Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Метапневмовирусная инфекция птиц 12
1.1.1. История изучения и распространения метапневмовируснои инфекции птиц 12
1.1.2. Характеристика и морфология метапневмовируса птиц 15
1.1.3. Устойчивость метапневмовируса птиц к физическим и химическим факторам 19
1.1.4. Клинические и патологоанатомические признаки метапневмовируснои инфекции птиц 20
1.1.5. Патогенность 22
1.1.6. Способы передачи инфекции 24
1.1.7. Метапневмовирус человека 25
1.1.8. Диагностика метапневмовируснои инфекции птиц 27 -
1.1.9. Меры профилактики и борьбы 32
1.2. Ньюкаслская болезнь птиц 36
1.3. Конструирование инактивированных противовирусных вакцин для птицеводства 45
1.4. Заключение по обзору литературы 51
2. Собственные исследования 53
2.1. Материалы и методы 53
2.1.1. Материалы исследований 53
2.1.2. Методы исследований 56
2.2. Результаты собственных исследований 66
2.2.1. Подбор штаммов вируса ньюкаслской болезни и метапневмовируса птиц для изготовления инактивированнои вакцины 66
2.2.1.1. Производственный штамм «PV03-B»
метапневмовирусной инфекции птиц : 69
2.2.2. Разработка оптимальной схемы получения вирусного сырья для изготовления инактивированной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц 72
2.2.3. Инактивация вируса ньюкаслской болезни и метапневмовируса птиц различными инактивантами 79
2.2.3.1. Изучение инактивирующего действия бета-пропиолактона на вирус ньюкаслской болезни 80
2.2.3.2. Изучение инактивирующего действия бета-пропиолактона на метапневмовирус птиц 82
2.2.4. Выбор оптимальной формы инактивированной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц 86
2.2.5. Определение оптимального компонентного состава вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц 89
2.2.5.1. Определение физических свойств инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц в зависимости от продолжительности её хранения 94
2.2.5.2. Определение иммуногенных свойств инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц в зависимости от продолжительности её хранения 99
2.2.6. Изучение динамики формирования антител к вирусам ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц после иммунизации инактивированной эмульсионной вакциной 100
2.2.7. Сравнение иммунобиологических свойств инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц с зарубежным аналогом 103
2.2.8. Изучение иммунобиологических свойств инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовируснои инфекции птиц в производственных
условиях 105
3. Обсуждение результатов исследований 110
4. Выводы 118
5. Практические предложения 119
6. Список литературы
- История изучения и распространения метапневмовируснои инфекции птиц
- Подбор штаммов вируса ньюкаслской болезни и метапневмовируса птиц для изготовления инактивированнои вакцины
- Определение оптимального компонентного состава вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц
- Изучение динамики формирования антител к вирусам ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц после иммунизации инактивированной эмульсионной вакциной
Введение к работе
Актуальность темы. Для обеспечения стойкого эпизоотического благополучия по инфекционным болезням птиц в промышленном птицеводстве наряду с общими ветеринарно-санитарными мероприятиями широко применяются различные комплексные- схемы специфической профилактики с использованием живых и инактивированных вакцинных препаратов.
В последнее десятилетие в Российской Федерации возросло количество случаев проявления новых инфекционных болезней (реовирусная инфекция, метапневмовирусная инфекция птиц, инфекционный энцефаломиелит, инфекционная анемия), которые ранее в стране не регистрировались, и специфическая профилактика против них не проводилась.
Сложившаяся ситуация требует применения новых подходов к созданию противовирусных препаратов, в частности, перспективным является разработка ассоциированных инактивированных вакцин в различных комбинациях.
Несмотря на широкое использование средств специфической профилактики и карантинных мероприятий по ньюкаслской болезни, проблема борьбы с этим особо опасным заболеванием птиц остается весьма актуальной во всем мире. В 2007 г., по данным МЭБ, в мире было зарегистрировано более 2000 неблагополучных пунктов по ньюкаслской болезни [288]. В последнее время в Российской Федерации отмечена тенденция к увеличению числа неблагополучных пунктов, которые в основном регистрируются в личных подворьях, где не проводилась специфическая профилактика НБ.
Серьезную угрозу для птицеводческой отрасли страны представляет метапневмовирусная инфекция птиц, которая проявляется в основном на курах и индейках и наносит серьезный экономический ущерб, который складывается за счет гибели птиц, потерь мясной и яичной продуктивности, затрат на проведение ветеринарно-санитарных мероприятий.
