Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Метапневмовирусная инфекция птиц 12
1.1.1. Исторические и эпизоотологические данные 12
1.1.2. Патогенез
1.1.2.1. Клинические признаки 15
1.1.2.2. Тропизм вируса и патологоанатомические изменения 17
1.1.2.3. Иммунитет при метапневмовирусной инфекции птиц 18
1.1.3. Специфическая профилактика 20
1.2. Характеристика МПВ птиц 22
1.2.1. Классификация 22
1.2.2. Строение и состав 25
1.2.3. Свойства 29
1.2.4. Устойчивость к физическим и химическим факторам 30
1.2.5. Цикл репродукции 32
1.3. Диагностика метапневмовирусной инфекции птиц 33
1.3.1. Молекулярные методы диагностики 33
1.3.2. Выделение вируса 36
1.3.3. Серологические методы диагностики 38
1.3.4. Гибридомная технология 39
1.4. Заключение по обзору литературы 40
2. Собственные исследования 42
2.1. Материалы и оборудование 42
2.1.1. Образцы патологического материала 42
2.1.2. Штаммы микроорганизмов 42
2.1.3. Сыворотки и пероксидазные конъюгаты антител 42
2.1.4. Последовательности МПВ птиц из базы данных GenBank 43
2.1.5. Ферменты и дезоксинуклеозидтрифосфаты 44
2.1.6. Праймеры 45
2.1.7. Животные 46
2.1.8. Культуры клеток 46
2.1.9. Среды для культивирования
2.1.10. Химические реагенты, растворы, буферные смеси 47
2.1.11. Оборудование 48
2.1.12. Расходные материалы 49
2.1.13. Коммерческие наборы 50
2.2. Методы исследований 50
2.2.1. Выбор праймеров и TaqMan-зондов 50
2.2.2. Выделение нуклеиновых кислот 50
2.2.3. ОТ-ПЦР-РВ 50
2.2.4. Обратная транскрипция и ПЦР 50
2.2.5. Очистка продуктов ПЦР 51
2.2.6. Секвенирование 52
2.2.7. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей...52
2.2.8. Выделение МПВ птиц в трахеальной органной культуре 52
2.2.9. Электрофорез белков и иммуноблоттинг 2.2.10. Иммуноцитохимический анализ 54
2.2.11. Приготовление перитонеальных макрофагов мыши 54
2.2.12. Культивирование гибридом in vitro 54
2.2.13. Клонирование гибридом методом лимитирующих разведений .55
2.2.14. Культивирование гибридом in vivo 55
2.2.15. Замораживание, размораживание и хранение гибридом 56
2.2.16. Определение титра инфекционной активности вируса в культурах клеток и органов 56
2.2.17. Непрямой твердофазный вариант ИФА 56
2.2.18. Непрямой твердофазный «сэндвич»-вариант ИФА 57
2.2.19. Статистическая обработка результатов 57
3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 58
3.1. Разработка ОТ-ПЦР (ген К) для выявления генома МПВ птиц подтипов А и В 58
3.2. Разработка ОТ-ПЦР в режиме реального времени для выявления генома МПВ птиц подтипов А и В 61
3.3. Исследование образцов патологического материала на наличие генома МПВ птиц в 2005-2010 гг 66
3.4. Выделение МПВ птиц в трахеальной органной культуре 72
3.5. Изучение биологических свойств изолята aMPV/В/02/2007 МПВ птиц 75
3.6. Использование моноклопальных антител в твердофазном непрямом «сэндвич»-варианте ИФА для выявления антигена МПВ птиц 78
3.6.1. Характеристика моноклональных антител к МПВ птиц 79
3.6.2. Разработка твердофазного непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для выявления антигена МПВ птиц
3.7. Анализ последовательностей фрагментов генов О и N изолятов МПВ птиц 88
3.8. Анализ полных последовательностей генов О, Р и N изолятов МПВ птиц
4. Заключение ПО
5. Выводы 114
6. Практические предложения 115
7. Список использованной литературы
- Тропизм вируса и патологоанатомические изменения
- Сыворотки и пероксидазные конъюгаты антител
- Культивирование гибридом in vitro
- Разработка твердофазного непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для выявления антигена МПВ птиц
Введение к работе
1.1. Актуальность темы. Метапневмовирусная инфекция (МПВИ) птиц
- респираторное заболевание, характеризующееся воспалительными
процессами верхних дыхательных путей кур и индеек всех возрастов.
