Содержание к диссертации
Введение
1. Взаимосвязь структуры иммуноглобулинов g-класса и их протективной активности (обзор литературы) 9
1.1. Структура иммуноглобулинов G-класса 10
1.1.1. Fab фрагмент 11
1.1.2. Fc фрагмент 13
1.1.3. Шарнирный регион 14
1.1.4. Пространственная структура 15
1.1.5. Подклассы IgG человека 18
1.2. Эффекторные функции иммуноглобулинов 20
1.2.1. Активация системы комплемента 21
1.2.2. Индукция опсонизации 21
1.2.3. Лигандсвязывающие участки Fc фрагмента 23
1.3. Механизмы функционирования иммуноглобулинов 28
1.3.1. Модель изменения конформации 29
1.3.2. Аллостерическая модель 35
1.4. Свободные остатки цистеина и их возможное участие в функционировании антител 41
2. Материалы и методы 46
2.1. Материалы 46
2.2. Методы 47
2.2.1. Выделение IgGl 47
2.2.2. Анализ белковых и пептидных фракций 49
2.2.2.1. Определение концентрации белка 49
2.2.2.2. Гель-электрофорез 49
2.2.2.3. Электроблоттинг 50
2.2.2.4. Определение класса и подкласса иммуноглобулинов 50
2.2.2.5. Определение агглютинирующей способности 50
2.2.2.6. Аминокислотный анализ 51
2.2.2.7'. Анализ N-концевой аминокислотной последовательности 51
2.2.2.8. Определение N-концевого аминокислотного остатка 52
2.2.3. Методы определения SH-групп и дисульфидных связей 52
2.2.3.1. Предварительная подготовка белка 52
2.2.3.2. Меркаптидирование 52
2.2.3.3. Алкилирование 53
2.2.3.4. Тиол-дисульфидный обмен 56
2.2.4. Получение Fab и Fc фрагментов иммуноглобулина G1 56
2.2.5. Определение С-концевой аминокислотной последовательности алкилированного Fab фрагмента 57
2.2.6. Выделение флуоресцентномеченых пептидов из гидролизата Fab фрагмента IgGl 59
2.2.7. Выделение флуоресцентномеченых пептидов из гидролизата IgGl...60
2.2.8. Определение агглютинирующей способности модифицированного IgGl 62
2.2.9. Определение местоположения легкодоступного остатка цистеина...63
2.2.10. Методы статистической обработки данных 63
3. Результаты и их обсуждение 65
3.1. Получение гомогенного препарата IgGl человека 66
3.2. Определение числа свободных остатков цистеина в IgGl человека 70
3.2.1. Легкодоступные остатки цистеина 71
3.2.2. Маскированные остатки цистеина 71
3.3. Локализация четырех свободных остатков цистеина в IgGl 76
3.3.1. Поиск свободных остатков цистеина в Fab и Fc фрагментах 76
3.3.2. Анализ С-концевой последовательности Fab фрагмента 80
3.3.3. Выделение и анализ флуоресцентных цистеинсодержащих пептидов Fab фрагмента IgGl 85
3.3.4. Выделение и анализ флуоресцентных цистеинсодержащих пептидов IgGl 95
3.4. Определение значимости легкодоступного остатка цистеина для функционирования IgGl 95
3.5. Локализация легкодоступного остатка цистеина в IgG 1 97
Выводы 103
Список литературы 105
Список сокращений 128
Приложение Акты внедрения 129
- Лигандсвязывающие участки Fc фрагмента
- Определение N-концевого аминокислотного остатка
- Определение числа свободных остатков цистеина в IgGl человека
- Выделение и анализ флуоресцентных цистеинсодержащих пептидов IgGl
Введение к работе
Антитела являются мощным фактором приобретенного иммунитета, обеспечивающего устойчивость организма к вирусам, бактериям, токсинам и другим патогенам. Именно они в первую очередь взаимодействуют с поступающими в организм этиотропными агентами и вовлекают в иммунный ответ молекулярные и клеточные механизмы защиты, которые без участия антител лишены возможности селективно действовать на патогены.