Случаи возникновения метапневмовирусной инфекции птиц отмечены на птицефабриках многих административно-географических регионов Российской Федерации [24, 31], и можно говорить о практически повсеместном распространении данной болезни [46, 68, 73, 95, 172, 173, 186,203,215,259,264].
Для специфической профилактики МПВИ птиц за рубежом разработаны и применяются живые и инактивированные вакцинные препараты [40, 60, 108, 160, 164, 229, 286].
В настоящее время в Российской Федерации для иммунизации птиц против МПВИ применяют импортные препараты и экспериментальную инактивированную эмульсионную вакцину против МПВИ птиц производства ФГУ«ВНИИЗЖ»[12].
Необходимость в создании инактивированной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц возникла в результате следующих причин:
отсутствие отечественных вакцинных препаратов против НБ и МПВИ птиц;
широкое распространение в птицехозяйствах Российской Федерации метапневмовирусной инфекции птиц;
- потребность в вакцинном препарате, не содержащем в своем
составе инфекционного вируса;
- сокращение количества прививок с целью уменьшения стрессов и
нагрузки на иммунную систему ремонтного молодняка.
Таким образом, разработка технологии изготовления и контроля инактивированной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц является актуальной и требует своего решения.
Цель и задачи исследований. Главной целью исследований являлась разработка технологии изготовления и контроля инактивированной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц и изучение её иммунобиологических характеристик.
9 Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
подобрать производственные штаммы вируса НБ и метапневмовируса (МПВ);
выбрать оптимальные системы культивирования
производственных штаммов вируса НБ и МПВ;
отработать методики инактивации инфекционных свойств вируса НБ и МПВ с использованием различныхинактивантов;
выбрать адъюванты, обеспечивающие повышение иммуногенных свойств вакцины против НБ и МПВИ птиц;
определить оптимальный иммунобиологически
сбалансированный компонентный состав инактивированной вакцины против НБ и МПВИ птиц;
изучить физические и иммунобиологические свойства разработанной вакцины против НБ и МПВИ птиц в лабораторных и производственных условиях;
разработать нормативную документацию на инактивированную эмульсионную вакцину против НБ и МПВИ птиц.
Научная новизна. Впервые разработана отечественная инактивированная эмульсионная вакцина против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц, отработаны технология её изготовления и методы биологического контроля.
Проведено выделение, изучение, паспортизация и депонирование во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (ФГУ «ВГНКИ», г. Москва), штамма «PV03-B №127 ДЕП» метапневмовируса птиц.
Разработана оптимальная схема получения вирусного сырья из штамма «PV03-B» метапневмовируса птиц с использованием перевиваемой культуры клеток почки зеленой мартышки Vero.
Обоснованы режимы инактивации вирусов НБ и МПВИ птиц бета-пропиолактоном. Изучена динамика инактивации вируса НБ и МПВ.
Подобран и научно обоснован компонентный состав инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц.
В ходе исследований определены оптимальные соотношения антигенов, адъювантов, входящих в состав инактивированных вакцин против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц, дозы и схемы применения препаратов. Доказана безвредность, умеренная реактогенность и высокая иммуногенность инактивированных эмульсионной и сорбированной вакцин при их применении на птицефабриках.
Изучены в лабораторных и производственных условиях физические и иммунобиологические свойства инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц.
Практическая значимость работы. На основании собственных исследований, а также обобщения данных литературы, в соавторстве разработаны и утверждены в установленном порядке следующие методики:
«Методика культивирования и титрования метапневмовируса птиц в перевиваемой культуре клеток Vero»;
«Методика инактивации метапневмовируса птиц бета-пропиолактоном», которая позволяет сократить время инактивации по сравнению с традиционными технологиями в 2 раза.
Полученные результаты послужили основанием для разработки технологии производства и подготовки нормативной документации на вакцину против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц инактивированную эмульгированную, которая одобрена на заседании ученого совета ФГУ «ВНИИЗЖ» (протокол №1 от 08.02.2008 г.):
«Стандарт организации на вакцину против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц инактивированную эмульгированную (СТО 00495527-0094-2008)»;
«Промышленный регламент на производство вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц инактивированной эмульгированной»;
- «Инструкция по применению вакцины против ньюкаслской болезни
и метапневмовирусной инфекции птиц инактивированной
эмульгированной».
