного ответа у носителей инфекционных агентов. Предполагают, что развитие ЯБЖ и ЯБДК может быть ассоциировано с наличием у индивидов определенных генотипов хеликобактера (cagA, iceA, babA и vacA), а также вариантов полиморфных локусов генов ключевых иммуномедиаторов про- и противовоспалительных реакций – IL-1 (IL-1B-511C>T, IL-1B+3954C>T, IL-1RN(VNTR)) и IL-10 (IL-10-1082G>A) [Garcia-Gonzalez et al., 2001, 2003; Rad et al., 2003, 2004]. Предполагается, что носители определенных генотипов полиморфных локусов генов цитокинов (IL-1 и IL-10) могут колонизироваться специфичными в отношении факторов вирулентности штаммами H.pylori, а распределение генотипов H.pylori и полиморфных локусов генов цитокинов, а также их ассоциации у индивидов в разных регионах различаться [Garcia-Gonzalez et al., 2003; Rad et al., 2004]. В последнее время появились сообщения, что существенным фактором развития гастродуоденальной патологии может быть колонизация СОЖ микоплазмами, в частности, Mycoplasma hyorhinis [Huang et al., 2001; Kwon et al., 2004]. Однако систематические исследования для проверки всех вышеуказанных предположений в разных регионах мира не проводились.
Цель данной работы - определить особенности генотипов H.pylori и полиморфных локусов генов цитокинов (IL-1 и IL-10) у больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки в г. Казани.
Основные задачи исследования:
1. Протестировать биоптаты больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки на наличие Helicobacter pylori и определить частоту встречаемости бактерий в исследуемых образцах.
2. Выполнить типирование штаммов H.pylori по генам факторов вирулентности (cagA, iceA, babA и аллелям m1, m2, s1, s2 гена vacA) у больных язвенной болезнью и провести анализ распределения генотипов H.pylori в обследуемой группе.
3. Определить варианты полиморфных локусов генов IL-1B (IL-1B-511C>T, IL-1B+3954C>T, IL-1RN(VNTR)) и IL-10 (IL-10-1082G>A) у больных язвенной болезнью, а также в контрольной группе и провести анализ распределения частоты их встречаемости в обследуемых группах.
4. Провести ассоциативный анализ генотипов H.pylori и полиморфных локусов генов цитокинов (IL-1 и IL-10) у больных язвенной болезнью.
5. Протестировать биоптаты больных язвенной болезнью на наличие M.hyorhinis, определить частоту встречаемости сочетанной (H.pylori+M.hyorhinis) инфекции СОЖ и провести ассоциативный анализ распределения генотипов H.pylori, а также полиморфных локусов генов цитокинов (IL-1 и IL-10) в отношении хеликобактерно – микоплазменной инфекции в обследуемой группе.
6. Выполнить сравнительный анализ ультраструктуры эпителия СОЖ у больных ЯБЖ с разными генотипами H.pylori и полиморфных локусов генов цитокинов (IL-1 и IL-10) при наличии и отсутствии сочетанной (H.pylori+M.hyorhinis) инфекции.
7. Провести ассоциативный анализ морфометрических показателей язвенных дефектов и генотипов H.pylori, а также вариантов полиморфных локусов генов цитокинов (IL-1 и IL-10) у больных язвенной болезнью при наличии и отсутствии сочетанной (H.pylori+M.hyorhinis) инфекции.
Научная новизна. Впервые проведено исследование особенностей распределения генотипов штаммов Helicobacter pylori, определяющих вирулентность бактерий, и полиморфных локусов генов цитокинов (IL-1 и IL-10) в группе больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки (жители г. Казани) при наличии и отсутствии сочетанной сочетанной (H.pylori+M.hyorhinis) инфекции. Показано, что слизистая оболочка желудка всех больных ЯБ инфицирована H.рylori и установлено, что штаммы H.рylori с генотипами, определяющими высокую вирулентность хеликобактера, достоверно чаще встречаются в исследуемых образцах.