На основании многочисленных исследований с применением методов физико-химического, белкового и иммунохимического анализов установлено, что молекула IgG состоит из двух тяжелых (Н) и двух легких (L) цепей, включающих 12 доменов, сходных по способу укладки полипептидной цепи и наличию одной дисульфидной связи в гидрофобном ядре каждого домена. Четыре полипептидные цепи сложены таким образом, что в результате образуются три большие субструктуры - две идентичные Fab области, содержащие антигенсвязывающий центр, и Fc область, осуществляющая эффекторные функции. В состав Fab фрагмента входит вся легкая цепь и N-концевая половина тяжелой цепи, в состав Fc фрагмента - С-концевые половины двух тяжелых цепей. Fab фрагменты соединены с Fc фрагментом константными участками тяжелых цепей, именуемыми шарнирным регионом [1,2].
Несмотря на большой объем накопленных данных по структуре и функциям антител, до настоящего времени остается невыясненным, почему при высокой секреции специфических антител в процессе иммунного ответа последние часто не оказывают протективный эффект. Неизвестно также, за счет каких молекулярных механизмов обеспечивается динамичность молекулы IgG, необходимая для поливалентного связывания с антигеном и осуществления аллостерических структурных изменений, происходящих во второй фазе реакции антиген-антитело [3]. Предполагается, что сегментная гибкость и передача сигналов от центров связывания с антигеном Fab области к эффекторным доменам Fc области в основном осуществляется шарнирным участком антитела [4, 5]. Отличительной особенностью этой области является высокая обогащенность остатками пролина и цистеина, которые с одной стороны придают структуре гибкость, а с другой - стабильность за счет межцепочечных дисульфидных связей [6, 7]. Таким образом, сложилось представление, что остатки цистеина в молекуле IgG выполняют исключительно каркасную функцию, обеспечивая целостность четвертичной структуры молекулы.
В то же время в литературе стали появляться единичные сообщения об обнаружении свободных SH-групп в препаратах IgG [8 - 13]. Несмотря на то, что работы по определению SH-групп носят фрагментарный характер, и феномен их появления не объясняется совсем или же интерпретируется как результат разрыва лабильной межцепочечной дисульфидной связи [13, 14], эти данные заслуживают внимания, поскольку поднимают вопрос о возможном существовании, наряду с ковалентно связанными, свободных остатков цистеина, потенциально способных, в силу своей реактивности, участвовать в процессе функционирования антител.
Отсутствие единой точки зрения относительно наличия в IgG свободных остатков цистеина, а также то, что в моноклональных, миеломных и генноинженерных антителах свободные остатки цистеина не обнаруживаются или выявляются в следовых количествах [11, 12], тогда как в некоторых препаратах IgG, выделенных из сывороток крови, определяется от 0.3 до 1.5 SH-групп и наблюдается уменьшение их числа при патологии [15- 17], делает актуальным проведение исследований по выяснению наличия или отсутствия свободных остатков цистеина в IgG в норме и при патологии.
Целью работы явилось выяснение истинного числа свободных остатков цистеина в IgGl человека в норме, определение их локализации в полипептидных цепях и роли в функционировании антител.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
- выделить из сыворотки крови гомогенный препарат IgGl с сохранением нативной четвертичной структуры;
- разработать способ глубокой денатурации белка для тестирования всех имеющихся SH-групп IgGl с дифференциацией их по степени доступности к тиоловым реагентам;
- для идентификации местоположения свободных остатков цистеина в полипептидной цепи белка разработать оптимальные условия химической модификации SH-групп с учетом степени сродства к тиоловым реагентам в отсутствие восстановителя и способ контроля эффективности алкилирования молекулы IgGl;
- разработать алгоритм поиска меченых остатков цистеина, выделить индивидуальные пептиды, содержащие модифицированные остатки цистеина, и провести анализ их аминокислотной последовательности;
- исследовать влияние химической модификации IgGl по остаткам цистеина на функциональную активность антител.