На основании проведенных исследований в ветеринарную практику для - специфической профилактики ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц предложена инактивированная эмульсионная вакцина, которая с 2006 г. проходит процедуру внедрения в птицеводческих хозяйствах РФ-. В период с 2006 г. по 2008 г. выпущено и применено около 18 млн. доз вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц инактивированной эмульсионной.
Практическая ценность разработанного препарата подтверждается положительными результатами широких производственных испытаний.
Основные положения диссертационной работы, выносимые на
защиту: /
- производственный штамм «PV03-B» метапневмовируса птиц,
полученный путем адаптации полевого изолята к системе культивирования
в перевиваемой культуре клеток Vero;
- оптимальная схема получения вирусного сырья для изготовления инактивированной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц;
инактивация вируса ньюкаслской болезни и метапневмовируса птиц бета-пропиолактоном;
компонентный состав инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц;
технология изготовления и методы контроля инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц;
физические и иммунобиологические характеристики инактивированной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц в лабораторных и производственных условиях.
12 Апробация результатов работы. Основные материалы диссертации были доложены и обсуждены на международной научно-практической конференции молодых ученых «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику», посвященной 50-летию ФГУ «ВНИИЗЖ» (г. Владимир, 2008 г.), а также на заседаниях ученого совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2005-2008 гг.
Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена
автором самостоятельно. Отдельные этапы выполнены совместно с Сарбасовым А.Б., Герасимовой Н.И., Волковой М.А., Хлебовец З.Б., Прониным А.С., за что автор выражает им сердечную благодарность.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 2 работы в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 167 листах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, выводов и практических предложений,
содержит 14 таблиц и 9 рисунков. Список использованной литературы включает 290 наименований, из них 38 отечественных и 252 зарубежных. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих достоверность результатов работы, её научную и практическую значимость.
Место выполнения работы. Исследования по диссертационной работе выполнены в 2004-2008 гг. в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».
История изучения и распространения метапневмовируснои инфекции птиц
Метапневмовирусная инфекция птиц - вирусное респираторное заболевание, характеризующееся воспалительными процессами верхних дыхательных путей, инфраорбитальных синусов, сопровождается затрудненным дыханием, чиханием, хрипами, назальными выделениями [72,131,172,264]. МПВИ птиц - это общее название двух сходных по клиническим признакам респираторных синдромов, которые наблюдаются у разных видов птицы; у индеек - ринотрахеит (turkey rhinotracheitis - TRT); у кур и цыплят - синдром опухшей головы (swollen head syndrome - SHS). Эта болезнь верхних дыхательных путей, птиц, чаще называемая пневмовирусом птиц (avian pneumovirus - APV) недавно переименована в метапневмовирусную инфекцию птиц (avian metapneumovirus - AMPV) [73, 264].
Метапневмовирус птиц и метапневмовирус человека (HMPV) [43, 197] являются представителями семейства Paramyxoviridae и были классифицированы как типичные виды рода Metapneumovirus подсемейства Pneumovirinae [172, 196, 197, 212, 264]. Все существующие штаммы МПВ были классифицированы на 4 подтипа (А, В, С, D) [98, 101, 103, 115, 197, 208, 218]. Подтип С доминирует в США, в то время как подтипы А, В и D обнаруживают главным образом в Европе [103, 226].
Вирусная этиология МПВИ птиц была установлена в 1985 г. [53]. Метапневмовирусная инфекция обычно осложняется вторичной бактериальной микрофлорой и проявляется высокой заболеваемостью и смертностью.
В ряде стран с конца 60-х годов прошлого столетия были обнаружены случаи заболевания птиц, совокупность симптомов которых неотличима от состояния, которое в настоящее время связывают с метапневмовирусной инфекцией птиц [186]. Вирус вызывает инфекцию верхних дыхательных путей у индеек и кур всех возрастов и, как показывают серологические исследования, он распространён по всему миру [173] и регистрируется во многих европейских странах с развитым птицеводством [73, 215]. Этот вирус был выделен у индеек и кур во Франции [285], Великобритании [44, 67, 96, 259, 227], Италии, Испании, Венгрии [186], Германии [147], Нидерландах [46], Бразилии [68, 106], Японии [47, 275] Марокко, Тайване,
Израиле [76, 263, 272] и в Южной Америке [173]. В конце 70-х годов метапневмовирус птиц был выделен от индеек в Южной Африке [95,185].
