Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 9
1.1. Апоптоз как общебиологический процесс 9
1.2. Белки семейства Вс1-2 20
1.3. Новообразования желудка и толстой кишки 37
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 45
ГЛАВА III. Результаты собственных исследований 60
3.1. Исследование нарушений регуляции внешнего пути апоптоза при новообразованиях желудка и толстой кишки 60
3.1.1. Экспрессия Fas при новообразованиях желудка и толстой кишки 60
3.1.1.1. Экспрессия Fas иетрансформированными и атипическими клетками желудка и толстой кишки 60
3.1.1.2. Уровень sFas в сыворотке периферической крови больных с новообразованиями желудка и толстой кишки 64
3.1.1.3. Экспрессия Fas мопонуклеарными и полиморфноядерпыми лейкоцитами периферической крови
3.1.2. Экспрессия FasL при новообразованиях желудка и толстой кишки 65
3.1.2.1. Экспрессия FasL иетрансформированными и атипическими клетками желудка и толстой кишки 65
3.1.2.2. Экспрессия sFasL при опухолях желудка 67
3.1.2.3. Экспрессия FasL моиокуклсариыми лейкоцитами периферической крови больных с новообразованиями желудка и толстой кишки 67
3.2. Исследование нарушений регуляции внутреннего пути апоптоза при новообразованиях желудка и толстой кишки 69
3.2.1. Исследование уровня белков Вс1-2 и Вах с помощью иммуноблоттинга 69
3.2.2. Иммуногистохимическое исследование уровня белков семейства Bcl-2: Вс1-2, Вах и Bcl
3.2.3. Выявление мутаций в октадезоксигуанозиновой последовательности 3 экзона гена Вах
3.2.4. Локализация белков Bct-2 и Вах до и после индукции апоптоза 88
ГЛАВА IV. Обсуждение полученных результатов 90
4.1. Нарушения регуляции внешнего пути апоптоза при иовообразованях желудка и толстой кишки 95
4.1.1. Изменения системы Fas/FasL со стороны опухолевой ткани желудка и толстой кишки 95
4.1.1.1. Снижение экспрессии Fas атипическими клетками желудка и толстой кишки 95
4.1.1.2. Снижение уровня sFas в сыворотке периферической крови у больных с овообразованиями желудка и толстой кишки 96
4.1.1.3. Увеличение экспрессии FasL атипическими клетками желудка и толстой кишки
4.1.1.4. Увеличение уровня sFasL в опухолевой ткани желудка 99
4.1.2. Изменения системы Fas/FasL со стороны лейкоцитов периферической крови больных с новообразованями желудка и толстой кишки
4.1.2.1. Увеличение экспрессии FasL мононуклеарными лейкоцитами периферической крови больных с новообразованями желудка и толстой кишки 100
4.1.2.2. Уменьшение экспрессии Fas мононуклеарными и полимофрноядерными лейкоцитами периферической крови больных с новообразованями желудка и толстой кишки
4.2. Нарушения регуляции внутреннего пути апоптоза при иовообразованях желудка и толстой кишки 103
4.2.1. Увеличение экспрессии Вс1-2 атипическими клетками желудка и толстой кишки 103
4.2.2. Увеличение экспрессии Вс1-Х атипическими клетками желудка и толстой кишки 104
4.2.3. Увеличение экспрессии Вах атипическими клетками желудка и толстой кишки
4.2.4. Мутации гена Вах - одна из возможных причин утраты проапоптотической активности Вах 106
4.2.5. Общие тенденции изменения экспрессии апоптоз-специфических генов системы Fas/FasL и семейства Вс1-2 при новообразованиях желудка и толстой кишки 108
4.3. Применение сканирующей зондовой микроскопии в молекулярной биологии 114
Выводы 117
Список цитированной литературы 118
- Новообразования желудка и толстой кишки
- Экспрессия Fas иетрансформированными и атипическими клетками желудка и толстой кишки
- Снижение уровня sFas в сыворотке периферической крови у больных с овообразованиями желудка и толстой кишки
- Общие тенденции изменения экспрессии апоптоз-специфических генов системы Fas/FasL и семейства Вс1-2 при новообразованиях желудка и толстой кишки
Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние десятилетия во многих странах мира, в том числе в России, отмечается рост заболеваемости злокачественными новообразованиями органов пищеварения, а также увеличение смертности от этих заболеваний. Наиболее часто опухолевые заболевания выявляются в пожилом возрасте (60 лет и старше), однако, все чаще подобный диагноз ставят в более молодом возрасте (40-50 лет). Неудовлетворительное состояние онкологической помощи населению в Российской Федерации привело к росту числа лиц с IV стадией заболевания и увеличению уровня летальности на 1-ом году с момента установления диагноза. Около 80% злокачественных новообразований органов пищеварения приходится на рак желудка, поджелудочной железы и толстой кишки. Таким образом, острота проблемы рака желудка и толстой кишки не снижается на протяжении многих лет. Прогресс в борьбе со злокачественными новообразованиями напрямую зависит от понимания механизмов развития опухолей и их ранней диагностики [2, 5, 6, 14].