Научная новизна работы. Впервые установлено, что наряду с четырнадцатью дисульфидными связями в IgGl человека присутствуют четыре свободных остатка цистеина. Определено, что только один из них является легкодоступным и реакционноспособным, а остальные три - в различной степени маскированы и выявляются на разных стадиях денатурации белка. Показано, что свободные остатки цистеина расположены в двух L цепях в положении 214 и двух Н цепях в положении 220. Это свидетельствует об отсутствии ковалентной связи между Н и L цепями в Fab фрагменте молекулы. Установлено, что реакционноспособный остаток цистеина расположен в Н цепи и необходим для функционирования антител; его химическая модификация приводит к потере способности антитела к поливалентному связыванию с эпитопами антигена.
Полученные данные о наличии четырех свободных остатков цистеина открывают принципиально новые возможности для тестирования конформационных и функциональных состояний молекулы при действии различных физических, химических и биологических факторов.
Практическая значимость работы. Результаты исследования были использованы при разработке эталона конформационного состояния молекулы IgGl в норме, применяемого в качестве контроля в тест-системах для: дифференциации антител по функциональной активности, экспресс-диагностики доклинических и клинически выраженных форм вторичной иммунологической недостаточности у больных с аллергическими, атопическими и инфекционными заболеваниями, оценки эффективности фотоиммуномодулирующей терапии; а также при разработке оптимальных параметров и режимов воздействия фотоматричных терапевтических систем на биообъект. Практическая ценность работы подтверждена актами внедрения (см. приложения).
Основные результаты работы были представлены на 18th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology «Beyond the genom: Understanding and exploiting molecules and cells in the 3 rd Millennium» (Birmingham, 2000); International Symposium on Biomedical Optics (San Jose, 2000); V чтениях, посвященных памяти академика Ю.А.Овчинникова «Биоорганика-2000» (Москва, 2000); Международной конференции и дискуссионном научном клубе «Новые информационные технологии в медицине и экологии» (Гурзуф, 1998, 1999, 2001); XIII Международной научно-технической конференции «Лазеры в науке, технике, медицине» (Сочи, 2002); Международной конференции по физико-химической биологии, посвященной 70-летию со дня рождения академика Ю.А.Овчинникова (Москва, 2004).
По материалам диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 4 статьи в реферируемых журналах.
Лигандсвязывающие участки Fc фрагмента
Сайты взаимодействия IgG с Clq компонентом системы комплемента. Исследования показали, что связывание молекулы IgG и Clq компонента системы комплемента происходит в СН2 домене [101, 102]. Изучение рекомбинантных иммуноглобулинов мыши IgG2b позволило сделать вывод о том, что для связывания с Clq в молекуле IgG необходимо наличие трех определенных аминокислотных остатков, и что последовательности всех подклассов иммуноглобулинов содержат этот мотив в СН2 домене. Мотив связывания СН2 содержит следующие аминокислоты: Glu-318, Lys-320 и Lys-322 (рис. 1.4); их замена методом точечного мутагенеза приводит к ингибированию лизиса клеток посредством комплемента [103 -105].
