Введение к работе
Герпесвирусные инфекции занимают одно из первых мест по распространенности, сложности диагностики и лечения среди инфекционных заболеваний. Клинические симптомы этих инфекций перекрываются с множеством других заболеваний, поэтому большое значение придается разработке диагностических систем, позволяющих дифференцировать инфекционный агент с высокой степенью специфичности. Сложность иммунодиагностики герпесвирусных инфекций обусловлена так же значительным серологическим перекрестом не только внутри семейства, но и с другими вирусами.
Семейство Herpesviridae включает 8 видов герпесвирусов человека и состоит из трех подсемейств: а-, Р- и у- herpesvirinae. Наиболее существенное социальное и эпидемиологическое значение имеют шесть агентов - вирусы простого герпеса 1 и 2-го типа (ВПГ-1 ВПГ-2); вирус ветряной оспы и опоясывающего лишая (ВВО); цитомегаловирус (ЦМВ); вирус герпеса человека 6-го типа (ВГЧ-6); и вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ). Вирус герпеса человека 7-го типа (ВГЧ-7), и вирус саркомы Капоши или вирус герпеса человека 8-го типа (ВГЧ-8) открыты сравнительно недавно и этиопатогенетическое значение этих инфекций изучено не достаточно. Данная работа посвящена исследованию первых 6-ти видов герпесвирусов человека.
Социально-экономический ущерб, наносимый а-герпесвирусами, трудно переоценить. Среди заболеваний, вызванных инфекцией вирусом простого герпеса, наибольшее значение имеет генитальный герпес, заболеваемость которым в разных странах достигает 80 - 200 случаев на 100 тыс. населения, и этот показатель продолжает расти. По данным официальной статистики, в России показатель заболеваемости генитальным герпесом составляет 8-9 случаев на 100 тыс. населения, что, очевидно, не соответствует истинному положению и, прежде всего, связано с недостаточным клинико-диагностическим обследованием больных. В США, по данным CDC, 45 миллионов людей старше 12 лет, или 1 из 5 подростков и взрослых заражаются ВПГ-2. Начиная с конца 1970-х годов, количество людей с генитальным герпесом в этой стране увеличилось на 30%. Вероятно, при соответствующем уровне диагностики и статистических оценок, сходные показатели могут быть зарегистрированы в России. Не менее значительный ущерб здоровью наносит и окулярный герпес. Около половины случаев поражения роговицы и слепоты, вызванной инфекционными болезнями, связывают с герпетической инфекцией. Тяжелейшей а-герпесвирусной инфекцией является энцефалит, требующий экспресс-диагностики и неотложной помощи, частота которого увеличилась вдвое в последние 5-10 лет.
В настоящее время практически во всех развитых странах Запада существует вакцинопрофилактика детей против ветряной оспы. До введения VARIVAX вакцины в Соединенных Штатах Америки регистрировалось около 4 млн. случаев ветряной оспы в год (количество, эквивалентное числу новорожденных), что ежегодно приводило к 8 000-12 000 случаям госпитализации и, по крайней мере, к 100 смертельным случаям. В России вакцинация против ВВО отсутствует.
Возрастающая угроза биотерроризма требует разработки дифференциальной экспресс-диагностики а-герпесвирусов, которая позволит дифференцировать натуральную и ветряную оспу на ранних этапах клинических проявлений.
Сероэпидемиологические исследования Р-герпесвирусных инфекций показывают, что цитомегаловирусная инфекция широко распространена в человеческой популяции от развитых, промышленных сообществ до различных групп аборигенов. Инфекция ЦМВ превалирует среди детей и подростков развивающихся стран, и в нижних социально-экономических слоях экономически-развитых стран. Социально-экономическое значение этой инфекции прежде всего связывают с поражением герминативного эпителия у мужчин и женщин. У мужчин такие поражения приводят к полиплоидии сперматозоидов и к бесплодию. Оценка распространенности инфекции ЦМВ среди здоровых семейных пар в Юго-Западной Азии, обращающихся за медицинской помощью по поводу бесплодия колеблется от 25,3% до 92%. Чрезвычайно актуально выявление острой инфекции у беременных женщин, т.к. почти все случаи мертворождения инфекционной природы связывают с этой инфекцией. Не менее важно выявление инфекции ЦМВ во время беременности в связи с угрозой тератогенного эффекта. Широкое распространение ЦМВ среди людей, опубликованные данные о его связи с атеросклерозом и другими болезнями, диктуют необходимость разработки более совершенных видов диагностики и детального изучения его роли в патогенезе этих заболеваний.