В основе развития опухоли лежит накопление онкотрансформированных клеток либо за счет увеличения их образования, либо за счет снижения уровня клеточной гибели, т.е. опухолевый рост является результатом дисбаланса между пролиферацией клеток и апоптозом [Branet F., 1996; Simonian P.L., 1996]. Эпителиальные клетки желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) относятся к быстродедящимся клеткам, поэтому большинство работ в этой области было сосредоточено на изучении пролиферативной активности опухолей ЖКТ. Однако в последние годы становится все более очевидным, что в развитии злокачественных новообразований ЖКТ важную роль играет нарушение регуляции апоптоза [159].
Апоптоз или программированная клеточная гибель (ПКГ) - общебиологический механизм, ответственный за поддержание постоянства численности клеток организма и элиминацию дефектных или поврежденных клеток. На настоящий момент выделяют два пути реализации программы клеточной гибели. Это рецептор-опосредованный путь апоптоза, который запускается посредством активации рецептора клеточной поверхности, такого как Fas, при связывании с физиологическим лигандом, FasL. Другой путь ПКГ развивается при попадании клетки в неблагоприятные условия. Это митохондриальный путь апоптоза, важную роль в регуляции которого играют белки семейства Вс1-2. Следует отметить, что в ряде случаев ПКГ является результатом комбинированного действия двух путей; с участием и рецепторов плазматической мембраны, и митохондрий [166].
В связи с вышеперечисленным целью настоящего экспериментального исследования явилось изучение экспрессии ключевых генов, белковые продукты которых
7 опосредуют индукцию апоптоза, а также выявление мутаций апоптоз-специфических генов при новообразованиях желудка и толстой кишки человека. При этом были поставлены следующие задачи исследования:
1. Исследовать содержание белков семейства Вс1-2 в нетрансформированиой и
опухолевой ткани желудка и толстой кишки человека,
2. Выявить мутации в гене Вах при некоторых новообразованиях человека.
Исследовать содержание белков системы Fas/FasL в нетрансформированиой и опухолевой ткани желудка и толстой кишки, а также в лейкоцитах периферической крови больных.
Установить закономерности изменения содержания белков семейства Вс1-2 и системы Fas/FasL при новообразованиях желудка и толстой кишки человека.
Научная новизна. Впервые при иммуногистохимическом исследовании содержания белков в ткани проведена одновременная оценка двух параметров: количества клеток, экспрессирующих исследуемые белки, и уровня данного белка в клетке. Показано, что в дальнейших исследованиях можно опираться на один из этих двух параметров. Определено содержание белков семейства Вс1-2 и системы Fas/FasL в нетрансформированных и опухолевых клетках при новообразованиях желудка и толстой кишки человека.
При исследовании содержания белков семейства Вс1-2 и системы Fas/FasL у больных с новообразованиями желудка и толстой кишки выявлено статистически значимое увеличение уровня этих белков в опухолевых клетках по сравнению с нетрансформированными (р = 0,03). Установлены положительные корреляционные зависимости между количеством клеток, экспрессирующих исследованные белки, и уровнем белков как в нетрансформированных клетках (для Bcl-2, Вах, Fas и FasL), так и в опухолевых клетках (для Вс1-2, Вах).
Впервые обнаружено, что метастазирование в регионарные лимфатические узлы коррелирует с низким уровнем Fas-рецептора в опухолевой ткани, который, в свою очередь, связан с низким уровнем растворимого Fas (sFas) в сыворотке периферической крови больных с новообразованиями желудка и толстой кишки человека.
Научно-практическая значимость работы. Исследование имеет большое научно-практическое значение, так как в ходе работы проведено комплексное исследование нарушений регуляции рецептор-опосредованного и митохондриального пути апоптоза при новообразованиях желудка и толстой кишки человека. Установление механизмов блокирования процесса апоптоза в дальнейшем позволит установить причины нарушений и, следовательно, пути устранения последних при опухолевых заболеваниях.