В настоящее время клиническое заболевание метапневмовирусом птиц регистрируется как в благополучных, так и в переболевших и вакцинированных стадах. Это вызывает вопросы по поводу типирования метапневмовирусов птиц и эффективности использования вакцин в плане защиты от этих подтипов [82, 101].
В 1985 г. в Англии наблюдали острое высококонтагиозное заболевание верхних дыхательных путей у индеек [62, 259], причиной которого оказался метапневмовирус. В это же время была зарегистрирована неизвестная болезнь у бройлеров с похожими клиническими признаками, которую назвали синдромом опухшей головы. Во всех случаях удавалось изолировать пневмотропный парамиксовирус, который был идентифицирован. В 1990-1992 гг. болезнь была обнаружена в ряде стран Азиатско-Тихоокеанского региона [264, 275]. В США в 1996 г. сообщалось о, заболевании МПВИ индеек в штате Миннесота [252]. Впервые в США был зарегистрирован вирус типа С, который по структуре отличается от подтипов А и В, вызывающих пневмовирусную инфекцию в остальном мире. Метапневмовирус птиц был выделен в 1997 г. при вспышке респираторного заболевания в штате Колорадо [52, 211, 224], которая продолжалась только 10 мес, до искоренения путем поголовного убоя и применения строгих мер биобезопасности [72, 119, 145].
Колорадский изолят антигенно [224] и генетически отличается от европейских изолятов [107, 246].
Вспышки метапневмовирусной инфекции птиц в США продолжают регистрироваться чаще всего среди индеек, главным образом в штате Миннесота, где ежегодно инфицируется от 36,3 до 54,8% коммерческих стад индеек, и экономические потери от МПВИ составляют около 15 млн. долларов в год [73, 252]. Вспышки заболевания вызываемые МПВИ птиц были зарегистрированы в 2004 г. в штатах Висконсин, Айова, Северная Дакота и Огайо [264].
В России заболевание регистрировали на протяжении последних лет (1995-2007 гг.). Отмечены случаи возникновения метапневмовирусной инфекции птиц на птицефабриках многих административно-географических регионов Российской Федерации.
Метапневмовирусная инфекция птиц в РФ чаще всего встречается в бройлерных хозяйствах, преимущественно у кур родительских стад. Отмечается тенденция к увеличению случаев обнаружения антител к метапневмовирусу птиц у птиц яичных пород, причём обычно без клинического проявления [24].
В 2002 г. в ФГУ «ВНИИЗЖ» методом ИФА было исследовано 5193 пробы сывороток крови от разных возрастных групп птиц мясных и яичных кроссов, доставленных из 119 птицехозяйств, расположенных в 42 территориально-административных регионах РФ [31].
При изучении антигенной изменчивости установлено, что выделенные из разных географических мест изоляты МПВ могут иметь заметные различия в серологических реакциях [65, 142, 162, 167].
Подбор штаммов вируса ньюкаслской болезни и метапневмовируса птиц для изготовления инактивированнои вакцины
В связи с этим была поставлена задача выбора производственных штаммов вируса ньюкаслской болезни и метапневмовируса птиц и систем их культивирования, оптимально подходящих для изготовления инактивированной вакцины, обеспечивающей выработку напряженного и продолжительного иммунитета у привитых птиц. При выборе производственного штамма для изготовления инактивированной вакцины основные цели, которыми должен руководствоваться исследователь это высокая иммуногенная . активность и эпизоотическая специфичность штамма-претендента.
В качестве производственного штамма вируса ньюкаслской болезни наш выбор был остановлен на штамме «Ла-Сота», который многими исследователями признан по своим биологическим и антигенным свойствам наиболее пригодным [4,11,14,19].
Выбор производственного штамма метапневмовируса птиц был осложнен тем, что на данный момент в мире встречаются 4 подтипа метапневмовируса птиц (А, В, С, D). Метапневмовирус птиц подтипа D отмечался только во Франции, подтип С регистрировали в США. Наибольшее распространение имеют подтипы А и В, которые встречаются среди птиц повсеместно (Европа, Африка, Азия, Америка).
Перекрестный иммунитет между различными подтипами не является достаточно эффективным или может отсутствовать.