Заболевание контагиозно, однако уровень смертности обычно не превышает 2-
5% [5]. Экономический ущерб от МПВИ обусловлен повышенной выбраковкой
некондиционной птицы, снижением прироста живой массы и яичной
продуктивности.
Возбудителем заболевания является метапневмовирус птиц (МПВ птиц или Avian Metapneumo virus, aMPV) семейства Paramyxoviridae. Геном вируса представлен линейной несегментированной молекулой неинфекционной РНК и содержит 8 генов. Выделяют четыре подтипа метапневмовируса птиц: А, В, С и D. Вирусы подтипов А и В распространены в Европе, Азии, Африке, Южной и Северной Америке, тогда как МПВ птиц подтипа С циркулирует преимущественно у индеек в США [5]. Метапневмовирус птиц подтипа D был выявлен лишь однажды во Франции [9].
В птицеводческих хозяйствах России отмечают случаи респираторных заболеваний у кур и индеек различной степени тяжести. Поскольку клинические признаки и патологоанатомические изменения при МПВИ непатогномичны, основная роль в постановке диагноза принадлежит лабораторным методам.
1.2. Степень разработанности проблемы. Вопросам диагностики
МПВИ птиц посвящены работы ряда зарубежных авторов [3, 4, 6, 7], однако
разработанные ими методы имеют недостатки. Предложенная М.Н. Вауоп-
Auboyer с соавт. одношаговая ОТ-ПЦР для выявления генома МПВ птиц всех 4
подтипов уступала по чувствительности подтипоспецифическим «nestecb-ПЦР
[4]. Разработанные О. Guionie с соавт. подтипоспецифические ОТ-ПЦР в
режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) для выявления МПВ птиц обладали
недостаточной специфичностью [6]. Учитывая широкое распространение МПВ
птиц подтипов А и В в мире, в том числе и в России, необходимо было разработать чувствительные и специфичные методы ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ для выявления генома вируса данных подтипов.
Молекулярную диагностику МПВИ птиц в птицеводческих хозяйствах России проводят с 2001 г. [2] с помощью ОТ-ПЦР (ген G), предложенной С. Naylor с соавт. [3] и D. Cavanagh с соавт. [7]. В 2001-2005 гг. геном МПВ птиц подтипов А и В выявили у птицепоголовья 3 и 9 хозяйств, соответственно. Однако филогенетические связи изолятов вируса изучены не были.
В работе Е.А. Лазуткиной и Б.Ф. Бессарабова изучены клинические признаки и патологоанатомические изменения при МПВИ у цыплят-бройлеров в условиях птицефабрики [1]. При этом выделение вируса и изучение его свойств при экспериментальном заражении птиц не проводили.
1.3. Цели и задачи исследований. Целью данной работы являлась разработка методов лабораторной диагностики МПВИ птиц, их применение для изучения распространения МПВ птиц в хозяйствах России, а также изучение свойств изолятов вируса. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
Разработать методы выявления генома МПВ птиц подтипов А и В в ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в режиме реального времени.
С помощью разработанных методов исследовать пробы патологического материала, полученные из птицеводческих хозяйств, на наличие МПВ птиц.
Изучить свойства полевых изолятов МПВ птиц.
Провести анализ гибридом с целью отбора клонов, продуцирующих специфические моноклональные антитела к МПВ птиц.
Разработать метод определения активности антигена МПВ птиц, полученного в культуре клеток, на основе твердофазного непрямого «сэндвич»-варианта иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител.
6. Установить филогенетические связи изолятов МПВ птиц, выявленных в 2005-2010 гг.
1.4. Научная новизна исследований. Разработаны
подтипоспецифические методы выявления генома МПВ птиц подтипов А и В в
ОТ-ПЦР-РВ (ген G) и метод для одновременного выявления генома МПВ птиц
подтипов А и В в ОТ-ПЦР (ген N).
Создана база нуклеотидных последовательностей фрагментов генов G и N изолятов МПВ птиц, выявленных у кур и индеек из хозяйств России и некоторых стран ближнего зарубежья в 2005-2010 гг.
Впервые определены полные последовательности генов G, F и N семи полевых изолятов МПВ птиц подтипа В, выделенных от кур из хозяйств России и Украины в 2007-2010 гг.
Разработан твердофазный непрямой «сэндвич»-вариант ИФА с использованием моноклональных антител для оценки активности антигена МПВ птиц, полученного в различных культурах клеток.
1.5. Практическая значимость работы. С помощью разработанных
методов ПЦР на наличие генома МПВ птиц подтипов А и В исследовано 965
проб патологического материала от кур и индеек, поступивших в 2005-2010 гг.