У 19% больных ЯБ обнаружено сочетанное (H.pylori+M.hyorhinis) инфицирование слизистой желудка. Установлено, что хеликобактерно-микоплазменная инфекция достоверно чаще встречается у больных ЯБЖ и ЯБДК с комбинацией генотипов IL-1B-511*Т/*Т, IL-1B+3954*С/С, IL-1RN2/2, IL-10-1082А/G (p<0,05).
Выявлены молекулярно-генетические маркеры предрасположенности к ЯБЖ и ЯБДК. Обнаружено, что аллель IL-1B-511*C и генотип IL-1B-511*C/*C повышают риск развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, ассоциированной с H.pylori, а аллель IL-1B-511*Т, генотип IL-1B-511*C/*Т – снижают вероятность формирования заболевания. Показано, что больные язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки, ассоциированной с H.pylori, являющиеся носителями сочетания генотипов IL-1В–511*Т/*С, IL-1В+3954*С/*С, IL-1RN*1/*1, IL-10-1082*G/*G, инфицированы преимущественно низковирулентными штаммами хеликобактера. Установлено, что возможность самопроизвольного рубцевания язвенных дефектов больных ЯБДК ассоциирована с генотипами cagAvacAs1 штаммов H.pylori, а также IL-1RN(VNTR) индивидов.
Впервые показано, что особенности патологических изменений ультраструктуры СОЖ у больных ЯБ различаются в зависимости от генотипов хеликобактера, полиморфных локусов генов цитокинов (IL-1 и IL-10), а также наличия сочетанной (H.pylori+M.hyorhinis) инфекции.
Научно-практическая значимость. Результаты работы вносят вклад в представление о молекулярно-генетических аспектах язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, ассоциированной с H.pylori, и их региональных особенностях. Впервые выявлены генетические маркеры предрасположенности к заболеванию и его особенностям у индивидов в г. Казани.
Полученные данные могут быть использованы в научно-практических исследованиях механизмов формирования системы «паразит - хозяин» и связанной с ней гастродуоденальной патологии для разработки дифференцированных региональных программ, а также индивидуальных схем лечения и профилактики язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, ассоциированной с H.pylori. Результаты работы могут быть также использованы в курсах лекций по биохимии, микробиологии, молекулярной генетике, гастроэнтерологии и молекулярной медицине в ВУЗах.
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследование. Работа в течение 2001-2008 гг. проводилась в соответствии с планом научных исследований КИББ КазНЦ РАН по теме «Взаимодействие микоплазм с высшими организмами на молекулярно-генетическом уровне» (№ гос. рег. 0120.0 603845). Исследования поддержаны грантами ФОНДа НИОКР РТ: 03-3.10-163 «Полиморфизм микроорганизмов, ассоциированных с заболеваниями желудочно-кишечного тракта в популяциях народов Республики Татарстан: особенности ультраструктуры и генетической вариабельности клинических изолятов Helicobacter pylori и микоплазм», 2001-2003 гг. и ФОНДа НИОКР РТ: 03-3.10-361/ 2005 «Генетический полиморфизм в популяциях народов Республики Татарстан: вариабельность генов цитокинов у пациентов с гастродуоденальными и урогенитальными заболеваниями при персистенции хеликобактерий и микоплазм», 2002-2005 гг.
Научные положения диссертации базируются на результатах собственных исследований автора. Автор выражает благодарность к.б.н. Акберовой Н.И. (каф. биохимии Казанского государственного университета) за помощь в проведении статистического анализа полученных результатов; проф. Борхсениусу С.Н. (зав. лаб. структурной организации генома Института цитологии РАН, г.Санкт-Петербург) за предоставление образцов ДНК референтного штамма M.hyorhinis М20; к.б.н. Шаймардановой Г.Ф. (КИББ КазНЦ РАН, г.Казань) за проведение электронно-микроскопического исследования образцов СОЖ; к.м.н. Сайфутдинову И.М. и Давлиеву М.К. (МКДЦ, г.Казань) за предоставление биоптатов СОЖ, полученных в результате проведенной ими фиброгастродуоденоскопии; а также к.б.н. Т.А.Акопиан (ФГУ НИИ физико-химической медицины Минздрава РФ, г.Москва) за определение нуклеотидных последовательностей ампликонов.