Несмотря на то, что такой мотив связывания характерен для всех подклассов IgG человека, не все из них связывают Cql компонент системы комплемента одинаково (табл. 1.2). Для определения аминокислотных остатков, отвечающих за различную способность подклассов IgG активировать комплемент, Тао с сотр. [106] сконструировал химерные IgGl/IgG4 иммуноглобулины, в которых С-концевые участки СН2 домена были соответственно переставлены. Полученные данные позволили сделать вывод о том, что С-концевая область СН2 домена (аминокислотные остатки 292-340) ответственна за изотипическую разницу в реализации эффекторных функций. Аминокислотные остатки серина (Ser-ЗЗО и Ser-ЗЗІ) С-концевой области СН2 домена характерны исключительно для IgG4, тогда как во всех других подклассах иммуноглобулинов человека в этих положениях находятся остатки аланина и пролина, соответственно. Было установлено, что в результате замены аминокислотного остатка Ser-ЗЗІ в неактивной молекуле IgG4 на пролин (подобно Рго-331 в молекуле IgGl), молекула IgG4 становится способной осуществлять клеточный лизис [107]. Показательно, что и обратная замена в IgGl Рго-331 на Ser выражается в потере молекулой IgGl способности активировать комплемент [58, 107, 108,]. Рентгеноструктурные исследования Fc фрагмента IgGl человека показали, что Рго-331 находится в непосредственной близости к мотиву связывания Clq [53] (рис. 1.4). Кроме
Рго-331 другие аминокислотные остатки на поверхности СН2 домена также могут отвечать за эффективное связывание с Clq. Одним из таких остатков является Ala-ЗЗО. Доступный для растворителя Ala-ЗЗО может или непосредственно участвовать во взаимодействии с Clq или обеспечивать необходимую для связывания конформацию боковой цепи. Большее свободное пространство, которое обеспечивает аланин по сравнению с аминокислотными остатками, имеющими длинную боковую цепь, позволяет освободить место для следующего "стерически неудобного" остатка Рго-331.
Таким образом, было показано, что аминокислотный остаток 331 и, возможно, 330 также имеют отношение к сайту связывания с Clq и, по крайней мере, частично ответственны за различие в способности подклассов активировать комплемент. Эти аминокислоты вместе с мотивом Glu318-Lys320-Lys322 формируют область, доступную для растворителя, которая, по-видимому, и распознается субъединицами молекулы Clq.
Сайты взаимодействия IgG с Fey рецепторами. Изучение взаимодействия FcyRI рецептора с различными пептидами, соответствующими последовательности Fc фрагмента иммуноглобулина человека, позволило определить, что ключевым участком связывания IgG с FcyRI является аминокислотная последовательность нижнего шарнирного региона Leu-Leu-Gly-Gly-Pro (остатки 234-238) [109] (рис 1.4). Для проверки этого предположения был получен ряд химерных IgG3 белков, в каждом из которых один из пяти аминокислотных остатков был заменен на остаток аланина. Анализ способности полученных IgG связывать Fey рецепторы показал, что с последовательностью Leu-Leu-Gly-Gly-Pro взаимодействуют все три типа рецепторов [110-112]. Интересно, что все пять аминокислотных остатков присутствуют в молекулах IgGl и IgG3, активно связывающих Fey рецпторы. IgG4, связывающий Fey рецепторы с меньшей аффинностью, чем IgGl и IgG3 имеет последовательность нижнего шарнирного участка Phe-Leu-Gly-Gly; a IgG2, практически не взаимодействующий с рецепторами, - Val-АІа-делеция-Gly [1, 113]. Полномасштабное исследование связывания аланин-замещенных модификаций иммуноглобулина при помощи метода иммуноферментного анализа позволило составить карту аминокислотных остатков, влияющих на связывание с FcyRI рецептором [114]. Кроме пяти аминокислотных остатков нижнего шарнирного региона она включает остатки аспарагиновой кислоты-265, аспарагина-297, аланина-327 (который замещали на глутамин) и пролина-329. Эти аминокислотные остатки расположены в обращенной к шарнирному региону части СН2 домена [53]. Дальнейшие исследования показали, что все аминокислотные остатки, участвующие во взаимодействии с FcyRI рецептором, связываются и с FcyRII и с FcyRIII рецепторами [100]. Были отмечены также и дополнительные сайты связывания с Fey рецепторами, расположенные в СН2 и СНЗ доменах [108, 115 - 117].
Анализ литературных данных позволяет предположить, что в молекуле иммуноглобулина площадка связывания с Fey рецептором состоит из нижнего шарнирного региона и участка СН2 домена (рис. 1.4). Расчет поверхностного электростатического потенциала Fc фрагмента показал, что область связывания с FcyR несет отрицательно зараженные аминокислоты [118], в то время как соответствующий участок Fey рецептора содержит несколько положительно заряженных аминокислотных остатков [119]. В пользу электростатического характера взаимодействия свидетельствует и строгая зависимость константы связывания IgG - FcyR от концентрации хлорида натрия [118].