из птицеводческих хозяйств России и стран ближнего зарубежья. Установлено
преобладание изолятов вируса подтипа В. Полученные результаты послужили
обоснованием выбора штамма МПВ птиц подтипа В для производства вакцин
против МПВИ птиц в ФГБУ «ВНИИЗЖ».
Разработанный метод твердофазного непрямого «сэндвич»-варианта ИФА использовали для оценки качества вируссодержащего сырья на различных этапах изготовления диагностических тест-систем.
1.6. Соответствие диссертации паспорту научной специальности. В
соответствии с формулой специальность 03.02.02 «Вирусология» представляет
собой область науки, занимающуюся исследованием вирусов, их
происхождения, состава, строения, генетики, морфологии, механизмов
размножения, аспектов взаимоотношений с клеточными организмами, проблемами противовирусного иммунитета, патогенности вирусов, разработкой мер и средств предупреждения, диагностики и лечения вызываемых вирусами заболеваний. В диссертационной работе приведены результаты исследований по разработке методов диагностики МПВИ птиц на основе ПЦР и ИФА, их применению в лабораторной диагностике болезни, а также изучению биологических свойств изолятов МПВ птиц.
Результаты научного исследования соответствуют пунктам 6, 7, 8, 10 паспорта специальности.
Апробация результатов работы. Результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на VII Международном ветеринарном конгрессе по птицеводству (г. Москва, 2011 г.), VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная Диагностика-2010» (г. Москва, 2010 г.), Международных научно-практических конференциях молодых ученых «Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику» (г. Владимир, 2008 г. и 2010 г.), на заседаниях ученого совета ФГБУ ВНИИЗЖ в период с 2005 по 2010 гг.
Публикации научных исследований. По теме диссертационной работы опубликовано 8 научных статей, в том числе 1 статья в издании, рекомендованном ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.
Основные положения, выносимые на защиту. Методы ОТ-ПЦР (ген N) и ОТ-ПЦР-РВ (ген G) для выявления генома МПВ птиц подтипов А и В.
Результаты исследования проб патологического материала из птицеводческих хозяйств России и некоторых стран ближнего зарубежья в 2005-2010 гг. на наличие МПВ птиц.
Изучение биологических свойств изолята МПВ птиц подтипа В aMPV/B/02/2007 при экспериментальном заражении цыплят.
Анализ моноклональных антител на специфичность к МПВ птиц и
разработка с их использованием твердофазного непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для оценки активности антигена МПВ птиц, полученного в культуре клеток.
Результаты филогенетического анализа изолятов МПВ птиц по фрагментам генов G и N. Анализ полных последовательностей генов G, F и N семи полевых изолятов МПВ птиц, выделенных в трахеальной органной культуре в 2007-2010 гг.
1.10. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа
изложена на 140 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор
литературы, собственные исследования, результаты собственных исследований
и их обсуждение, заключение и выводы. Список литературы включает 12
отечественных и 177 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 27
таблицами и 23 рисунками.
Тропизм вируса и патологоанатомические изменения
Впервые болезнь, сопровождавшуюся воспалительными процессами в трахее, ринитами и синуситами у индеек, выявили в Южной Африке в 1978 г. [44]. Этиологический агент был впервые выделен и охарактеризован как пневмовирус в Великобритании [46, 62, 130, 151, 188]. Впоследствии случаи заболевания регистрировали во Франции [24, 180], Израиле [181], Марокко [173], Мексике [61], Бразилии [26], Испании, Венгрии, Италии [38], Германии [136], Зимбабве [28], Тайване [175], Японии [183], Южной Америке [114], Бразилии [26], Соединенных Штатах Америки [40, 150] и других странах. В некоторых случаях возбудитель заболевания выделить не удавалось, и о наличии Мl IВ у птиц судили по клиническим признакам и присутствию в крови вирусспецифических антител. Таким образом, в настоящее время область распространения МПВИ птиц охватывает большинство стран с развитым птицеводством за исключением Австралии [2, 55, 56].
Метапневмовирусной инфекции наиболее подвержены индейки и куры. У индеек МПВ птиц служит причиной заболевания, сходного по клиническим признакам с вызываемым Bordetella avium [114] и обозначаемого как ринотрахеит индеек (turkey rhinotracheitis, TRT). У кур МПВИ часто ассоциирована с так называемым «синдромом опухшей головы» («swollen head syndrome», SHS). Впервые данный синдром, характеризующийся опуханием инфраорбитальных синусов, респираторными нарушениями и апатией, был описан в начале 1980-х гг. в Южной Африке, при этом у цыплят выявляли вирусы ньюкаслской болезни, инфекционного бронхита и некоторые другие [133, 174]. В дальнейшем при развитии «синдрома опухшей головы» у цыплят часто обнаруживали антитела к МПВ птиц [20, 26, 45, 58, 102, 136, 142, 143]. В настоящее время установлено что данный синдром имеет полиэтиологическую природу и может быть вызван не только МПВ птиц, но и другими инфекционными агентами или их комбинациями [73, 133].