Сделано предположение, что определение уровня sFas в сыворотке периферической крови может стать лабораторным тестом определения наличия метастазов при новообразованиях желудка и толстой кишки, а возможно и их ранней диагностики. Полученные данные позволяют провести дополнительные исследования на предмет создания лабораторного теста.
Обнаружена тесная корреляция (г = 0,91; р < 0,0001) между уровнем исследованных белков и количеством клеток, экспрессирующих данные белки, что свидетельствует о взаимозаменяемости этих двух параметров при оценке результатов иммуногистохимического исследования содержания белков в ткани.
Апробация работы. Результаты исследований доложены на научной сессии факультета подготовки научных и научно-педагогических кадров ММА им. И.М. Сеченова (май 2000, Москва), на Всероссийском совещании «Клеточная биология на пороге XXI века» (октябрь 2000, Санкт-Петербург), на II и III Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (апрель 2001 и январь 2004, Москва), на международной конференции «Scanning probe microscopy» (март 2002 и март 2003, Нижний Новгород), на Научно-практическом симпозиуме «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении» в рамках Международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины» (июнь 2002, Москва), а также неоднократно обсуждалась на научно-практических конференциях кафедры биохимии ММА им. И.М. Сеченова. Апробация работы состоялась на совместном заседании кафедры биохимии ММА им. И.М. Сеченова и лабораторий НИИ молекулярной медицины ММА им. И.М. Сеченова 3 декабря 2003 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях, 2 работы приняты в печать.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена па 137 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, список цитированной литературы, включающий 227 источников (21 отечественный, 206 зарубежных). Работа иллюстрирована 32 рисунками и 6 таблицами.
Новообразования желудка и толстой кишки
Гомеостаз числа клеток требует четкого баланса между пролиферацией и гибелью клеток [44, 127]. В основе канцерогенеза лежит накопление атипических клеток за счет или увеличения образования клеток, или снижения ПКГ, что может быть обусловлено неспособностью клетки вступать в апоптоз в ответ на физиологические стимулы, т.е. опухолевый рост является результатом дисбаланса между пролиферацией клеток и апоптозом [39, 44, 127, 186]. Большинство работ, посвященных ЖКТ, традиционно сосредоточено на изучении нарушений контроля пролиферации, которые происходят в канцерогенезе, Однако в последние годы становится все более и более очевидно, что контроль апоптоза также играет важную роль. Апоптоз представляет собой важный механизм устранения, как избытка нормальных клеток, так и поврежденных клеток [159].
Апоптоз клетки начинается с того момента, когда происходит повреждение ДНК, вызывающее нарушения ее воспроизведения. Если не происходит репарация ДНК, клетки вступают в фазу апоптотической гибели. Если генетические механизмы, вовлеченные в этот процесс, изменяются, смерть клетки может не наступить. Дальнейшие мутации приводят к появлению злокачественного фенотипа и к росту опухоли [4]. Резистентность к апоптозу важна как для начального развития опухоли, так и для последующего выживания опкотрансформированных клеток. Начальная резистентность к апоптозу обуславливает расширение клеточной популяции атипических клеток, а последующая — определяет нечувствительность опухолевых клеток к химио- и радиотерапии [16,143].
Молекулярный анализ опухолевых клеток на различных стадиях прогрессии опухоли выявил, что изменения в генах-супрессорах опухолей и онкогенах накапливаются во время прогрессии опухоли и коррелируют с клинической агрессивностью рака. Прсдзлокачественные повреждения являются или результатом генетических изменений, которые стимулируют пролиферацию клона атипических клеток, или итогом действия факторов окружающей среды, таких как вирусная инфекция, которые стимулируют накопление разных клонов атипических клеток. Вследствие накопления генетических изменений в одной (или нескольких) предзлокачественных клетках, клетки превращаются в злокачественные и формируют первичную опухоль. Однако на ранних стадиях расширения первичной опухоли клетки не способны к инвазии и метастазированию.
Новые клоны, обладающие инвазивной и метастатической способностями, появляются в результате дальнейшего накопления генетических изменений в клетках. Необходимо отметить, что только ограниченная фракция клеток первичной опухоли является высоко метастатической: клетки первичной опухоли фенотипически и биологически гетерогены, что обусловлено различным набором генов, в которых произошли изменения при прогрессии рака. Высоко метастатические клетки часто приобретают изменения в большем количестве генов, чем немстастатические клетки, и различные гены дифференциально экспрессируются среди метастатических и неметастатических клеток [219].
Таким образом, блокирование процесса апоптоза, происходящее на разных стадиях канцерогенеза, приводит к снижению способности онкотрансформированной клети к ПКГ, что определяет профессию опухолевого заболевания [4].