Положения, выносимые на защиту:
1. Большинство больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки (жители г.Казани) является носителями высоковирулентных штаммов H.pylori.
2. Аллель IL-1B-511*C и генотип IL-1B-511*C/*C повышают риск развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, ассоциированной с H.pylori, а аллель IL-1B-511*Т, генотип IL-1B-511*C/*Т – снижают вероятность формирования заболевания.
3. Больные язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки, ассоциированной с H.pylori, являющиеся носителями сочетания генотипов IL-1В–511*Т/*С, IL-1В+3954*С/*С, IL-1RN*1/*1, IL-10-1082*G/*G, инфицированы преимущественно низковирулентными штаммами хеликобактера.
4. Возможность самопроизвольного рубцевания язвенных дефектов больных ЯБДК ассоциирована с генотипами cagAvacAs1 штаммов H.pylori, а также IL-1RN(VNTR) индивидов.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на XVI Международном симпозиуме Европейской группы по изучению Helicobacter pylori (EHSG) (Швеция, 2003), VI Международном симпозиуме «Диагностика и лечение заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori» (Екатеринбург, 2003), на 8-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2004), научно-практической конференции студентов и аспирантов "Молодежь ВУЗов Казани в решении актуальных проблем города" (Казань, 2004), VIII Международном Евроазиатском конгрессе гастроэнтерологов (Тбилиси, 2005), на ХХI–ой Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 2006), на ХХ–ом Международном симпозиуме Европейской группы по изучению Helicobacter pylori (EHSG) (Стамбул, 2007), Всероссийской научно-практической конференции "Молодые ученые в медицине" (Казань, 2004, 2007), Итоговой научной конференции КИББ КНЦ РАН (Казань, 2008), ХХI Международном симпозиуме Европейской группы по изучению Helicobacter pylori (EHSG) (Рига, 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 научных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 167 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы, а также приложения. В работе представлено 23 таблицы и 33 рисунка. Список цитируемой литературы содержит 261 источник, в том числе 32 – в отечественных изданиях.
История открытия, систематика и филогения Helicobacter pylori
Открытие Helicobacter pylori связано с именами австралийских исследователей - патологоанатома R.Warren и гастроэнтеролога В J.Marshall, которые в 1983 г. независимо друг от друга обнаружили, что у больных хроническим антральным гастритом чрезвычайно часто выявляются микроорганизмы, условно названные ими по внешнему сходству с Campylobacter jejuni кампилобактер-подобными организмами (CLO Campylobacter- organism) [Warren, Marshall, 1983]. Авторами была сделана попытка получения чистой культуры обнаруженных микроорганизмов. Для этих целей они использовали стандартную кампилобактерную среду. Однако попытки культивирования на искусственных питательных средах оказались безуспешными. Эти бактерии по своим морфологическим и биохимическим характеристикам отличались от всех известных микроорганизмов, в том числе кампилобактерий. Учитывая их сходство с Cjejuni и локализацию на слизистой оболочке пилорического отдела желудка, микроорганизмы были названы Campylobacter pylori.
Вместе с тем следует отметить, что первое сообщение об обнаружении спиралевидных бактерий на слизистой оболочке желудка (СОЖ) появилось в начале XX века [Krienitz, 1906]. Позже было установлено, что на СОЖ с признаками воспаления обитают спиралевидные бактерии, и были высказаны мнения об инфекционной природе возникновения и хронизации язвенной болезни [Freedberg, Barron, 1940; Barber, Franklin, 1946]. Однако свидетельства этиологической роли этих бактерий казались в то время недостаточными.
В 1985 году Marshall получил доказательства инфекционной природы ГДП, требуемые триадой Коха. Исследователь воспроизвел гастрит, выпив суспензию чистой культуры H.pylori, и получил затем ретрокультуры, идентичные исходным штаммам [Marshall, 1985].