Термины ринотрахеит индеек и «синдром опухшей головы» некоторое время использовались совместно для обозначения заболевания, вызываемого МПВ птиц. Позднее было предложено использовать название ринотрахеит птиц (avian rhinotracheitis, ART) [114]. Однако в современной литературе и практике употребляют следующее название болезни - метапневмовирусная инфекция птиц.
Основным фактором распространения МПВИ внутри и между континентами, вероятнее всего, являются дикие птицы [56, 83, 168]. Показано, что к МПВИ восприимчивы пекинские утки, дикие гуси, фазаны, воробьи, скворцы, голуби, цесарки, голубокрылые чирки, страусы и некоторые другие виды птиц [28, 68, 89, 107, 110, 172]. Короткий период выделения вируса из организма птицы (в среднем 7-10 суток) не является препятствием для переноса возбудителя инфекции на дальние расстояния, поскольку птицы в стае могут находиться на различных стадиях заболевания [114]. Возможно бессимптомное течение МПВИ у диких птиц [39, 82], что также способствовует ее распространению без причинения особого вреда переносчикам вируса.
Особое значение проблема МПВИ птиц имеет для Соединенных Штатов Америки, где развито коммерческое разведение индеек. Впервые МПВ птиц был выделен в этой стране во время вспышки респираторного заболевания у индеек в штате Колорадо в 1996 г. [40, 121, 150]. Позднее инфекция распространилась в штаты Миннесота, Северная и Южная Дакота, Висконсин, Айова [83, 121]. Несмотря на соблюдение мер биологической безопасности, случаи МПВИ птиц в США продолжают регистрировать, причем большинство из них приходится на весну (апрель-май) и осень (октябрь-декабрь) [132]. 1.1.2. Патогенез
Патогенез инфекции характеризуется множеством параметров: клинические признаки, тропизм вируса и вызываемые им макро- и микроскопические поражения, особенности персистенции и выделения вируса, иммунный ответ организма хозяина и другие.
Метапневмовирусной инфекции подвержены птицы в любом возрасте, однако у бройлеров болезнь чаще проявляется в возрасте 2-6 недель, а у племенной птицы и кур-несушек - в начале яйцекладки [95, 102, 126]. Метапневмовирус птиц подтипа С поражает преимущественно индеек, хотя в экспериментальных условиях была показана возможность инфицирования кур [163]. Вирусы подтипов А и В могут инфицировать как индеек, так и кур.
Болезнь контагиозна и в течение короткого промежутка времени может охватить весь птичник. Передача МПВ птиц происходит при непосредственном контакте здоровой птицы с инфицированной, а также с контаминированными вирусом поверхностями, пищей, водой, подстилкой и т.п. Ограничение репродукции вируса преимущественно респираторным трактом предполагает воздушно-капельный способ распространения инфекции в качестве основного [180]. Вертикальный способ передачи МПВ птиц считается маловероятным [88 .
Инкубационный период болезни составляет обычно 4-7 суток, однако в ранее благополучных хозяйствах может быть значительно короче (от нескольких часов до суток) [101]. Аттенуированные и вирулентные штаммы МПВ репродуцируются в тканях верхнего респираторного тракта птиц в течение 7-Ю суток после инфицирования [51, 59]. Период клинического проявления болезни обычно не превышает 7-12 суток [37]. Однако полевые наблюдения свидетельствуют о возможности более длительной персистенции вируса в стадах индеек и кур [25].
Сыворотки и пероксидазные конъюгаты антител
Для культивирования гибридом применяли питательную среду RPMI 1640 («Sigma-Aldrich») с добавлением 5-10% СПК.
В питательные среды для культивирования клеток добавляли антибиотик-антимикотик производства «РАЛ Laboratories» (Австрия), представляющий собой 100-кратный концентрат смеси пенициллина (10000 и/мл), стрептомицина (10 мг/мл), амфотерицина В (25 мкг/мл).