Вирус герпеса человека 6 типа исследуется сравнительно недавно, и эпидемиология этой инфекции изучена недостаточно. Значительное количество работ посвящено роли ВГЧ-6 в патогенезе рассеянного склероза и других заболеваниях нервной системы. Опубликован ряд работ, показывающих вовлечение этой вирусной инфекции в формирование синдрома хронической усталости. Инфекция герпесвирусом 6 типа проявляется в младенчестве в виде внезапной экзантемы, это - наиболее изученное проявление болезни. Разработка высокоспецифичной диагностики Р-герпесвирусных инфекций чрезвычайно актуальна ввиду их широкой распространенности и слабой изученности.
Инфекция вирусом Эпштейна-Барр (подсемейство у - герпесвирусов) прежде всего ассоциируется с инфекционным мононуклеозом, лимфомой Биркита, носоглоточной
(назофарингеальной) карциномой и лимфопролиферативными болезнями иммуносупрес-сивных лиц. В большинстве случаев инфекция ВЭБ протекает без видимых проявлений болезни. Среди взрослого населения планеты у 80-90% здоровых лиц регистрируется серологическое подтверждение инфекции вирусом ВЭБ в прошлом. Для вируса Эпштейна-Барр, как и для других герпесвирусов человека, характерна скрытая (латентная) форма инфекции. В настоящее время значительно возросло количество онкозаболеваний, этиологическим агентом которых определен вирус Эпштейна-Барр. Все эти обстоятельства делают разработку диагностики у - герпесвирусных инфекций важной и актуальной.
В России для выявления антител к герпесвирусам в крови пациентов до наших исследований использовался твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) на основе нативных антигенов. Анализ состояния разработок диагностических тестов для выявления антител к герпесвирусам в сыворотках больных показал, что принципиально важным в этой области является поиск и выбор высоко специфичных антигенов, прежде всего, полученных методами генной инженерии.
Цель и задачи исследования
Целью настоящего исследования было конструирование видоспецифичных ре-комбинантных антигенов и выявление генетических маркеров герпесвирусов 1-6 типов для диагностики соответствующих герпесвирусных инфекций человека.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
На основе анализа литературных данных выбрать иммунодоминантные белки герпесвирусов 1-6 типов человека для конструирования на их основе видоспецифичных рекомбинантных антигенов.
-
С помощью компьютерного анализа аминокислотных последовательностей выбранных белков-антигенов герпесвирусов определить в их структуре потенциальные антигенные детерминанты и кодирующие их участки соответствующих генов, а также подобрать олигонуклеотиды-праймеры и оптимальные условия ПНР для амплификации выбранных районов генов исследуемых герпесвирусов.