Совершенствование методов культивирования и идентификации кампилобактерий, а также анализ рибосомной РНК показали необоснованность предложенного систематического положения этих микроорганизмов, и они были выделены в отдельный род Helicobacter [Romaniuk et al., 1987; Goodwin et al., 1989]. Согласно принятой в настоящее время классификации, род Helicobacter принадлежит домену Bacteria, отделу Proteobacteria, порядку Campylobacterales, семейству Helicobacterасеае. В это семейство входят также роды Wolinella, Flexispira, Sulfurimonas, Thiomicrospira и Thiovulum [Kusters et al., 2006]. Описано 23 вида рода Helicobacter и, вероятно, количество их будет расти [Garrity, 2005]. Так, недавно были выявлены новые виды хеликобактеров, некоторые из которых получили временные названия [Bohr, 2007].
К настоящему времени представители рода Helicobacter идентифицированы в желудках многих видов млекопитающих (табл. 1), что может свидетельствовать о том, что эти микроорганизмы эволюционировали в гастромикробиоценозах на протяжении миллионов лет. Однако, по мнению исследователей, за последние 10 тысяч лет Helicobacter pylori претерпел быструю эволюцию [Blaser, 1999]. За сравнительно короткий промежуток времени эти бактерии инфицировали большую половину человеческой популяции. Выраженный генетический полиморфизм штаммов H.pylori у индивидов в разных регионах [Yamaoka et al., 1999; Tovey et al., 2006] позволяет предположить, что эволюция этих микроорганизмов продолжается и направлена на формирование стабильной системы «паразит-хозяин» [Blaser, 1999].
В дополнение к спиралевидным хеликобактерам желудка существует также довольно разнообразная группа видов рода Helicobacter, которые идентифицированы в кишечнике и/или печени некоторых млекопитающих, птиц и человека (табл. 1). Эти энтерогепатические виды Helicobacter (EHS-enterohepatic species) [Solnik, Schauer, 2001] первое время воспринимались как компонент нормальной микрофлоры, однако к настоящему времени установлено, что некоторые, а возможно, и все EHS способны вызывать патологические процессы у высших организмов [Simuda et al., 2006; Bohr et al., 2004]. Показано, что все увеличивающееся число EHS ассоциировано с гастроэнтеритами, гепатитами и другими заболеваниями человека и животных [Ceelen, 2006; De Bock, 2007; Bohr, 2007].
Таким образом, полного представления об экологических нишах, заселяемых представителями рода Helicobacter, и спектре заболеваний, ассоциированных с хеликобактерной инфекцией, пока нет. В этой связи основное внимание исследователей к настоящему времени сосредоточено на изучении H.pylori и связанных с нею заболеваний ЖКТ.
Факторы вирулентности и генетический полиморфизм штаммов Helicobacter pylori
Предполагается, что тяжесть течения ЯБЖ и ЯБДК во многом зависит от генотипов штаммов H.pylori — наличия и особенностей генов, кодирующих факторы вирулентности хеликобактерий.
Основным фактором вирулентности H.pylori является уреаза. Участок генома, кодирующий уреазу, состоит из семи генов, образующих кластер: игеА и игеВ кодируют структурные субъединицы, а игеЕ, ureF, игеН и ureG кодируют вспомогательные белки, необходимые для сборки и включения ионов Ni2+, наконец, urel кодирует Н+ - зависимый канал для транспорта мочевины [Voland et al., 2003].
Уреаза является ферментом-металлопротеином, каталитическая активность которого связана с присутствием в его составе ионов никеля [Chen et al., 1997; Van Vliet et ah, 2001]. Этот встроенный в наружную мембрану H.pylori четвертичный гексадекаполимер массой 483 кДа оптимально функционирует при рН 4.8-5.0 [Ferrero et al., 1988]. Показано, что уреаза, поддерживая внутриклеточный рН, близкий к нейтральному, способствует выживанию H.pylori бактерии в кислой среде [Stingl, 2001], — образующийся при разложении мочевины уреазой аммиак нейтрализует кислоту вокруг бактерии и создает для нее благоприятное микроокружение (рис.3) [Букин и др., 2000]. H2N-C-NH2 + 2Н20 +ІҐ - 2NH4+ + НС03" уреаза О мочевина Рис. 3. Гидролиз мочевины под действием уреазы.