FasL синтезируется нормальными клетками эпителия кишки [34], FasL также определяется более чем в 70% опухолевых клеток кишки эпителиального генеза [34, 149, 179]. Следует учитывать, что увеличение синтеза FasL сопровождает не только опухолевое перерождение ткани, но наблюдается и при выраженной степени дисплазии эпителия [34, 184]. Аналогичные изменения выявлены при опухолях желудка [104]. Необходимо отметить, что у больных с повышенным уровнем синтеза FasL клетками опухолевой ткани повышено число лимфоцитов, находящихся в апоптозе, как в опухолевой ткани, так и в периферической крови [104, 189], что может отражать активацию ЦТЛ в отношении атипических клеток. В зарубежной литературе существуют противоречивые данные о взаимосвязи уровня FasL с гистологической степенью дедифференцироваппости опухолей желудка и толстой кишки: одни авторы полагают, что такая зависимость имеет место [151], другие - нет [35, 120, 149]. Возможно, что уровень FasL в клетке отражает степень диспластических изменений ткани.
Fas-рецептор - белок клеточной мембраны, через который передается сигнал ПКГ в клетку. Однако некоторые опухолевые клетки утрачивают способность синтезировать Fas. При опухолях желудка и толстой кишки отмечено снижение уровня Fas, вплоть до полного отсутствия [3]. При этом более высокий апоптотический индекс и более доброкачественное течение отмечены при Fas-положительных опухолях желудка, в отличие от Fas-отрицательных. Показано, что миссенс-мутации гена Fas не определяются ни в клеточных линиях рака желудка, ни при карциномах желудка [151]. Отсутствие транскрипции гена Fas является характерным для рака толстой кишки и отражает эпигенетический механизм молчания гена [41].
Значение белков семейства Вс1-2 при опухолях основывается на их способности модулировать апоптоз и, таким образом, их уровень влияяет на течение заболевания [4, 65, 172, 188]. Опухолевая трансформация часто сопровождается увеличением уровня синтеза антиапоптотических белков (Bcl-2, BcI-XL), что является одним из механизмов «ускользания» опухолевых клеток от ПКГ [22].
Необходимо отметить, что синтез белков семейства Вс1-2 изменяется в зависимости от локализации и типа опухоли и не зависит от природы повреждений [181]. Например, при аденокарциномах молочной железы и эндометрия часто синтезурется Вс1-2, а при опухолях легкого, поджелудочной железы или карциномах простаты - реже. Высокий уровень содержания Bcl-XL наблюдается при карциномах простаты и желудка. Экспрессия гена Box наиболее распространена и определяется при различных типах опухолей [188].
Уровень белков семейства Всі-2 изменяется также при малигнизации опухоли и после лечения, т.е. синтез этих белков является определяющим не только для развития опухоли, но и прогрессии заболевания, а также обуславливает резистентность к терапии [187].
Вс1-2 относится к антиапоптотическим белкам и блокирует проведение апоптотического сигнала в некоторых клеточных системах. Экспрессия Вс1-2 повышает резистентность опухолевых клеток к действию факторов, в норме индуцирующих апоптоз [188, 190]. Однако при различных опухолевых заболеваниях уровень Вс1-2 изменяется по разному: при одних новообразованиях уровень Вс1-2 увеличивается (рак мочевого пузыря [54], гепатоклеточный рак [118]), при других - уменьшается (недифференцированные карциномы щитовидной железы [39, 57], рак яичников [1271).
Экспрессия Fas иетрансформированными и атипическими клетками желудка и толстой кишки
При иммуногистохимическом исследовании содержания Bcl-Х в нетрансформированной и опухолевой ткани желудка и толстой кишки нами показано, что Bcl-Х синтезируется подавляющим большинством клеток желудка и толстой кишки (табл. 5). Причем количество Bcl-X-экспрессирующих клеток в опухолевой ткани достоверно больше, чем в нетрансформированной (р = 0,03). Bcl-Х синтезируется на среднем и высоком уровне (табл. 5, рис. 15). Необходимо подчеркнуть, что увеличение уровня Bcl-Х в атипических клетках желудка и толстой кишки по сравнению с нетрансформированными является статистически значимым (р = 0,03): уровень Bcl-Х в опухолевой ткани увеличивается примерно в 1,4 раза. Установлена зависимость между количеством Вс1-Х-экспрессируюших клеток и уровнем данного антигена: чем больше клеток экспрессирует Bcl-Х, тем выше уровень Bcl-Х как в нетрансформированных (г = 0,89; р = 0,003), так и опухолевых (г - 0,66; р = 0,04) клетках желудка и толстой кишки. Таким образом, при новообразованиях желудка и толстой кишки обнаружено увеличение уровня Bcl-Х и количества Bcl-X-положительиых клеток в опухолевой ткани по сравнению р нетрансформированной.
