Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 12
2.1. Общие сведения о респираторном микоплазмозе и инфекционном синовите 12
2.2. Общая характеристика возбудителей респираторного микоплазмоза и инфекционного синовита 14
2.2.1.Таксономическое положение Мги Мс 14
2.2.2.Морфология колоний и структурно-химический состав 14
2.2.3.Резистентность к физико-химическим воздействиям 15
2.2.4.Антигенная активность Мги Мс 16
2.2.5.Геммаглютинирущая активность Мги Мс 17
2.2.6.Патогенность Мги Мс 18
2.3. Патогенез и патоморфологические изменения 20
2.4. Эпизоотологические данные 21
2.5. Иммунитет, лечение и профилактика 23
2.6. Диагностика респираторного микоплазмоза и инфекционного синовита 25
2.6.1.Обнаружение антигенов Мги Мс 25
2.6.2,Обнаружение антител к Мги Мс 28
2.7. Иммуноферментный анализ 30
2.7.1.Сущность иммуноферментного анализа 30
2.7.2.ИФА для обнаружения антигенов 31
2.7.3.ИФА для обнаружения антител 32
2.7.4.Применение ИФА для выявления микоплазменных антител 34
2.8. Заключение по обзору литературы 36
3. Собственные исследования 38
3.1. Материалы и методы 38
3.1.1.Материалы 38
3.1.2.Методы 41
3.2. Результаты собственных исследований 46
3.2.1.Получение очищенных и концентрированных препаратов антигенов Мг и Мс 46
3.2.2.Разработка тест-систем для выявления и определения активности антигенов Мгв культуральном сырье 53
3.2.2.1.Разработка тест-системы на основе непрямого «сэндвич»-варианта иммуноферментного анализа 54
3.2.2.2. Сравнительная оценка «сэндвич»-варианта ИФА иРГА 57
3.2.2.3. Разработка тест-системы на основе непрямого блокирующего варианта иммуноферментного анализа 59
3.2.2.4. Сравнительная оценка блокирующего варианта ИФА и реакции геммагглютинации 61
3.2.3. Разработка тест-систем для определения антител к Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae на основе непрямого варианта иммуноферментного анализа 65
3.2.4. Применение наборов на основе разработанных тест-систем для определения антител кМги Мс 78
3.2.4.1 .Выявление антител к Мг и Мс в ИФА при контроле вакцинных препаратов 78
3.2.4.2.Изучение гуморального иммунитета к Мг и Мс с применением базовых реакций РА, РТГА и разработанных « тест-систем 80
3.2.5. Изучение эпизоотической ситуации по респираторному микоплазмозу и инфекционному синовиту на птицефабриках Российской Федерации в 1996-2003 годах по данным серологического мониторинга с применением наборов ИФА 82
Обсуждение 89
Выводы 98
Практические предложения 99
Список литературы 101
Приложения 114
- Общая характеристика возбудителей респираторного микоплазмоза и инфекционного синовита
- Патогенез и патоморфологические изменения
- Диагностика респираторного микоплазмоза и инфекционного синовита
- Разработка тест-систем для определения антител к Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae на основе непрямого варианта иммуноферментного анализа
Введение к работе
Актуальность темы. Респираторный микоплазмоз и микоплазмозный синовит - инфекционные заболевания кур и индеек, характеризующиеся поражением органов и суставов, вызываемые Mycoplasma gallisepticum (Mr) и Mycoplasma synoviae (Mc), соответственно [ , ].
Впервые микоплазмозы были зарегистрированы в г. в США (Nelson J.), а впоследствии - во всех странах с развитым птицеводством, что связывают с крупномасштабной индустриализацией птицеводства, увеличивающимся экспортом и импортом птицы [ , , ]. Экономический ущерб от этих заболеваний складывается из потерь от гибели эмбрионов и цыплят, снижения массы тела птицы, яйценоскости, оплодотворяемости яиц, выводимости цыплят. Кроме того, микоплазмы обладают выраженным супрессирую-щим влиянием на иммунную систему организма и осложняют течение многих вирусных и бактериальных инфекций [ , ].
Отсутствие должного внимания к микоплазмозам на фоне бурного развития птицеводства и создания новых систем содержания птицы привело к широкому распространению этих инфекций в течении последних лет.