Поэтому выбор производственного штамма должен основываться на исследованиях распространенности метапневмовируснои инфекции птиц в Российской Федерации, а также принадлежности вызывающего её вируса к тому или иному подтипу.
Нами была проведена исследовательская работа по выявлению и типированию метапневмовируса птиц в Российской Федерации.1
Лабораторная диагностика метапневмовируснои инфекции птиц включала обнаружение генома вируса методом обратной транскрипции полимеразной цепной реакции, выделение вируса и регистрацию - вирусспецифических антител в крови птиц.
За период 2005-2006 гг. на наличие метапневмовируса птиц методом ОТ-ПЦР в ФГУ «ВНИИЗЖ» было исследовано 160 проб из 64 птицеводческих хозяйств различных регионов РФ. Пробы отбирали у птиц с признаками респираторного заболевания, сходными с проявлениями метапневмовирусной инфекции птиц. Применяемая в ФГУ «ВНИИЗЖ» методика постановки ОТ-ПЦР» позволяет выявлять и дифференцировать четыре известные в мире подтипа метапневмовируса (А, В, С, D). Присутствие МПВ подтипа А было подтверждено в материале из одной птицефабрики (Костромская область, 2005 г.), МПВ подтипа В был выявлен в пробах из 10 птицефабрик 8 регионов РФ (Московская, Владимирская, Ростовская, Орловская, Липецкая, Тульская, Ульяновская области, Краснодарский край). В материалах, поступавших из 3 хозяйств (Московская и Орловская обл.) в разное время, вирус удавалось выявить неоднократно.
На основании полученных результатов был сделан вывод о преобладании на территории Российской Федерации метапневмовируса птиц подтипа В. При исследовании распространенности метапневмовируса птиц на птицефабриках следует учитывать характерные для него короткий период вирусовыделения (6-8 сут.) и накопление в тканях в достаточно низком титре. Это значительно осложняет процесс выявления новых изолятов вируса и характеристики их биологических свойств. Однако даже с учетом этих факторов подтверждение наличия метапневмовирусов птиц методом ОТ-ПЦР в пробах из 17% всех исследованных птицефабрик за 2005-2006 гг., а также повторное выявление вируса на некоторых из них через значительные промежутки времени свидетельствует о сохранении проблемы данной инфекции.
По результатам секвенирования гена G выявленных метапневмовирусов птиц подтипа В и их сравнительного анализа была установлена высокая степень идентичности их нуклеотидных последовательностей (в среднем 98-99%). Литературные источники также указывают на высокую гомологию метапневмовирусов внутри подтипа [13, 103].
В эксперименте по изучению перекрестного иммунитета с использованием двух разновидностей ИФА (на основе подтипа А и на основе подтипа В) было показано, что подтип В, доминирующий на территории Российской Федерации, обеспечивает высокий иммунный ответ к антигенам подтипов А и В.
Таким образом, для изготовления инактивированной вакцины против НБ и МПВИ птиц с целью дальнейшего применения в Российской Федерации целесообразно использовать штаммы подтипа В метапневмовируса.
В 2003 г. в ФГУ «ВНИИЗЖ» из патологического материала, полученного от больных цыплят-бройлеров 25-сут. возраста птицефабрики ЗАО «Юрьевецкая» Владимирской области, был выделен полевой изолят метапневмовируса птиц, который адаптировали к размножению в первичных и перевиваемых культурах клеток.
После проведения молекулярно-биологических исследований (ПЦР с последующим секвенированием) и постановки реакции нейтрализации со специфической и эталонной сыворотками к метапневмовирусу птиц было сделано заключение о принадлежности изолята к семейству Paramyxovindae, роду Metapneumovirus, подтипу В. Полученному штамму дано название «PV03-B», и в 2006 г. он был депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (ФГУ «ВГНКИ», г. Москва) под регистрационным номером - штамм «PV03-B №127 ДЕП» метапневмовируса птиц [приложение №1-2].
Определение оптимального компонентного состава вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц
При конструировании инактивированной эмульсионной вакцины против НБ и МПВИ птиц была поставлена задача по определению оптимального соотношения вирусных антигенов в препарате. В большинстве случаев в птицеводстве инактивированные вакцины применяют в прививном объеме 0,5 см3. В соответствии с принятой технологией изготовления инактивированных эмульсионных препаратов максимальное содержание антигенов в дозе вакцины составляет 30%, или 0,15 см3.