При иммуиогистохимическом исследовании содержания Вах в нетрансформированной и опухолевой ткани желудка и толстой кишки использовались два вида антител: Вах1 - поликлональные на область ВНЗ домена, играющего важную роль в образовании как гомодимеров, так и гетеродимеров с антиапоптотическими членами семейства Вс1-2 (Вс1-2 и Bcl-XL); Вах2 - моноклональные на С-коицевую область белка, которая необходима для перемещения Вах к митохондриям, что является необходимым условием проапоптотической активности белка. Показано, что Вах синтезируется подавляющим большинством клеток желудка и толстой кишки на достаточно высоком уровне (табл. 5, рис. 14 и 15). Причем наблюдается статистически значимое увеличение уровня Вах в атипических клетках по сравнению с нетрансформированными (р = 0,02/0,01): уровень Вах в опухолевой ткани увеличивается примерно в 1,5-2 раза. Установлены следующие закономерности в изменении количества Вах-положительных клеток и уровня Вах в опухолевой ткани по сравнению с нетрансформированной: 1, Положительная статистически значимая корреляция между числом Вах экспрессирующих клеток в нетрансформированной и опухолевой ткани желудка и толстой кишки (г = 0,95; р 0,0001): чем больше Вах-положительных клеток в нетрансформированной ткани, тем больше таких клеток в опухолевой ткани (рис. 16А); 2. Положительная статистически значимая корреляция между уровнем Вах в нетрансформированной и опухолевой ткани желудка и толстой кишки (г = 0,91; р 0,0007): чем больше уровень Вах в иетрансформированных клетках, тем больше уровень Вах в атипических клетках (рис. 16Б); 3. Положительная статистически значимая корреляция между процентным содержанием Вах-экспрессирующих клеток и уровнем данного антигена: чем больше клеток экспрессирует Вах, тем выше уровень Вах как в иетрансформированных (г = 0,88; р = 0,002), так и опухолевых (г = 0,71; р = 0,01) клетках желудка и толстой кишки. Таким образом, при иммуиогистохимическом исследовании содержания Вах с использованием антител на различные функциональные области белка показано увеличение уровня Вах в опухолевой ткани желудка и толстой кишки по сравнению с нетрансформированной. Однако в ряде случаев, определяющее значение Выявление мутаций в окталезоксигуанозиновой последовательности 3 экзоиа гена Box Для выявления мутаций использовали прием совмещения ПЦР и анализа копформационного полиморфизма одноцепочечных продуктов ПЦР (SSCP). Метод ПЦР позволяет избирательно синтезировать in vitro небольшие участки ДНК (от нескольких десятков до нескольких сотен п.н.), используя в качестве матрицы любые образцы ДНК, содержащие амплифицируемую последовательность [7]. Ключевым моментом при оптимизации условий ПЦР является подбор праймеров, так как именно они определяют возможность специфической амплификации исследуемой нуклеотидной последовательности ДНК. С помощью программы Oligo 4.0 показано, что праймеры, описанные в зарубежных статьях (В-1 и В-2) [163, 210], формируют вторичную структуру (рис. 17), образуют гомо- и гстеродуплексы между собой (рис. 18), а также В-1 имеет несколько возможностей гибридизации с ДНК (рис. 19): помимо отжига на антисмысловой нити ДНК (с 1 по 20 нуклеотид исследуемой области), праймер может отжигаться па смысловой нити ДНК (с 35 по 54 нуклеотид исследуемой области) и на антисмысловой нити ДНК (с 72 по 91 нуклеотид исследуемой области). Дизайн олигонуклеотидных праймеров для выявления мутаций в 3 окзоне гена Вах, используемых в данной работе, проведен при помощи этой же программы. Подобранные праймеры (сенс Вах-1 5 GACACCCCGTTCTGATTCTG-3 и антисенс Вах-2 5 CAGCTTCTTGGTGGACGCATC-3 ) позволяют получить ПЦР-продукт длиной 137 п.н., содержащий октадезоксигуанозиновую ((G)g) последовательность (кодоны от 38 до 41 третьего экзона). При подборе условий ПЦР мы варьировали температуру и время отжига, количество циклов, концентрации праймеров и геномной ДНК, Визуализация результата ПЦР первоначально проводилась после электрофореза в агарозном геле с помощью бромистого этидия, с последующим электрофорезом образцов в ПААГ и высокоразрешающей окраской нитратом серебра. Подобранные условия для проведения ПЦР составляют следующий температурный режим: предварительная денатурация 94 С - 3 мин.; денатурация 94 С - 30 сек., отжиг 60 С - 30 сек., элонгация 72 С - 45 сек., 29 циклов; заключительная элонгация 72 С - 5 мин.