Определение N-концевого аминокислотного остатка
Определение числа SH-групп в IgGl, Fab или Fc фрагмнтах (предварительно инкубированных в условиях А, В, С или D) осуществляли методом амперометрического титрования нитратом серебра или хлоридом ртути (в конц. 0.5x10"3 М), предложенным для белков Benesch с сотр. [179] в нашей модификации [180, 181]. Титрование 5-10 нмоль белка вели в 15-20 мл 0.025 М аммиачно-нитратного буфера, рН 7.2, содержащего 2 мМ ЭДТА (при использовании AgN03) или 0.1 М Трис-HCl буфера, рН 7.2 (при использовании HgCl2) в отсутствие или присутствие детергентов (мочевины и SDS) в концентрациях, которые были использованы при предварительной инкубации белка. В качестве электрода сравнения использовали электрод Hg/Hgl2. Силу диффузионного тока в растворе определяли с помощью микроамперметра Ф 195 (завод «Вибратор», Россия) с чувствительностью 5x10"8 А/деление. Титрование вели до появления четкой линейной зависимости между нарастанием силы тока и количеством добавленного AgN03 или HgCl2.
Для определения числа дисульфидных связей в IgGl (5-Ю нмоль белка, предварительно инкубированного в условиях С или D) был применен метод амперометрического титрования в присутствие сульфита натрия, согласно [182] и в нашей модификици [180]. После полного меркаптидирования всех свободных остатков цистеина в титруемую пробу белка добавляли 0.1 мл насыщенного раствора сульфита натрия и определяли количество SH-rpynn, высвободившихся в результате разрыва дисульфидных связей. Количество дисульфидных связей рассчитывали также на основании разности числа SH-rpynn, определенных в результате титрования двух параллельных проб денатурированного белка: с расщепленными и нерасщепленными дисульфидными связями.
Алкилирование йодуксусной кислотой. Йодуксусную кислоту перекристаллизовывали непосредственно перед реакцией для удаления свободного йода. К раствору IgGl (20 нмоль, 1.5 мг/мл, инкубированного в условиях А, В или С) добавляли 80-кратный молярный избыток (в расчете на 4 SH-группы) йодуксусной кислоты, предварительно растворенной в 200 мкл 0.5 М аммоний-бикарбонатного буфера. Карбоксиметилирование проводили при комнатной температуре в темноте, в атмосфере азота в течение 30 минут, постоянно контролируя рН реакционной смеси. Значение рН около 7.2 поддерживали, добавляя в реакционную смесь необходимое количество 1М NaOH. По окончании реакции от избытка реагентов избавлялись при помощи гельфильтрации IgGl на колонке (5x30см) с носителем Биогель Р-6, уравновешенным буфером II, скорость элюирования составляла 2.5 мл/мин. Оставшийся в растворе SDS удаляли инкубацией с сорбентом Калбиосорб в течение 15 минут при комнатной температуре, сорбент удаляли центрифугированием (15 мин, 3000g, +4С). Раствор белка концентрировали ультрафильтрацией на мембране РМ-10.
Количество S-карбоксиметилцистеина определяли на основании результатов аминокислотного анализа (см. раздел 2.2.2.6). Степень модификации иммуноглобулина оценивали также по разнице числа свободных остатков цистеина, выявляемых до и после алкилирования методом амперометрического титрования в условиях С (см. раздел 2.2.3.2).
Алкилирование N-дансилазиридином (ДАЗ). К препарату IgGl (20 нмоль, 1.5 мг/мл), инкубированному в условиях А, В или С добавляли диметилформамид (ДМФА) до конечной концентрации 10% и 40-кратный (в расчете на 4 SH-группы) молярный избыток ДАЗ, предварительно растворенный в 100 мкл ДМФА. Реакцию вели при рН 7.2, комнатной температуре, в атмосфере азота, в темноте. Через один час после начала модификации в реакционную смесь добавляли порцию N-дансилазиридина, равную первоначальной, после чего реакция продолжалась еще в течение часа. По окончании реакции избыток реагентов удаляли, как описано выше.