Химические реагенты, растворы, буферные смеси. Для приготовления различных растворов использовали химические реактивы компаний «Promega», «Sigma-Aldrich», «Invitrogen» (США), а также отечественные реактивы категории не ниже х.ч.: натрий углекислый NaCCb; натрий углекислый кислый NaHCOs; натрий хлористый NaCl; кислота соляная НС1; трис-HCl; твин-20; кислота серная H2S04; додецилсульфат натрия (ДСН); перекись водорода; буфер для постановки ИФА Dilution buffer («Synbiotics»); бычий сывороточный альбумин (БСА) сухой; субстрат ТМБ однокомпонентный (3,3 ,5,5 -тетраметилбензидин); спирт этиловый 96%; минеральное масло; агароза; сахароза; бромистый этидий; бромфеноловый синий; глицерин; гуанидинтиоционат (ГТЦ); акриламид; N N -бис-метилен-акриламид; р-меркаптэтанол; глицин; маркер молекулярного веса белков Precision Plus Protein All Blue Standard («BioRad», США); ДНК-маркер Gene Ruler lOObp Plus DNA Ladder («Fermentas»); L-глютамин; хлороформ; СПК; З-амино-9-этилкарбазол; диметилсульфоксид (ДМСО) и др.
Буферы и растворы, использовавшиеся в работе: - фосфатно-буферный раствор ФБР (рН 7,3-7,4): 0,01 М Na2HP04, 0,15 MNaCl; - трис-боратный буфер ТБЕ: 0,1 М трис-HCl (рН 8,3), 0,083 М борная кислота, 0,001МEDTA; - 30% акриламид: 29,2 г акриламида, 0,8 г N N -бис-метилен акриламида доводили водой до 100 мл; - разделительная буферная смесь для полиакриламидного геля (ПААГ): 10 мл 1,5 М триса (рН 8,8), 0,4 мл 10% ДСН, 12,4 мл воды; - концентрирующая буферная смесь для ПААГ: 8 мл 0,5 М триса (рН 6,8), 0,3 мл 10% ДСН, 12 мл воды; - буфер для образцов в белковом форезе: 0,0625 М трис-HCl (рН 6,8), 2% ДСН, 5% Р-меркаптэтанола, 0,01% бромфенолового синего, 00% глицерина); - электродный буфер (5-кратный) для электрофореза белков: 15 г триса, 72 г глицина, 5 г ДСН доводили водой до 1000 мл; - буфер для переноса при иммуноблоттинге: 3,03 г триса, 14,4 г глицина, 200 мл этанола, доводили водой до 1000 мл; - карбонатно-бикарбонатный буфер 0,05 М (рН 9,5-9,6). Состоит из 3,18 г NaC03 и 5,88 г NaHC03, растворенных в 1000 мл дистиллированной воды. Карбонатно-бикарбонатный буфер (КББ) использовали для сенсибилизации планшетов. - буфер ТБС-Т (рН 7,4-7,6). Для его приготовления необходимы 2 раствора: (1) 293 г NaCl растворяли в 2000 мл дистиллированной воды. (2) 121,1 г трис-HCl растворяли в 800 мл дистиллированной воды, доводили рН до 7,4-7,6 с помощью концентрированной НС1, после чего добавляли дистиллированную воду до объема 1000 мл. Смешивали 80 мл раствора (1) и 50 мл раствора (2), доводили объем раствора дистиллированной водой до 1000 мл. Добавляли 1 мл твин-20. - блокирующий раствор для ИФА и иммуноцитохимического анализа: 1% раствор БСА в буфере ТБС-Т. - стоп-раствор для ИФА: 10% раствор серной кислоты; Все растворы готовили с использованием бидистиллированной воды после очистки в системе «Milli-Q» («Millipore», США).
Оборудование. В процессе выполнения работы использовали следующее оборудование: бокс ламинарный для культуральных работ с вертикальным потоком воздуха, 2 класс биозащиты; ПЦР-бокс; система для проведения ПЦР в режиме реального времени «Rotor-Gene 6000» («Corbett Research», Австралия); программируемый амплификатор «Терцик» («ДНК-технология») или аналогичный прибор другой фирмы; автоматический секвенатор ABI Prism 3100 («Applied Biosystems»); СО -инкубатор; микроскоп световой инвертированный; холодильник бытовой с температурными режимами 4С и минус 20С; низкотемпературные холодильники с температурными режимами минус 70С и минус 150С; насос вакуумный с емкостью для сбора жидкостей; спектрофотометр-ридер со светофильтром 450 нм; гельдокументирующая система «Gel Doc XR» («BioRad»); термостат для микропробирок, поддерживающий температуру 65С; микроцентрифуга, развивающая ускорение до 16000 g; СВЧ-печь; рН-метр любой конструкции; аппарат для горизонтального электрофореза; аппарат для вертикального электрофореза; трансиллюминатор для просмотра электрофореграмм фрагментов нуклеиновых кислот в ультрафиолетовом ИЗлуЧЄНИИ" ЛОЗЗ/ГСЮ ЛЛЯ с CD о ЛОГИЧЄСКИХ пИПЄТОК" доЗ1ТОиЫ ОДНОКСІНШІЬНЬІЄ и многокэл-тэ ггьньте с переменным объемом позволяющие отбирать объемы жидкости в пределах от 0 25 до 1000 мкл; камера Горяева; инструменты (пинцеты ножницы).