Вырабатываемый H.pylori аммиак нарушает систему отрицательной обратной связи в регуляции секреции соляной кислоты (НС1) [Graham et al, 1990]. Результатом этого является непрерывная секреция НС1, способствующая инициации ульцерогенеза. При этом аммиак, соединяясь с гидрохлорной кислотой (НОСІ), генерируемой нейтрофилами, может вырабатывать ряд цитотоксических продуктов, в том числе гидроксиамин (NH2OH) и монохлорамин (NH2C1) [Babior, 1978].
Уреаза является универсальным фактором вирулентности всех штаммов H.pylori. Некоторые виды рода Helicobacter — обитатели кишечника и гепатобилиарной системы - уреазу не продуцируют. Это подтверждает предположение о том, что уреаза необходима лишь тем видам бактерий, экологической нишей которых является слизистая желудка [Solnik et al., 2001]. На основании нуклеотидной последовательности гена уреазы (игеС) H.pylori созданы универсальные праймеры для выявления штаммов хеликобактера в СОЖ человека с помощью ПНР [Mobley et al., 1995].
Развитию патологического процесса в ЖКТ в случае инфицирования Нpylori способствуют также токсины микроорганизма - Alp A, AlpB, ОірА, SabA, SabB, HP-NAP и некоторые другие [Kusters et al, 2006]. Однако к основным факторам вирулентности, определяющим гетерогенность патогенных потенций штаммов H.pylori относят CagA, Vac A, IceA, BabA2 [Van Doom et al, 1998; Lamarque et al, 2003; Maeda, Mentis, 2007] (рис.4).
Ген vacA, кодирующий цитотоксин A (VacA - vacuolating cytotoxin A), вызывающий вакуолизацию клеток эпителия, найден у всех исследованных штаммов H.pylori, однако способностью к образованию токсина, вызывающего вакуолизацию эпителиоцитов, обладают примерно 50% штаммов [Atherton et al, 1997; Lamarque et al, 2003]. Вследствие мозаичной структуры оперона ген vacA может быть представлен в виде следующих аллелей: si a, sib, sic, s2, ml, m2a, m2b [Van Doom et al, 1998(1)].
Комбинация sla/ml ассоциирует с самой высокой цитотоксической активностью микроорганизма [Atherton et о/., 1997].
Бактериальная клетка синтезирует VacA в виде предшественника массой 140 кДа, который преобразуется в полипептид массой 88 кДа [Nguyen et ah, 2001]. С-концевой фрагмент белка-предшественника массой 50 кДа остается связанным с бактериальной клеткой, и, как полагают [Telford et aL, 1994], является частью секреторного аппарата микроорганизма. В целом белок-предшественник может быть классифицирован как аутотранспортер [Fischer et al, 2001].
Особенности индуцированных Helicobacter pylori поражений слизистой оболочки желудка у больных язвенной болезнью: патофизиологические, цитологические и ультраструктурные аспекты
Язвенная болезнь — хроническое, циклически протекающее заболевание с разнообразной клинической картиной и изъязвлением слизистой оболочки желудка или двенадцатиперстной кишки (ДІЖ) в периоды обострения. Хроническое течение заболевания, сопровождающееся сезонными обострениями, приводит к временной утрате трудоспособности, а иногда и к инвалидности наиболее работоспособной части населения [Ивашкин и др., 2003].
Ведущее значение при ульцерогенезе имеет нарушение равновесия между факторами «агрессии» и факторами «защиты» слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки. Основными факторами агрессии являются хлористоводородная кислота, пепсин, панкреатические ферменты, желчные кислоты, моторно-эвакуаторные расстройства в гастродуоденальной системе. К факторам защиты относят слизистый барьер, покрывающий эпителий слизистой оболочки желудка и ДПК, клеточную регенерацию, кровоток, щелочной компонент панкреатического сока и др. При воздействии различных экзогенных факторов происходит сбой механизмов, обеспечивающих автоматизм действий систем саморегуляции (нервной и гуморальной), а также репаративной регенерации эпителия слизистой оболочки [Исаков, Домарадский, 2003; Григорьев, Яковенко, 2004]. Это создает благоприятные условия для воздействия факторов "агрессии" на ограниченном участке слизистой оболочки желудка или двенадцатиперстной кишки с пониженной резистентностью, возникшей в результате действия местных патогенетических факторов — колонизации Helicobacter pylori, а также ишемии, микротромбоза, иммунодеструктивных процессов, усиленной ретродиффузии Н4" -ионов и других. При этом активированные хеликобактером лейкоциты, в свою очередь, повреждают эндотелий мелких сосудов, способствуют тромбозам, очаговым инфарктам и, соответственно, образованию язв [Yoshida et al., 1993; Kalia et al., 1997].