Степень включения метки определяли спектрофотометрически, используя коэффициент молярной экстинции для дансильного хромофора, равный 4400 ІУГ см"1 при длине волны 335 нм [183]. Степень модификации иммуноглобулина оценивали также по разнице числа свободных остатков цистеина, выявляемых до и после алкилирования методом амперометрического титрования в условиях С (см. раздел 2.2.3.2). Алкилирование 4-аминосульфонил- 7-фтор-1,3-бензоксо-диазолом
(АБД-Ф). К препарату IgGl (20 нмоль, 1.5 мг/мл), инкубированному в условиях А, В или С добавляли 10% диметилформамида и АБД-Ф до конечной концентрации 2 мМ [184]. АБД-Ф предварительно растворяли в 100 мкл диметилформамида. Реакцию вели при рН 7.2, комнатной температуре, в атмосфере азота, в темноте. Через один час после начала модификации в реакционную смесь добавляли порцию АБД-Ф, равную первоначальной. Через два часа после начала алкилирования избыток реагентов удаляли, как описано выше.
Степень включения метки определяли спектрофотометрически, используя коэффициент молярной экстинции для АБД равный 7800 МГ см"1 при длине волны 384 нм [185]. Степень модификации иммуноглобулина оценивали также по разнице числа свободных остатков цистеина, выявляемых до и после алкилирования методом амперометрического титрования в условиях С (см. раздел 2.2.3.2).
Алкилирование 4-е ин win up ид ином. К порции IgGl (40 нмоль, 1.5 мг/мл, предварительно инкубированного в условиях А, В или С) добавляли 40-кратный молярный избыток (в расчете на 4 SH-группы) свежеперегнанного 4-винилпиридина. Повторное введение такой же порции осуществляли через 1 час после начала реакции. Алкилирование вели при рН 7.2, при комнатной температуре, в атмосфере азота, в темноте в течение двух часов. В случае преинкубации IgGl в условиях С, через два часа после начала реакции 1/2 часть порции брали на тестирование, к оставшейся части дополнительно добавляли 2М мочевины (до конечной концентрации ЮМ) и порцию 4-винилпиридина, равную первоначальной, после чего реакцию вели в течение еще четырех часов. По окончании реакции избыток реагентов удаляли, как описано выше.
Определение числа свободных остатков цистеина в IgGl человека
Тиоловые группы являются сильными нуклеофилами [205], их реакционная способность варьирует в широких пределах и определяется многими факторами - влиянием функциональных групп окружающих аминокислот, укладкой полипептидных цепей в молекуле, пространственным расположением в белковой глобуле [206, 207]. В связи с этим было предложено разделять SH-группы белков на три типа: реакционноспособные, вялореагирующие и маскированные [206]. Если определение реакционноспособных SH-групп, расположенных на поверхности молекулы, не вызывает затруднений, то выявление остатков цистеина, находящихся в гидрофобных кластерах, является сложной задачей и становится возможным лишь после глубокой денатурации или гидролиза белка при условии, что используемые тиоловые реагенты обладают не только высокой селективностью к SH-группам, но и способны проникать вглубь молекулы [180, 208 - 210].