Расходные материалы. При выполнении работы использовали следующие материалы: наконечники одноразовые для дозаторов, рассчитанные на объем жидкости до 10, 200 и 1000 мкл; микропробирки полипропиленовые типа Eppendorf, объем 05, и 1,5 мл; микропробирки полипропиленовые для проведения ПЦР в режиме реального времени, объем 0.1 илл и02 млл пипетки ссрологические градуированные стерильные, ,обем 1, 5, 10 мл; криопробирки полипропиленовые разного объема; планшеты культуральные плоскодонные 6-, 24- и 96-луночные; планшеты полистироловые иммунологические плоскодонные 96-луночные MaxiSorp («Nunc», Дания); стекловолокнистые фильтры GF/F («Whatman», Великобритания); пробирки центрифужные разного объема; шприцы инъекционные однократного применения, объем 5 мл; шприцевые фильтрующие насадки Millex GP («Millipore») с размером пор 0,22 мкм; чашки Петри полистироловые стерильные, диаметр 100 мм; бритвенные лезвия. 2.1.13. Коммерческие наборы. Использовали следующие наборы: набор для выделения нуклеиновых кислот с сорбентом NucleoS+ (ООО «Биоком», г. Москва) и набор для выявления антител к МПВ птиц 8VANOVIR APV-Ab («ЗVANOVA», Швеция).
Культивирование гибридом in vitro
Изучены биологические свойства изолята aMPV/B/02/2007 МПВ птиц подтипа В, выделенного от цыплят-бройлеров одной из птицефабрик Калужской области. В данном хозяйстве у птиц в возрасте 20-30 суток наблюдали признаки респираторного заболевания, такие, как общее угнетенное состояние, чихание, хрипы, конъюнктивиты и синуситы.
Цыплят породы белый леггорн в возрасте 7 суток, свободных от антител к МПВ птиц, инфицировали изолятом aMPV/B/02/2007 интраназально, орально и на конъюнктиву в дозе 3,6 Ig ЦД50/мл на цыпленка. Через сутки к инфицированным цыплятам экспериментальной группы подсаживали неинфицированных цыплят контактной группы и содержали их вместе в течение 28 суток. Неинфицированных цыплят контрольной группы содержали отдельно.
У птиц экспериментальной и контактной групп отмечали развитие легких конъюнктивитов и ринитов (мутные пенистые выделения из НОСОВЫХ щелей при легком надавливании) через 3-6 суток после инфицирования. У цыплят обеих групп глазная щель была сужена. У птиц контрольной группы отклонений от нормы выявлено не было.
При воспроизведении МПВИ птиц в лабораторных условиях невозможно учесть все факторы, влияющие на развитие клинической картины у птиц в условиях птицефабрики. Встречающиеся в птицеводческих хозяйствах нарушения условий содержания птиц (температурного режима, влажности, воздухообмена), повышенная плотность посадки птиц способствуют распространению и усилению тяжести вызываемого МПВ птиц заболевания. Размножение вируса в клетках эпителия верхних отделов респираторного тракта птицы приводит к остановке их согласованного движения, направленного на механическое удаление из дыхательных путей попавших с воздухом потенциально опасных частиц (в том числе бактерий).
Выявление изолята МПВ птиц aMPV/В/02/2007 в оральных смывах цыплят контактной группы на 4 сутки демонстрирует возможность горизонтальной передачи вируса при совместном содержании инфицированных и здоровых птиц.
При патологоанатомическом вскрытии цыплят экспериментальной и контактной групп наблюдали точечные кровоизлияния на слизистых носовых полостей, отечность и геморрагические поражения конъюнктивы, скопление слизи в ротовой полости и трахее. У цыплят контактной группы патологические изменения появлялись позже, чем у экспериментально инфицированных цыплят. Изменений внутренних органов у цыплят контрольной группы отмечено не было.