Патогенетическая роль Helicobacter pylori в ульцерогенезе обусловлена способностью этих бактерий колонизировать слизистую оболочку желудка и очаги желудочной метаплазии в луковице двенадцатиперстной кишки. Причиной появления желудочной метаплазии в ДПК является, очевидно, хроническое закисление луковицы в случае гиперсекреции хлористоводородной кислоты в желудке, возникающей при инфицировании H.pylori. Бактерия заселяет участки желудочной метаплазии в ДПК, вызывая в них характерные изменения, аналогичные тем, что наблюдаются в желудке при хеликобактериозе [Исаков, Домарадский, 2003].
Основным патогенетическим механизмом, который имеет место при всех формах хеликобактериоза, является воспаление слизистой оболочки желудка и ДПК. Воспаление имеет комплексный характер и характеризуется главным образом инфильтрацией собственной пластинки СОЖ и эпителия нейтрофилами, Т- и В-лимфоцитами, плазматическими клетками, макрофагами, формированием несвойственной желудку в норме организованной лимфоидной ткани (лимфоидных фолликулов) [Goodwin et al, 1987; Shimoyama et al., 1998; Ernst et al., 2000]. При этом степень инфильтрации нейтрофилами коррелирует со степенью обсемененности и адгезии H.pylori к СОЖ. Установлено, что инфильтрация полиморфно-ядерными лейкоцитами стимулируется как непосредственно клетками H.pylori, образующими активирующий нейтрофилы белок (NAP - neutrophil-activating p_rotein), так и посредством стимуляции секреции цитокинов [D Elios, Andersen, 2007].
При язвенной болезни, ассоциированной с H.pylori, значительно снижаются синтез и секреция слизи, а также ее гидрофобные свойства: степень снижения гидрофобности коррелирует со степенью обсемененности бактериями [Asante et ah, 1997; Byrd, 2000]. Следствием колонизации H.pylori в СОЖ является нарушение клеточного обновления. Основным видом клеточной гибели при хеликобактериозе является апоптоз эпителиоцитов [Moss etal., 1996].
Взаимодействие липополисахарида клеточной стенки H.pylori с ламинином базальной мембраны эпителия желудка приводит к разрыву его связи с интегрином. При этом нарушается целостность эпителиального покрова - эпителиоциты утрачивают контакт с базальной мембраной и слущиваются, образуя микродефекты на поверхности слизистой оболочки [Могап, 1996].
Как уже упоминалось выше, клетки H.pylori, обладают значительным арсеналом средств, обеспечивающих не только персистенцию хеликобактерий, но и связанные с нею деструктивные процессы соответствующих тканей.
Особенности изменений структуры СОЖ у больных ЯБЖ и ЯБДК, ассоциированной с H.pylori, в значительной мере были установлены с помощью гистологических и иммуногистохимических, а также электронно-микроскопических методов.
Гистологический метод позволяет с высокой степенью надежности выявлять наличие Helicobacter, а также определять степень обсеменения и оценивать состояние слизистой оболочки желудка. Специфичность гистологического метода оценивается в 97%, чувствительность - 80-90% [Исаков, Домарадский, 2003]. Иммуногистохимические методы позволяют выявлять точную локализацию клеточного или тканевого компонента, а также кокковых форм H.pylori с помощью иммунологических и гистохимических реакций с использованием антител [Hessey et al., 1990]. Иммуногистохимические методы применяют при низкой степени обсемененности слизистой оболочки желудка H.pylori, когда гистологический и цитологический методы дают сомнительные результаты.