Ввиду отсутствия единой точки зрения относительно существования свободных остатков цистеина в IgGl, молекулу исследовали как в нативном, так и в денатурированном состоянии. Учитывая, что в IgGl имеется много дисульфидных связей и молекула устойчива к денатурирующим воздействиям, необходимо было подобрать не только условия максимальной денатурации белка с сохранением дисульфидных связей, но и реагенты, способные селективно взаимодействовать с SH-группами, расположенными как в гидрофильных, так и гидрофобных кластерах иммуноглобулина. С этой целью для тестирования SH-групп были использованы три типа специфических реакций: меркаптидирование (нитратом серебра или двухлористой ртутью), тиол-дисульфидный обмен (реактив Эллмана) и алкилирование (иодуксусной кислотой, 4-винилпиридином, N-дансилазиридином (ДАЗ) или 4-аминосульфонил-7-фтор-2,1,3-бензоксадиазолом (АБД-Ф)). 3.2.1. Легкодоступные остатки цистеина
Для определения числа легкодоступных реакционноспособных SH-rpynn IgGl, выделенные из крови здоровых доноров, предварительно инкубировали в аммоний-бикарбонатном буфере, рН 7.2, не содержащем денатурирующих агентов, в течение 5 минут при 37С (условия А), после чего подвергали тестированию с помощью перечисленных выше методов. Из анализа полученных данных (табл. 3.2, условия А) следует, что в одной и той же партии нативного белка в зависимости от природы тиолового реагента определяется от 0.3 до 1.1 свободных остатков цистеина, что в среднем составляет 0.70±0.12 реакционноспособных SH-групп моль/моль белка. Минимальное количество остатков цистеина определялось при использовании йодуксусной кислоты и реактива Эллмана, а максимальное - при амперометрическом титровании белка нитратом серебра или двухлористой ртутью (табл. 3.2, условия А), что может объясняться различиями в реакционной способности и заряде тиоловых реагентов [211 -213]. Таким образом, результаты эксперимента показывают, что в IgGl здоровых доноров присутствует одна реакционноспособная SH-rpynna.
Согласно литературным данным, молекула IgGl содержит четное число -32 - остатков цистеина, образующих 16 S-S связей [214]. Таким образом, обнаружение одной реакционноспособной SH-группы позволяет предположить наличие еще как минимум одного (или более) маскированного остатка цистеина, недоступного для тиоловых реагентов в нативных условиях, и меньшее число дисульфидных связей. Для выяснения взаимосвязи между степенью разрушения третичной и вторичной структуры и демаскированием SH-групп была проведена серия экспериментов с использованием различных режимов денатурации IgGl и способов тестирования свободных остатков цистеина. Предварительные исследования показали, что применение высоких концентраций мочевины или гуанидинхлорида вызывает ограниченную деструкцию молекулы, недостаточную для выявления глубоко маскированных остатков цистеина. В связи с этим, для денатурации белка было использовано сочетание мочевины с SDS. Однако оказалось, что в результате инкубации IgGl (10 минут) в присутствие 8М мочевины и 2% SDS (рис. 3.2, условия Вш) методом амперометрического титрования определяется не более 1.76±0.1 SH-групп моль/моль белка. Полное демаскирование SH-групп не достигается даже при увеличении времени взаимодействия белка с денатурирующими агентами. После 120-ти минутной инкубации белка в той
Число легкодоступных и маскированных SH-rpynn, выявляемых методом амперометрического титрования в зависимости от условий денатурации белка. Условия инкубации А, В, С см. в подписи к таблице 2; В10 - 10 мин инкубация в условиях В; D - инкубация в присутствии 8 М мочевины и 4% SDS в течение 120 минут при комн. темп., концентрация мочевины в инкубационной среде повышалась ступенчато путем добавления порций мочевины, соответствующих двум молям с интервалом в 30 минут. же среде (рис. 3.2, условия В) количество легкодоступных SH-rpynn возрастало всего до 2.8±0.04. И только при ступенчатом повышении концентрации мочевины (рис. 3.2, табл. 3.2, условия С) происходила достаточно глубокая денатурация белка с высвобождением четырех SH-rpynn, которые с высокой воспроизводимостью определялись методом амперометрического титрования, но лишь частично выявлялись при применении других методов тестирования. Так, с помощью алкилирующих и дисульфидсодержащих реагентов в условиях С определялось не более 2.2-3.3 SH-групп, и только в случае шестичасовой инкубации с 4-винилпиридином при дополнительном введении мочевины (до 10 М) удалось модифицировать 3.9±0.02 остатка цистеина (табл. 3.2).
Исходя из полученных данных, можно предположить, что основная причина, по которой многим авторам не удалось обнаружить маскированные остатки цистеина, связана с устойчивостью макромолекулы к денатурирующим воздействиям и возможным участием SH-групп во внутримолекулярных нековалентных взаимодействиях [210, 215].