Снижение уровня sFas в сыворотке периферической крови у больных с овообразованиями желудка и толстой кишки
Растворимая форма Fas-рецептора обладает антагонистичными функциями, по сравнению с мембрашю-связанной, поэтому логично было бы ожидать увеличение уровня sFas в сыворотке периферической крови больных с новообразованями желудка и толстой кишки по сравнению со здоровыми донорами. Однако у исследованных больных с опухолями желудка уровень sFas в сыворотке периферической крови (1,02±0,04 иг/мл) достоверно ниже, чем в сыворотке крови нормальных доноров (1,65±0,05 нг/мл). При анализе уровня sFas у больных с опухолями толстой кишки выявлено, что средний уровень sFas в сыворотке периферической крови больных тоже доставерно ниже чем в группе здоровых доноров, но не отличается от такового в группе больных с опухолями желудка. Следует отметить, что у одного из 7 исследованных больных с опухолями толстой кишки уровень sFas соответствовал норме; у другого - превышал норму на 76%. Вероятно, у второго больного увеличение уровня sFas вносит вклад в блокирование Fas/FasL-индуцированного ап о птоза: sFas конкурирует с Fas-рецептором за взаимодействие с FasL ЦТЛ.
Необходимо отметить, что снижение сывороточного уровня sFas коррелирует со снижением уровня Fas в клетках опухолевой ткани (г = 0,77). Как уже было сказано, sFas -результат альтернативного сплайсинга мРНК Fas. То есть снижение уровня как мембранно-связанпой, так и растворимой форм Fas-рецептора подтверждают данные Butler L.M. и соавт. [41] о том, что отсутствие транскрипции гена Fas является результатом эпигенетического механизма молчания гена.
Примерно у 25% больных раком толстой кишки имеются метастазы в печень на время диагноза, у других 25% метастазы в печень развиваются в течение 2 лет [220]. Прежде всего это можно объяснить особенностями венозного оттока, поскольку верхняя и нижняя брыжеечные вены впадают в воротную вену [5]. Кунашев З.М. установил прямую зависимость между частотой поражения регионарных лимфатических узлов и риском метастатического поражения отдаленных органов, т.е. в группе больных с вовлечением в опухолевый процесс лимфатической системы значительно чаще выявляются отдаленные метастазы [5]. По нашим данным метастазирование в регионарные лимфатические узлы коррелирует с низким уровнем Fas в опухолевой ткани, который, в свою очередь, связан с низким уровнем sFas в сыворотке периферической крови. Таким образом, определение уровня sFas в сыворотке периферической крови может стать лабораторным тестом определения наличия метастазов, а возможно и их ранней диагностики. А так как у 60-80% больных с впервые установленным диагнозом определяется III-IV стадия заболевания [14], то выявление метастазирующих опухолей на дооперационном этапе является первостепенной задачей.
Клетки, несущие FasL, способны индуцировать апоптоз клеток, синтезирующих Fas-рецептор и чувствительных к FasL-индуцированному апоптозу. По литературным данным FasL синтезируется нормальными клетками эпителия толстой кишки [34], FasL также определяется более чем в 70% опухолевых клеток эпителиального происхождения [34, 149, 179]. Следует учитывать, что увеличение уровня FasL сопровождает и диспластические изменения эпителия кишки [34, 184]. Аналогичные изменения выявлены и при опухолях желудка [104].
Нами показано, что в клетках опухолевой ткани желудка и толстой кишки увеличивается синтез FasL. Выявлено статистически значимое увеличение как процента FasL-положительных клеток (91Д±7,8 и 99,7±0,4 в трансформированной и опухолевой ткани, соответственно), так и уровня FasL (1,32±0,25 и 2,22±0,20 в петрапсформированнои и опухолевой ткани, соответственно). Полученные результаты подтверждают литературные данные о том, что некоторые типы опухолей синтезируют FasL и обладают способностью индуцировать апоптоз Fas-экспрессирующих лимфоцитов, «ускользая» от иммунного распознавания [3, 35,220].