Результаты выявления генома изолята вируса методом ОТ-ПЦР в пробах респираторных органов цыплят представлены в табл. 17. В пробах других внутренних органов (печени, почек, селезенки, кишечника, бурсы) вирус не был обнаружен. Полученные результаты соответствуют литературным данным, указывающим на тропизм вируса к тканям верхних дыхательных путей [37, 86, 114, 149, 177].
Вирусспецифические антитела выявляли в сыворотках птиц экспериментальной и контактной групп, начиная с 10 и 18 суток после инфицирования, соответственно. У цыплят контрольной группы антител к МПВ птиц выявлено не было.
Таким образом, в результате экспериментального заражения показана способность изолята aMPV/В/02/2007 МПВ птиц репродуцироваться в эпителии верхних дыхательных путей птиц, вызывать слабые респираторные признаки и специфический гуморальный иммунный ответ.
Использование моноклональных антител в твердофазном непрямом «сэндвич»-варианте ИФА для выявления антигена МПВ птиц
Культивирование полевых изолятов МПВ птиц в различных культурах клеток является перспективным направлением исследований, поскольку в дальнейшем они могут быть использованы в составе вакцинных препаратов и диагностических наборов. В связи с этим возникла необходимость в разработке метода оценки содержания специфического вирусного антигена в культуре клеток.
В настоящее время для этих целей используют метод определения инфекционной активности вируса, которым определяют количество вирусных частиц, способных вызывать ЦПД в чувствительной культуре клеток. При этом не учитывают наличие неинфекционных вирионов и отдельных белковых компонентов вируса, которые могут иметь значение в составе антигенного препарата для серологических реакций или инактивированной вакцины.
В связи с этим была поставлена задача разработать чувствительный и специфичный метод на основе твердофазного непрямого «сэндвич»-варианта иммуноферментного анализа (с-ИФА) для определения активности антигена МПВ птиц, полученного в культуре клеток. Поликлональные сыворотки могут содержать антитела к клеточным белкам, поэтому для разработки непрямого с-ИФА использовали мкАТ к МПВ птиц. 3.6.1. Характеристика моноклональных антител к МПВ птиц
Панель из 28 гибридом-продуцентов мкАТ была получена совместно с сотрудниками МНИИМЭ в 2009 г. с использованием штамма PV03-В МПВ птиц.
Первичные препараты мкАТ были получены в виде культуральных жидкостей. Из-за особенностей генотипа гибридомные клетки обладают низкой потенцией к росту при малых посевных концентрациях, например при клонировании методом лимитирующих разведений и непосредственно после вывода из криоконсервированного состояния. В этих случаях в качестве «питающих» или «фидерных» клеток использовали перитонеальные макрофаги мыши, которые обеспечивали гибридомы необходимыми факторами роста, а также фагоцитировали погибшие клетки. На рис. 12 представлены гибридомные клетки на разных стадиях роста: одиночные клетки (рис. 12 а), конгломераты клеток (клоны одной клетки) (рис. 12 б) и монослой из гибридом (рис. 12 в). Макрофаги мыши видны в виде клеток
Разработка твердофазного непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для выявления антигена МПВ птиц
В птицеводческих хозяйствах России у кур и индеек наблюдают клинические признаки, характерные для МПВИ. Данная болезнь широко распространена в странах с развитым промышленным птицеводством. В большинстве случаев течение заболевания осложняется вторичной микрофлорой {Escherichia coli, Mycoplasma sp., Pasteurella sp., Bordetella avium, Ornitobacterium rhinotracheale, вирусы инфекционного бронхита кур, герпеса индеек и другие), что увеличивает экономический ущерб.
Поскольку респираторные клинические признаки и патологоанатомические изменения при МПВИ птиц не являются специфичными только для данной болезни, основная роль в постановке диагноза принадлежит лабораторным методам. В ФГБУ «ВНИИЗЖ» с помощью ОТ-ПЦР (ген G) [25, 128] в 2001-2005 гг. геном МПВ птиц подтипов А и В выявили у птицепоголовья 12 хозяйств России. Однако филогенетические связи и другие характеристики изолятов вируса оставались малоизученными. В связи с этим перед нами стояла цель усовершенствовать диагностику МПВИ за счет разработки новых методов выявления МПВ птиц, а также выделения и изучения свойств изолятов вируса.