При изучении инактивации вируса НБ и МПВ в эксперименте на восприимчивых цыплятах была установлена более высокая иммуногенная активность образцов вакцины с соотношением антигенов НБ и МПВИ птиц 30:70, которое в дальнейшем считали оптимальным (см. табл. 6).
Однако, учитывая то, что при культивировании вирусов возможно получение вирусного сырья с различной инфекционной активностью, было принято решение о постановке опытов по изучению иммуногенной активности образцов вакцины, содержащих в прививном объеме антигены с различной инфекционной активностью до инактивации.
Сначала были изготовлены 3 образца инактивированной вакцины против метапневмовирусной инфекции птиц. Инфекционная активность метапневмовируса птиц до инактивации была равна 7,0+0,3 Ід ТЦД5о/см3.
Вирусный материал до инактивации был разведен физиологическим раствором с таким расчетом, что инфекционная активность образцов антигенов была равна 6,5 и 6,0 Ід ТЦД5о/см3. После инактивации бета-пропиолактоном все вирусные антигены с различной активностью (7,0; 6,5 и _ 6,0 lg ТЦД50/см3) развели ФР в соотношении 70:30, объединили с масляным адъювантом Монтанид ИЗА 70 и эмульгировали в гомогенизаторе.
Разведения вирусного антигена были сделаны с таким расчетом, что в прививном объеме первого образца содержалось около 6,0 lg ТЦД50, второго - 5,5 lg ТЦД50 и третьего - 5,0 lg ТЦД50 в пересчете на нативный вирус.
Аналогичные действия были проведены с вирусом ньюкаслской болезни, который до инактивации имел титр инфекционной активности, равный 10,0±0,4 lg ЭИД5о/см3 Разведения физиологическим раствором были проведены так, что инфекционная активность полученных образцов была равна 9,0 и 8,0 lg ЭИД5о/см3 После процедуры инактивации вирусные антигены с различной активностью (10; 9 и 8 lg ЭИД5о/см3) развели ФР в соотношении вируса к ФР 30:70, объединили с масляным адъювантом Монтанид ИЗА 70 и эмульгировали в гомогенизаторе. Таким образом, изготовили 3 образца инактивированной моновакцины против НБ. В прививномj объеме первого образца содержалось 8,6, второго - 7,6 и третьего - 6,6 lg ЭИД50, соответственно.
После изготовления экспериментальных образцов моновакцин провели сравнительную проверку их иммуногенной активности на серонегативных цыплятах 60-сут. возраста кросса «Хайсекс коричневый», которым препарат вводили внутримышечно в область груди в прививном объеме 0,5 см3. Каждым образцом вакцины было привито 20 голов, в контрольной невакцинированной группе было 10 цыплят. Отбор проб крови для получения сывороток проводили перед вакцинацией и через 28 и 56 сут. после неё.
Результаты сравнительных испытаний иммуногенной активности образцов инактивированных эмульсионных моновакцин против НБ и МПВИ птиц с различной инфекционной активностью до инактивации представлены в табл. 8, которые свидетельствуют о том, что уровень титров антител после прививки образцами инактивированных моновакцин против НБ и МПВИ птиц имеет прямую -зависимость от инфекционной активности используемого вирусного сырья.
При моделировании процентного соотношения вирусных антигенов НБ и МПВ в водной фазе как 30:70 установлено, что для изготовления эмульсионной вакцины против НБ и МПВИ птиц необходимо использовать вирусный антиген ньюкаслскои болезни с инфекционной активностью до инактивации не ниже 9,0 lg ЭИД5о/см3, а вирусный антиген метапневмовируса - не ниже 6,5 lg ТЦД5о/см3. При использовании вирусного сырья НБ с инфекционной активностью 8,0 lg ЭИД50/см3 у привитых птиц в крови обнаруживали гуморальные антитела в титрах, достаточных для защиты от заражения полевым вирусом, но их будет недостаточно для защиты на весь период эксплуатации кур-несушек, что потребует ревакцинации.
Использование для изготовления моновакцины вирусного сырья МПВИ птиц с инфекционной активностью до инактивации 6,0 Ід ТЦД5о/см3, обеспечило выработку иммунитета только у 60% привитых птиц с самым низким показателем среднего процента блокирования антител, который по истечении 8 недель после прививки был равен 44,9 с диапазоном положительных результатов от 40,6 до 62,2.