В настоящее время в большинстве крупнейших птицеводческих хозяйств разрабатываются программы мероприятий, направленных на улучшение ситуации по заболеваниям, вызываемым микоплазмами. Важная роль при контроле этих заболеваний уделяется своевременной и качественной диагностике. Трудности в выделении и серологической идентификации Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae ввиду большой изменчивости вирулентности и антигенных свойств их штаммов, а также атипичное, зачастую хроническое течение заболеваний, осложняет эту задачу [ ].
Поэтому окончательный диагноз устанавливают на основе лабораторного исследования, включающего традиционные методы ранней и ретроспективной диагностики, к которым относятся: реакция агглютинации (РА), реакция торможения геммагглютинации (РТГА), реакция связывания комплемента (РСК), реакция задержки роста (РЗР) [ , ]. Однако при всех своих преимуществах (простота постановки и непродолжительность по времени, достаточно высокая чувствительность и специфичность), они отличаются субъек тивностью оценки, часто дают ложноположительные результаты. Использование таких современных методов, как полимеразная цепная реакция (ПЦР) для массовых исследований ограничено высокой стоимостью оборудования и компонентов.
Поэтому в настоящее время широкое распространение получил ИФА, как высокочувствительный и специфичный метод [ , ]. Быстрота получения, воспроизводимость и автоматизированный учет результатов реакции, возможность стандартизации условий постановки анализа делают этот метод наиболее эффективным, удобным, экономичным и выгодным для массовых серологических исследований. Многими зарубежными коммерческими фирмами (KPL, IDEEX, BioChek и др.) предложены тест-системы на основе непрямого ИФА для определения антител к Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae в сывортках крови в одном разведении пробы [ ]. Но массовое применение этих наборов ограничено высокой стоимостью. Поэтому отечественная ветеринарная практика заинтересована в создании качественных и доступных по цене наборов для выявления антител к микоплазмам им-муноферментным методом. Для этого необходимо проводить исследования по разработке и испытанию диагностических наборов для выявления антител как к Mycoplasma gallisepticum так и к Mycoplasma synoviae.
Для профилактики микоплазмозов используют иммунизацию птицы живыми и инактивированными вакцинами и антибиотикотерапию. При этом для оценки активности вакцинного сырья используют реакцию геммагглютинации (РГА). При всех своих преимуществах (простота в исполнении, низкая стоимость) РГА не обладает специфичностью по отношению к другим гемагглюти-нирующим вирусам (ССЯ- , грипп птиц, НБ). Для количественной оценки специфического антигена многих возбудителей болезней птиц используют такие варианты иммуноферментного анализа, как «сэндвич-ИФА» и «блоки-рующий-ИФА». Актуальными являются исследования по разработке подобных тест-систем для Mycoplasma gallisepticum, позволяющих контролировать качество изготовляемых вакцин и антигенов, предназначенных для создания диагностических наборов.
Цели и задачи исследования. Целью нашей работы явилась разработка иммуноферментных тест-систем для определения уровня антител к возбудителям респираторного микоплазмоза и микоплазменного синовита в сыворотках крови кур и количественной оценки Mycoplasma gallisepticum в бактериальных суспензиях, используемых для производства вакцин и диагностических наборов.
При разработке тест-систем для выявления и определения уровня антител к Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae в сыворотках крови кур по конечной точке титрования и при использовании метода одного разведения с компьютерной обработкой результатов необходимо было решить следующие задачи:
- отработать методы получения высокоочищенных и концентрированных препаратов антигенов Мг и Мс и специфических контрольных сывороток крови кур;
- стандартизировать условия проведения реакции;
- установить критерии качественной и количественной оценки результатов;
- провести сравнительное изучение и установить корреляцию между результатами, полученными с помощью разработанной тест-системы, базовых тестов РТГА, РА и зарегистрированных на территории РФ иммуноферментных диагностических наборов (Mycoplasma gallisepticum N POSS US. ФВ . A 3. и Mycoplasma synoviae N POSS US. ФВ . A 4.) фирмы KPL (США);
- с помощью разработанных тест-систем провести исследования по оценке иммунного статуса поголовья птиц и определения степени инфицированности стад микоплазмами.
При разработке тест-систем для выявления и количественной оценки антигена Мг в антигенсодержащих суспензиях были поставлены следующие задачи:
- получить высокоочищенные, концентрированные препараты антигена Мг и специфических иммуноглобулинов, выделенных из сывороток крови лабораторных животных;
- стандартизировать условия проведения реакции;
- установить критерии качественной и количественной оценки результатов;
- провести сравнительное изучение и установить корреляцию между результатами, полученными с помощью разработанной тест-системы и базового теста РГА;
- с помощью разработанных тест-систем провести исследования по количественной оценке Mycoplasma gallisepticum в бактериальных суспензиях, используемых для производства вакцин и диагностических наборов.