-
Амплифицировать и клонировать выбранные районы геномов референсных штаммов герпесвирусов 1-6 типов человека в клетках Е.соїі в составе плазмидных экс-прессирующих векторов. Наработать, очистить и оценить пригодность для диагностики полученных рекомбинантных антигенов:
разработать вариант экспрессирующего плазмидного вектора, кодирующего шестигистидиновый тракт (6> клонировать выбранные фрагменты геномных ДНК исследуемых герпесви- русов в клетках Е.соїі в составе экспрессирующего вектора и получить штаммы-продуценты соответствующих видоспецифичных рекомбинантных антигенов, подобрать оптимальные условия очистки рекомбинантных белков-антигенов и наработать их в препаративных количествах, используя стандартные панели сывороток и сыворотки от больных герпес-вирусными инфекциями, оценить возможность использования полученных рекомбинантных антигенов для выявления в сыворотках больных иммуноглобулинов, специфичных к соответствующим типам герпесвирусов, разработать панель сывороток человека для выявления иммуноглобулинов, специфичных к цитомегаловирусу, получить флуоресцентные антисыворотки к рекомбинантным антигенам ци-томегаловируса. 4. Провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей геномов герпесвирусов 1-6 типов человека, депонированных в международных электронных базах данных, с целью выявления специфичных для них генетических маркёров: выявить районы геномов, перспективные для использования в качестве генетических маркеров соответствующих типов герпесвирусов, с учетом вариабельности выбранных генетических районов герпесвирусов разработать олигонуклеотиды-праймеры, условия и кинетику амплификации методом ПЦР выбранных генетических маркеров, создать лабораторные варианты и апробировать разработанные способы обнаружения геномных ДНК герпесвирусов 1 -6 типов методом ПЦР на коллекции референс-штаммов герпесвирусов человека, а также на клиническом материале от больных. Научная новизна В ходе работы впервые проведена комплексная оценка иммунодоминантных районов вирионных белков герпесвирусов человека 1-6 типов. Выявлены потенциальные антигенные детерминанты в иммунодоминантных районах белков шести типов герпесвирусов человека. Сконструирован плазмидный вектор, обеспечивающий экспрессию клонированных в его составе чужеродных генов с образованием белков, содержащих дополнительную шестигистидиновую последовательность в С-концевой области цепи, позволяющую осуществлять аффинную очистку белка на металлохелатных сорбентах. Необходимость создания такого вектора была обусловлена отсутствием в то время конструкций, формирующих на С-конце 6> На основе обнаруженных уникальных аминокислотных последовательностей в вир ионных белках герпесвирусов (ВПГ-1, ВПГ-2, ВВО, ЦМВ, ВГЧ-6 и ВЭБ) разработаны рекомбинантные антигены, специфичные для соответствующих типов герпесвирусов человека: вирусов простого герпеса 1 и 2 типов: рек-gD-l (ВПГ-1) и peK-gG-2 (ВПГ-2). вируса ветряной оспы и опоясывающего лишая: рек-gE (ВВО). цитомегаловируса человека (ЦМВ): рек-рр150, рек-1Е2, рек-р52 и рек-рр65. вируса герпеса человека 6-го типа (ВГЧ-6): рек-рЮО и рек-р41. вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ): рек-р18 и рек-р54. Продемонстрирована перспективность использования полученных в данной работе рекомбинантных белков в качестве специфичных антигенов для выявления антител к соответствующим типам герпесвирусов. Выявлены новые генетические маркеры герпесвирусов человека 1-6 типов. Практическая ценность работы Практическая значимость данного исследования состоит в разработке рекомбинантных антигенов, специфичных для герпесвирусов 1-6 типов и перспективных для создания на их основе отечественных высокочувствительных диагностических систем удовлетворяющих требованиям клинической практики. С помощью разработанных в рамках данного исследования рекомбинантных антигенов рек-рр150, рек-р52 и рек-рр65 в ЗАО «Медико-биологический союз» (г. Новосибирск) создана и утверждена в ГИСК им. Л. А. Тарасевича стандартная панель сывороток человека для контроля иммуноферментных диагностических тест-систем, выявляющих IgG к цитомегаловирусу человека. Стандартная панель внесена в Реестр национальных стандартных образцов РФ под номером: ОСО 42-28-360-01. На основе сконструированных в настоящей работе антигенов ЗАО «Медико-биологический союз» (Новосибирск) разработана иммуноферментная тест-система для определения антител в сыворотке крови к цитомегаловирусу человека. Разработанные рекомбинантные антигены герпесвирусов в настоящее время используются для создания иммуноферментных тест-систем такими отечественными производителями, как: ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), ЗАО «Медико-биологический союз» (Новосибирск) и ЗАО «ИмДи» (Новосибирск). Получены меченые моноспецифические кроличьи антисыворотки к рекомби-нантным антигенам рек-1Е2 и рек-рр65 цитомегаловируса, позволяющие выявлять этот вирус в клинических образцах с помощью иммунофлуоресцентного анализа in situ. Созданы лабораторные варианты тестов для обнаружения герпесвирусов человека, основанные на амплификации методом ПЦР выявленных в настоящей работе генетических маркёров соответствующих типов герпесвирусов. Показана перспективность создания на их основе коммерческих тест-систем. В настоящее время часть их из них используется в ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск) для создания диагностических тест-систем. Значительная часть разработанных в работе генетических конструкций, олигонуклеотидов защищена патентами Российской Федерации. Разработанные способы диагностики инфекций, вызываемых герпесвирусами 1-6 типов, могут быть использованы в клинической диагностической практике, для скрининга донорской крови, которая пока в России не тестируется на присутствие вирусов данной группы, в трансплантологии и для проведения мониторинга различных групп населения во время эпидемиологических обследований. Положения, выносимые на защиту Сконструированные экспрессирующие плазмидные конструкции, включающие фрагменты генов герпесвирусов человека, обеспечивают биосинтез в клетках Е. coli ре-комбинантных белков, содержащих иммунодоминантные области антигенов герпесвирусов 1-6 типов. Использование рекомбинантных антигенов герпесвирусов 1-6 типов в ИФА позволяет выявлять антитела в сыворотке крови человека, специфичные для соответствующих герпесвирусов. 3. Сконструирован бактериальный (Е. coli) экспрессирующий вектор на основе плазмид- Флуоресцентные антисыворотки к рекомбинантным белкам рек-рр150, рек-1Е2 и рек-рр65 цитомегаловируса позволяют выявлять этот вирус в клинических образцах с помощью иммунофлуоресцентного анализа in situ. Стандартная панель сывороток, содержащих и не содержащих антитела класса G к цитомегаловирусу человека (ОСО 42-28-360-01) позволяет контролировать качество им-муноферментных тест-систем, выявляющих специфические IgG к ЦМВ. Олигонуклеотидные праймеры к генам US-6 (ВПГ-1) и UL44 (ВПГ-2), UL36 (ВВО), UL55 (ЦМВ), BKRF1 (ВЭБ) и U11 (ВГЧ-6), используемые в ПНР, позволяют обнаружи- вать геномные ДНК различных штаммов и клинических изолятов соответствующих типов герпесвирусов. Конкретное участие автора в получении результатов Участие автора при проведении всех исследований по диссертации заключается в личном проведении и участии практически во всех экспериментальных и теоретических работ. А также в научном руководстве и соруководстве исследований по герпесвирусам, выполняемых в лабораториях ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор", совместно с сотрудниками других институтов и производственных фирм. Апробация работы Представленные в диссертации результаты были доложены на различных конференциях и симпозиумах: Международной конференции " A multidisciplinary approach towards controlling cytomegalovirus disease" (Sweden, Stockholm, 1995), Международной конференции "The 22nd International Herpesvirus Workshop"(La Jolla, California, 1997), Юбилейная конференция, посвященная 30-летию журнала "Молекулярная биология" (Москва, 1997), Международной конференции "CMV 7th International Workhop" (Brighton, UK, 1999), Международной конференции «Assessment of Sponsored Biological Research in Russia for the New Millennium» (Russia, 1999), Российской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Россия, 2005). Публикации По материалам исследований опубликовано 15 статей в реферируемых научных журналах и получено 10 патентов Российской Федерации. Структура работы Диссертация состоит из введения, литературного обзора, главы материалы и методы и главы из 5 разделов, отражающих результаты собственных исследований и их обсуждения, выводов и приложений. Работа изложена на 416 с, включая 62 таблицы и 127 рисунков. Список литературы из 657 наименований включает 35 отечественных работ.
ной ДНК pUR290-6*his. Отличительными особенностями этой конструкции является ко
дирование шестигистидинового тракта (6>
металлохелатных сорбентах, и биосинтез Р-галактозидазы, которая в конечной конструк
ции укорачивается до небольшого размера и обеспечивает высокий уровень сорбции бел
ка на полистирольных планшетах.
Похожие диссертации на Конструирование рекомбинантных антигенов и выявление генетических маркеров для диагностики герпесвирусных инфекций человека