Одновременно с исследованиями по определению иммуногенной активности монопрепаратов из того же вирусного сырья были изготовлены 3 лабораторных образца инактивированнои эмульсионной вакцины против НБ и МПВИ птиц с процентным соотношением антигенов 30:70 в водной фазе.
В экспериментах по определению иммуногенной активности лабораторных образцов инактивированнои эмульсионной вакцины против НБ и МПВИ птиц использовали серонегативных цыплят 60-сут. возраста яичного кросса «Хайсекс коричневый». Подопытные группы состояли из 20 голов, которым образцы вакцины вводили внутримышечно в область груди в дозе 0,5 см3. В качестве контроля взяли 10 серонегативных невакцинированных птиц.
Через 28 и 56 сут. после прививки у вакцинированных и контрольных цыплят проводили взятие проб крови, получали сыворотки и исследовали в РТГА (выявляли антигемагглютинины к вирусу НБ) и ИФА (наличие антител к метапневмовирусу птиц).
Изучение динамики формирования антител к вирусам ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц после иммунизации инактивированной эмульсионной вакциной
В опыте использовали цыплят яичного кросса «Хайсекс коричневый» в возрасте 50 сут., серонегативных к возбудителям ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц.
Формировали 3 группы цыплят по 10 голов в каждой. Птиц первой группы прививали образцом инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц однократно в грудную мышцу в прививном объеме 0,5 см3. Птиц второй группы вакцинировали двукратно с интервалом 28 сут. в прививном объеме 0,5 см3 в грудную мышцу. Цыплят контрольной группы не прививали и содержали в одном помещении с цыплятами подопытных групп. Для получения сывороток проводили взятие крови у цыплят из подкрыльцовой вены с интервалом в 7 сут. в течение 56 сут. при однократной иммунизации и в течение 21 сут. при двукратной прививке. Сыворотки крови, полученные от цыплят до и после вакцинации, и сыворотки крови от птиц контрольной, группы исследовали на наличие антител к метапневмовирусной инфекции методом блокирующего иммуноферментного анализа с использованием наборов фирмы «Svanova» (Швеция), а наличие антигемагглютининов определяли в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), которую ставили общепринятым методом [7, 21, 92, 103, 111, 277]. Интерпретацию результатов исследований проводили в соответствии с рекомендациями изготовителя диагностического набора и наставлениям по применению вакцины.
Динамика накопления антител к вирусам ньюкаслскои болезни и метапневмовируснои инфекции птиц после однократной и двукратной иммунизации цыплят инактивированной эмульсионной вакциной представлена в табл. 12 и 13.
Исследованиями установлено, что инактивированная эмульсионная вакцина против ньюкаслскои болезни и метапневмовируснои инфекции птиц индуцировала у однократно привитых птиц формирование высокого уровня гуморального иммунитета к вирусу нькжаслской болезни (9,55±0,44 лог2) уже через 14 сут. после вакцинации. При дальнейшем исследовании в более поздние сроки концентрация антигемагглютининов в крови повысилась: до 10,25+1,70 лог2 через 42 сут. после прививки и до 10,40±0,78 лог2 через 56 сут. (срок наблюдения). Повторное введение препарата через 28 сут. после первой иммунизации не привело к приросту титров антител к вирусу нькжаслской болезни :
Так, значение титра антител к вирусу НБ через 21 сут. после двукратной иммунизации составило 10,00±0,56 лог2. Возможно, что двукратное применение инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовируснои инфекции птиц может быть эффективно в плане продолжительности иммунитета у птиц к данным заболеваниям.
Динамика формирования поствакцинального иммунитета к метапневмовируснои инфекции птиц после прививки инактивированной вакциной против ньюкаслской болезни и метапневмовируснои инфекции птиц представлена в табл. 13.
По результатам исследования методом ИФА были вычислены проценты блокирования антител против метапневмовируснои инфекции птиц, которые явились показателями уровня антител в крови.
Серологические исследования методом ИФА показали, что антитела к метапневмовируснои инфекции птиц начали регистрироваться в защитных титрах так же, как и при ньюкаслской болезни, т.е. через 14 сут. после прививки (средний процент блокирования антител - 46,6%). В дальнейшие сроки наблюдения этот показатель возрос до значений 69,5-72,8%. После сероконверсии к МПВ также не обнаружено.