В результате проведенных исследований были разработаны методы ОТ-ПЦР (ген N) и ОТ-ПЦР-РВ (ген G). ОТ-ПЦР (ген N) предназначена для одновременного выявления генома МПВ птиц подтипов А и В. В качестве гена-мишени использовали наиболее консервативный ген N вируса, кодирующий нуклеопротеин. Также разработаны два метода ОТ-ПЦР-РВ (ген G) для выявления МПВ птиц подтипов А и В, соответственно. В качестве гена-мишени использовали высоковариабельный ген G, что позволило выбрать подтипоспецифические праймеры и TaqMan-зонды с наименьшей вероятностью перекрестных реакций. Специфичность разработанных методов ОТ-ПЦР (ген N) и ОТ-ПЦР-РВ (ген G) была продемонстрирована с использованием вакцинных штаммов и изолятов МПВ Ill птиц подтипов А и в, а также проб, содержащих другие инфекционные агенты птиц. Положительные результаты реакций получили только для проб, содержащих МПВ птиц. Аналитическая чувствительность методов ОТ-ПЦР (ген N) и ОТ-ПЦР-РВ (ген G), рассчитанная при использовании десятикратных разведений вируса с известными титрами инфекционной активности, составила 2,0±0,4 Ig ТЦД50/мл и 1,0±0,3 Ig ТЦД50/мл, соответственно.
С использованием различных методов в 2005-2010 гг. исследовано 965 проб патологического материала от птиц из 182 птицефабрик 50 регионов России и некоторых стран ближнего зарубежья. Геном МПВ птиц подтипа А выявили в 5 пробах от кур из 2 птицефабрик, расположенных в Костромской и Ленинградской областях. Геном МПВ птиц подтипа В выявили в 156 пробах от кур и индеек из 62 птицефабрик, расположенных в 31 регионе России, а также Украине и Беларуси. Пробы патологического материала от индеек исследовали также на наличие генома МПВ птиц подтипа С с помощью ОТ-ПЦР-РВ (ген SH), предложенной О. Guionie с соавт. [122]. Геном МПВ птиц подтипа С не выявили.
В случае одновременного выявления идентичных по последовательностям фрагментов генов G и N изолятов вируса в нескольких пробах патологического материала из одного хозяйства, их считали одним случаем выявления изолята МПВ птиц. Таким образом, в 2005-2010 гг. установлено 4 и 110 случаев выявления МПВ птиц подтипов А и В, соответственно.
Наиболее часто вирус выявляли у бройлеров в возрасте 20-40 суток. Большинство случаев выявления МПВ птиц ежегодно приходилось на периоды с февраля по апрель и с сентября по декабрь. Подобная сезонность описана для МПВИ птиц в США, где пики заболеваемости отмечали в апреле-мае и октябре-декабре [132]. В Израиле увеличение количества случаев выявления МПВ птиц отмечали в зимний период [42].
Таким образом, в результате наших исследований геном МПВ птиц ПОДтипов А и в был выявлен у поголовья 35% исследованных в 2005-2010 гг. птицеводческих хозяйств, установлено преобладание МПВ птиц подтипа В.
С использованием ТОК в 2007-2010 гг. получено 7 полевых изолятов МПВ птиц подтипа В, которые впоследствии были адаптированы к культурам клеток ФЭК и Vero. Для оценки содержания различных антигенов МПВ птиц, полученных в культуре клеток, был разработан метод твердофазного непрямого «сэндвич»-варианта ИФА с использованием моноклональных антител, обеспечивающих высокую специфичность метода.
Изучена специфичность мкАТ 28 гибридом, полученных совместно с сотрудниками МНИИМЭ в 2009 г. Моноклональные антитела гибридомы 13Е2 связывались с наибольшим количеством различных антигенов МПВ птиц и были выбраны в качестве улавливающих антител в непрямом с-ИФА. При исследовании антигенов МПВ птиц подтипов А и В в непрямом с-ИФА в качестве детекторных антител использовали гипериммунные поликлональные сыворотки крови кур с антителами к вирусу того же подтипа. Специфичность разработанного метода непрямого с-ИФА подтвердили с использованием гетерологичных антигенов, активность которых не превышала фоновый уровень. Значение чувствительности метода в отношении различных штаммов и изолятов МПВ птиц составило 4,0±0 3 Ig ТЦД50/МЛ. При исследовании антигенсодержащих образцов в нескольких повторностях отклонения в титрах не превышали величину одного 2-кратного разведения что свидетельствовало о воспроизводимости результатов непрямого с-ИФА. Разработанный метод непрямого с-ИФА использовали для оценки качества вируссодержащего сЫРЬЯ на различных этапах изготовления диагностических тест-систем