Лимфоидная инфильтрация является нормальным иммунным ответом на появление онкотрансформированных клеток [169]. По данным Yoong K.F. и соавт. [220] воспалительный инфильтрат ограничен околоопухолевым пространством и только небольшая часть лимфоцитов определяется в паренхиме опухоли. Кроме того, менее 5% лимфоцитов на границе опухолевого роста находится в стадии пролиферации (о чем свидетельствует наличие Ki-67 - маркера пролиферации), в то время как более 50% погибают путем апоптоза. Апоптоз является результатом синтеза атипическими клетками толстой кишки FasL, что позволяет им индуцировать апоптоз ЦТЛ, через активацию Fas рецептора лимфоцитов.
При метастазировании печени наблюдается следующая ситуация. Отсутствие проникновения лимфоцитов в опухолевую ткань вследствие снижения уровня синтеза молекул адгезии атипическими клетками является одной из причин недостатка иммунного ответа на метастазы толстой кишки. Лимфоидный инфильтрат, который окружает атипические клетки кишки, содержит большое количество активированных моноцитов, в том числе ЦТЛ, и зкспрессирует противовоспалительные цитокины (ИЛ-1) на границе опухолевого роста. Провоспалительные цитокины, в свою очередь, стимулируют экспрессию Fas гепатоцитами на границе опухолевого роста. FasL-позитивный ЦТЛ на границе опухолевого роста взаимодействует с соседствующим гепатоцитом и индуцирует его вступление в апоптоз, позволяя опухолевым клеткам распространятся в окружающей ткани печени. Атипические клетки толстой кишки также синтезируют FasL, то есть, не исключено, что FasL-позитивная опухолевая клетка может индуцировать апоптоз Fas-несущиего гепатоцита непосредственно. Однако это менее вероятное развитие событий, чем ЦТЛ-опосредовапный апоптоз, так как околоопухолевая строма ограничивает опухоль от окружающей ткани печени, в то время как ЦТЛ непосредственно контактируют с окружающими гепатоцитами. Следовательно, Fas-опосредованный апоптоз не только ответственен за гибель лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль, но также способствует метастазировапию, облегчая локальный рост опухоли путем стимуляции апоптоза нормальных гепатоцитов на границе опухолевого роста. Благодаря увеличению уровня синтеза FasL, опухолевые клетки обоснуются во вторичном месте и прорастают в соседствующую нормальную ткань печени [220].
Таким образом, активированные лимфоциты накапливаются в строме на периферии опухоли и не проникают в опухолевую ткань. В отсутствии Fas-несущих опухолевых клеток-мишеней, FasL-экспрессирующие лимфоциты взаимодействуют с другими Fas-несущими клетками, включая лимфоциты или гепатоциты. Гибель лимфоцитов -результат или взаимодействия между Fas и FasL в пределах одной и той же клетки, или FasL-позитивный лимфоцит индуцирует апоптоз новообразованного Fas-позитивного лимфоцита. Можно предположить, что увеличение уровня FasL в опухолевых клетках вносит существенный вклад в патогенез опухолевого процесса в тканях желудка и толстой кишки посредством индукции апоптоза ЦТЛ, способствует «ускользанию» онкотрансформированной клетки от иммунного надзора, а также метастатической колонизации печени.
Общие тенденции изменения экспрессии апоптоз-специфических генов системы Fas/FasL и семейства Вс1-2 при новообразованиях желудка и толстой кишки
Развитие молекулярной биологии и молекулярной медицины в последние десятилетия привело к необходимости решения прикладных задач, связанных с исследованиями на субклеточном уровне (изменение внутриклеточных структур при патологических процессах и в процессе лечения, динамика и кинетика фармакологических препаратов в клетке и т.д.). Существующие методы, как правило, не позволяют однозначно решать подобные задачи. Поэтому представляется целесообразным привлекать новые методы исследований, которые позволят получить дополнительную информацию на качественно новом уровне. Примерами таких методов являются сканирующая лазерная конфокальная микроскопия (СЛКМ) и сканирующая ближнепольная оптическая микроскопия (СБОМ) -разновидности сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ) [51], которые в последнее время получили довольно широкое распространение. Привлекательной эта методика является потому, что обладая высоким порядком разрешения, не разрушает образец в процессе сканирования (что выгодно ее отличает от электронной микроскопии). Кроме того, электронная микроскопия требует специальной подготовки препаратов, в то время как при применении СЗМ исследуемый объект находится практически в нативном состоянии. Трудность применения СЗМ в биологии и медицине заключается в том, что биологические образцы обладают значительно более низкой проводимостью по сравнению с полупроводниками или металлами, при сканировании поверхностей которых достигается разрешение 0,1 им (атомарный уровень) [20]. Биологические объекты имеют также более низкий порядок симметрии и неоднородны по своему составу. Несмотря на выше описанные трудности, с помощью методики СЗМ были получены изображения ДНК, энзимов, фрагментов плазматических мембран прокариотических и эукариотических клеток, вирусов и др. [75,162].