Выделение и анализ флуоресцентных цистеинсодержащих пептидов IgGl
Согласно результатам, полученным нами в процессе выявления свободных остатков цистеина (разд. 3.2), в IgGl, выделенных из сыворотки крови здоровых доноров, присутствует одна легкодоступная SH-группа, в то время как в IgGl больных людей такой SH-группы обнаружить не удается [15, 16]. Возможно, реакционноспособный остаток цистеина, выявляемый в IgGl здоровых доноров, является функционально значимым и участвует в передаче антигениндуцированного конформационного сигнала от Fab к Fc области молекулы.
Для проверки данной гипотезы был проведен сравнительный анализ агглютинирующей способности IgGl здоровых доноров до и после алкилирования свободных остатков цистеина. С этой целью, с помощью реакции пассивной гемагглютинации в препаратах нативного и алкилированного IgGl, а также исходной сыворотки крови, определялось количество нормальных антител к антигенам грам-положительных бактерий с помощью соответствующих эритроцитарных диагностикумов [15, 16].
На данном этапе работы для алкилирования IgGl был выбран N-дансилазиридин, поскольку методом кругового дихроизма было показано, что модификация N-дансилазиридином IgG кролика не сопровождается заметными изменениями во вторичной структуре белка и незначительно сказывается на его антигенсвязывающих свойствах [223]. Модификацию проводили в отсутствие детергентов (условия А, см. разд. 3.2).
Исследования показали, что нативные IgGl, так же как и сыворотка, из которой они выделялись, обладали практически идентичной агглютинирующей способностью (при одинаковых концентрациях IgG). Их титры в зависимости от антигена, составляли 1:64 или 1:128. В то же время, модификация 0.5 (моль/моль белка) остатков цистеина в IgGl приводила к снижению титров, а 0.9 - к практически полной потере способности антител агглютинировать сенсибилизированные специфическим антигеном эритроциты (табл. 3.6, рис. 3.8 Поскольку блокирование легкодоступного остатка цистеина ведет к потере агглютинирующей способности антител, информация о его местоположении представляется исключительно важной с функциональной точки зрения.
В ходе настоящего исследования показано, что четыре тиоловые группы IgGl принадлежат Cys-220 двух Н-цепей и Cys-214 двух L цепей молекулы. Таким образом, для локализации одной легкодоступной SH-группы достаточно определить, в какой из цепей - легкой или тяжелой - она находится. Для определения местоположения реакционноспособной SH-группы IgGl было проведено ограниченное алкилирование одного остатка цистеина N-дансилазиридином с последующим анализом распределения флуоресценции между легкой и тяжелой цепями, а также выделением меченого пептида при помощи ВЭЖХ.
Оценка распределения флуоресцентных производных цистеина между цепями IgGl. Наличие одной легкодоступной и трех маскированных SH-групп в исходном IgGl, выделенном из сыворотки здорового донора, было подтверждено методом амперометрического титрования. Алкилирование одной легкодоступной SH-группы проходило в отсутствие детергентов (условия А) в течение двух часов. Анализ степени модификации IgGl спектрофотометрическим методом, а также количественное определение немодифицированных остатков цистеина IgGl методом амперометрического титрования показали, что в результате реакции было алкилировано 0.9 SH-групп моль/моль белка, а остальные три выявлялись в денатурирующих условиях.
Разделение алкилированного IgGl на легкие и тяжелые цепи проводилось при помощи Na-SDS электрофореза по Леммли в денатурирующих условиях, необходимых для разрушения нековалентных связей между цепями. Учитывая, что в присутствии SDS маскированные SH-группы становятся реакционноспособными, а белок - склонным к агрегации [234 - 237], для предотвращения этого процесса электрофорез вели в присутствии [3-меркаптоэтанола. Анализ распределения флуоресценции (рис. 3.9) показал, что SH-группа, модифицированная N-дансилазиридином, находилась в тяжелой цепи молекулы IgGl.