Выявление Mycoplasma hyorhinis в клиническом материале методом ПЦР
Выявление M.hyorliinis в клиническом материале (биоптат СОЖ) осуществляли с помощью ПЦР с использованием видоспецифичных праймеров на специфичный фрагмент нуклеотидной последовательности рибосомного оперона, согласно Dussurget О. и соавт. [1994] и Timenetsky и соавт. [2000]: MHRHF 5 -GAA CGG GAT GTA GCA ATA CAT TC 3\ MHRHR 5 -AGC GGA CTG AAG TTG AGC TTC AG-3 . Для амплификации указанной области использовали следующий режим: 94С - 30 сек, 55С - 30 сек, 72С - 60 сек, 40 циклов, 72С - 5 мин, 1 цикл. В качестве положительного контроля использовали ДНК референтного штамма M.hyorhinis М20, любезно предоставленного проф. Борхсениусом С.Н., зав. лаб. структурной организации генома (Институт цитологии РАН, г.Санкт-Петербург). Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК проводили в 2% агарозных гелях согласно описанной выше методике. Наличие ампликона, длина которого соответствовала 604 п.н.о., свидетельствовало о присутствии в пробе ДНК M.hyorhinis.
Определение нуклеотидной последовательности ампликона, полученного при использовании видоспецифичных праймеров для выявления M.hyorhinis методом ПЦР, осуществляли с помощью автоматического секвенатора ABI 3130 (Applied Biosystems, США) на базе лаборатории протеомного анализа ФГУ НИИ физико-химической медицины Минздрава
РФ (г. Москва). Для анализа (приложение 8) использовали пакет программ Informax Vector NTI Suite 9.
Результаты сравнительного анализа амплифицированных последовательностей M.hyorhinis с последовательностями соответствующего региона геномов близкородственных микроорганизмов и микроорганизмов, наиболее часто выявляемых в желудке человека, приведены в приложении 8. Данный анализ был проведен с целью выяснения специфичности праймеров, - отсутствия перекрестной амплификации фрагментов с ДНК других микроорганизмов.
Образец слизистой оболочки из антрального отдела желудка больных язвенной болезнью размером приблизительно 2x2x2 мм фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида, приготовленного на фосфатном буфере 0,1М, рН 7,2. Дегидратацию образцов проводили в возрастающих концентрациях спиртов. После дегидратации препараты выдерживали в окиси пропилена 45 минут, затем проводили пропитывание эпоксидной смолой ЭПОН 812 и помещали материал в чистую смолу для полимеризации. Ультратонкие срезы получали на микротоме LKB-III (Швеция), монтировали на никелевые сеточки, окрашивали водным раствором уранилацетата и контрастировали цитратом свинца. Образцы просматривали на электронном микроскопе GM 1200 (Япония).
Статистическую обработку данных выполняли с использованием программного обеспечения MS Excel (Microsoft), программы MedCalc (v. 8.1.1.0). При сравнении частот генотипов и аллелей в группе инфицированных Helicobacter pylori больных язвенной болезнью и группе контроля использовался критерий %2 (р) с поправкой Йейтса на непрерывность. Достоверность различий частот аллелей и генотипов оценивали с помощью точного двустороннего критерия Фишера и 95% доверительного интервала для генерального значения частоты, который вычисляли с помощью точной формулы с использованием -распределения [Животовский, 1991]. Силу ассоциаций оценивали в значениях показателя отношения шансов (OR), а также рассчитывали его 95%-ный доверительный интервал (95% CI).
Показатель отношения шансов оценивали по Бабичу и др. [2005] (OR =1 — нет ассоциации, OR 1 — положительная ассоциация, OR 1 - отрицательная ассоциация; в качестве статистически значимых ассоциаций рассматривали те, для которых доверительный интервал не включал 1). Достоверными считали различия на уровне значимости р 0,05.
![Изучение белковых антигенов Helicobacter pylori на основе моноклональных антител [Электронный ресурс]](/i/i/4283/202634.png "Изучение белковых антигенов Helicobacter pylori на основе моноклональных антител [Электронный ресурс] Вечканов Евгений Михайлович")