Одним из интригующих моментов регуляции апоптоза белками семейства Вс1-2 является их внутриклеточная локализация и тканслокация. Перемещение Вах к митохондриями связано с высвобождение апоптогенных факторов из межмембарнного пространства митохондрий в цитоплазму и вопрос, каким образом Вах влияет на данный процесс, активно исследуется в настоящий момент. Какие существуют подходы к решению этой задачи. Из клеток, стимулированных и нестимулированных к апоптозу, выделяют митохондрнальную и цитоплазматическую фракции, в который методом иммуноблоттинга определяют содержание белков. Anlonsson В. и соавт. [25] показано, что в нсстимулированныых клетках Вах находится как в митохондриальной, так и в цитоплазматической фракции. Наличие Вах в митохондриальной фракции авторами объясняется тем, что Вах может быть ассоциирован с мембраной митохондрий. При стимуляции апоптоза содержание Вах незначительно увеличивается в митохондриальной фракции, но значительно уменьшается в цитоплазматической. Такие изменения авторы относят к частичному протсолизу, хотя Вах может перемещаться и к другим мембранным структурам клетки, например эндоплазматическому ретикулуму. Подобные эксперименты не отражают конформационных изменений Вах, происходящих при апоптозе. Кроме того, деление на различные клеточные фракции является условным и в той или иной фракции могут содержаться примеси. А то, что при апоптозе Вах встраивается во внешнюю мембрану митохондрий, является гипотезой, основанной на том, что Вах имеет трансмембранный гидрофобный С-концевой домен и тем, что in vitro формирует поры в искусственных мембранах. Для подтверждения встраивания Вах в мембрану митохондрий при стимуляции апоптоза Antonsson В. и соавт. [25] получают фракции прикрепленных и интегральных белков: для получения прикрепленных белков они инкубируют митохондрии в щелочной среде, для выделения интегральных белков - митохондрии обрабатывают детергентом и ультразвуком. При обработке детергентом и ультразвуком разрыхляется мембрана митохондрий и в полученной фракции могут оказываться не только интегральные белки внешней мембраны митоходрий, но и другие белки митохондрий.
В некоторых работах используется сканирующая лазерная конфокальная микроскопия клеток, трансфицироваиных апоптоз-специфифческими генами, конъюгированными с зеленым флуоресцирующим белком. Однако затруднительно сопоставлять полученную картину распределений флуоресценции с внутриклеточными компартментами. Кроме того, при трансфекции мы будем оценивать не просто как поведет себя клетка, а как поведет себя клетка в состоянии нагрузки, кроме того, изменения распределения химерного белок могут отличаться от нативного белка.
В данной работе проведено исследование изменения локализации и содержание апоптоз-специфических белков Вах и Вс1-2 в митохондриях клеток, стимулированных к апоитозу, методами СБОМ и СЛКМ. Мы выделяли митохондрии из клеток, стимулированных и нестимулированных к апоптозу, и исследовали методами СЗМ после непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания на апоптоз-специфические белки. Исходно мы получили сопоставимые изображения люминесценции и топографии митохондрий. Поле чего методами СЛКМ показали, что до стимуляции апоптоза Вах и Вс1-2 в митохондриях практически отсутствуют, а при стимуляции апоптоза содержание обоих белков увеличивается. С нашей точки зрения, важным является что при стимуляции апоптоза уменьшается соотношение ВсІ-2ЛЗах ( в 14 раз).
Параллельно был исследован уровень апоптоза до и после стимуляции клеток и показано, что персраспраделение белков семейства Вс1-2 к митохондриям происходит на ранних стадиях апоптоза, до деградации ядерной ДНК. Также изменение локализации белков происходит на фоне сохранности внешней мембраны митохондрий. Возможно, на ранних стадиях апоптоза образуются или открываются поры в мембранных структурах митохондрий, через которые происходит перераспраделение белков, а разрыв внешней мембраны митохондрий сопровождает более поздние стадии апоптоза.
Следует обратить внимание, что наиболее изученным является высобождение апоптогенных факторов из межмембранного пространства митохондрий и существуют лишь одиночные доказательства обратного потока белков. Так по одним литературным источникам, активные каспазы при апоптозе транспортируются из цитоплазмы в митохондрии [71], предположительно, усугубляя повреждение митохондрий при апоптозе. По другим - Вах также может проходить через апоптотические поры и увеличивать проницаемость внутренней мембраны митохондрий [31].