Научная новизна. Впервые в России разработана иммуноферментная тест-система на основе непрямого варианта иммуноферментного анализа для выявления и количественной оценки специфических антител к Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae при тестировании сывороток крови в одном разведении. Метод учета результатов тестирования предусматривает определение титра антител по уравнению регрессионной зависимости, осуществляемое автоматически с использованием компьютерной программы для регистрации, обработки, хранения результатов иммуноферментного анализа в ветеринарии "СИНКО-ИФА", разработанной во ВНИИЗЖ.
Для выявления и количественной оценки антигена Mycoplasma gallisepticum в антигенсодержащем сырье, предназначенном для производства вакцинных препаратов и диагностикумов, впервые в России разработаны иммуноферментные тест-системы на основе "сэндвич-варианта" иммуноферментного анализа и непрямого жидкофазного блокирующего варианта иммуноферментного анализа с использованием в качестве блокирующих антител аффинно-очищенных IgG сывороток крови животных.
С помощью зарегистрированных на территории РФ иммуноферментных диагностических наборов фирмы KPL (США) и разработанных нами тест-систем проведены исследования по Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae за - гг. с анализом результатов серологического мониторинга ряда птицефабрик из всех регионов Российской Федерации.
Научная новизна полученных нами результатов подтверждена получением патента на изобретение.
Практическая значимость. Утверждены в установленном порядке нормативно-технические документы на «Набор для определения антител к Mycoplasma gallisepticum в сыворотках крови кур иммуноферментным методом» (ТУ - - ), «Набор для определения антител к Mycoplasma gallisepticum иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении» (ТУ - - ), «Набор для определения антител к Mycoplasma synoviae иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении» (ТУ - - ). Разработаны и утверждены директором ВНИИЗЖ: «Методика очистки и концентрирования антигена Mycoplasma gallisepticum», «Методика определения титра антител к Mycoplasma gallisepticum в сыворотках крови кур методом одного разведения в непрямой реакции иммуноферментного анализа», «Методика очистки и концентрирования антигена Mycoplasma synoviae», «Методика определения титра антител к Mycoplasma synoviae в сыворотках крови кур методом одного разведения в непрямой реакции иммуноферментного анализа», «Методика выявления и определения активности антигена Mycoplasma gallisepticum в непрямом «сэндвич-варианте» иммуноферментного анализа», «Методика выявления и определения активности антигена Mycoplasma gallisepticum в непрямом жидкофазном блокирующем варианте иммуноферментного анализа».
Разработанные иммуноферментные тест-системы применяются в научно-исследовательской и ветеринарной практике при оценке качества сырья для изготовления диагностических наборов и вакцин, при ретроспективной диагностике Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae и контроле поствакцинального иммунитета.
При использовании диагностических наборов для определения антител к Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae на основе разработанных иммуноферментных тест-систем в течение - г.г. было исследовано около 0 сывороток из птицеводческих хозяйств России и ближнего зарубежья, а также реализовано более коммерческих наборов, выпускаемых в ФГУ ВНИИЗЖ.
Основные положения, выносимые на защиту: - тест-системы на основе непрямого варианта иммуноферментного анализа для определения антител к Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae в сыворотках крови кур при тестировании проб в одном разведении;
- результаты использования разработанных тест-систем для контроля иммунного статуса поголовья птицефабрик;
- тест-система на основе «сэндвич-варианта» ИФА для выявления и количественной оценки антигена Mycoplasma gallisepticum в антигенсодержащем сырье;
- тест-система на основе непрямого жидкофазного блокирующего варианта ИФА для выявления и количественной оценки антигена Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae в антигенсодержащем сырье;
- результаты применения разработанной тест-системы для определения концентрации антигена в бактериальной суспензии, используемой для производства вакцин и диагностических наборов.
Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ВНИИЗЖ в - г., на конференции молодых ученых ФГУ ВНИИЗЖ «Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику» (г. Владимир, г.), на Всероссийской научной конференции во ВГНКИ «Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов» (г. Москва, г.), на международной научной конференции в БГВА «Современные проблемы генетики» (г. Витебск, г.), на «Международной конференции молодых ученых» (г. Щелково, г.), на «Международной научно-практической конференции, посвященной -летию IEKBM» (г. Харьков, г.), на «Международной научной конференции посвященной летию ФГУ ВНИИЗЖ» (г. Владимир, г.), на «Международной научно-практической конференции, посвященной -летию института» (г. Покров, г.), на «Конференции по птицеводству» (г. Зеленоград, г.), на конференции молодых ученых «Мониторинг и генодиагностика инфекционных болезней животных» (г. Владимир, г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано научных работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах, иллюстрирована таблицами и рисунками. Список использо ванной литературы включает источников, из них на иностранных языках.
Исследования по диссертационной работе выполнены в течение - г.г. в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ ВНИ-ИЗЖ, г. Владимир).
Автор выражает искреннюю благодарность д.б.н. Н.А. Перевозчиковой, д.б. н. В.Л. Узюмову, д.б.н. А.П. Пономареву, к.б.н. Н.С. Мудрак, к.в.н. В.Н. Ир-зе, к.б.н. Н.Н. Луговскои, к.б.н. М.А. Волковой, к.в.н. М.В. Гирину, к.б.н. М.С. Волкову, Ю.В. Зинковскому, к.б.н Т.В. Оковытой, к.б.н. А.И. Куприянову- за практическую помощь в выполнении отдельных этапов работы.
Общая характеристика возбудителей респираторного микоплазмоза и инфекционного синовита
Возбудителями респираторного микоплазмоза и микоплазмозного сино-вита кур и индеек являются Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae соответственно, принадлежащие к группе плевропнемниоподобных организмов (PPLO) [61, 90,130,163]. По современной классификации Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma sinoviae отнесены к роду Mycoplasma, семейству Mycoplasmataceae, порядку Mycoplasmatales, классу Mollicutes в который вошли прокариоты, лишенные ригидной клеточной стенки, и не способные синтезировать ее предшественников [2, 88, 106]. На плотных питательных средах (1,3 % агара) микоплазмы образуют колонии с плотным врастающим в агар центром и нежной поверхностной периферией, похожие на яичницу-глазунью. Размеры варьируют от 50 до 500 мкм. В структурной организации колонии наблюдается определенная закономерность: ее поверхностную часть составляют более крупные, иногда вакуолизи-рованные клетки, а центральную, более глубинную часть - мелкие оптически плотные клетки, что хорошо видно при фазово-контрастной микроскопии [98]. При титровании микоплазм в полужидкой среде можно видеть отдельные мелкие колонии, состоящие из полиморфных клеток: глобул (0,3-0,8 мкм), зерен, нитей, клеток грушевидной кокковидной [14, 159] или гантелевидной формы [19]. Структурная организация микоплазм достаточно проста. Их клетки ограничены трехслойной цитоплазматической мембраной толщиной 10 нм по своей структуре напоминающей мембрану клеток эукариот.
В цитоплазме имеется нуклеоид, дифференциально распределенный в виде нитей ДНК, рибосомы и иногда внутрицитоплазматические мембранные структуры. Геном микоплазм представлен примерно 750 тыс. нуклеотидных пар, относительное со держание цитозина и гуанина достигает 33%. Особенностью Mycoplasma gallisepticum является наличие полирибосом, собранных в суперструктуру, напоминающую по форме кукурузный початок и специальной системы микрофи-ламентов, выполняющих роль цитоскелета с терминальной электронно-плотной структурой "bleb" - волдырь (англ.) на одном полюсе клетки [13]. Эта структура содержит центральное осевое образование, аналогичное центриоли эукариот и служит для прикрепления и движения Mycoplasma gallisepticum. Также Mycoplasma gallisepticum, в отличие от неподвижной Mycoplasma synoviae, имеет в ДНК нуклеотидные последовательности, гомологичные гену актина у дрожжей, что подтверждает возможность сравнения белков цитоскелета и кодирующих их генов у прокариот и эукариот. Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae являются факультативными аэробами и культивируются на искусственных питательных средах, содержащих факторы роста, такие как холестерин, содержащийся в сыворотке крови, липопротеин и аминокислоты - аргинин, аспарагин, цистеин метеонин и другие [36, 37, 38]. Многие наблюдения свидетельствуют об ограниченном количестве ферментов в клетках микоплазм, обуславливающем низкую биохимическую активность.
Протеолитические свойства выражены слабо - не разжижают желатин, не изменяют структуру протеинов молока. По данным Мес-сарош Я (1987) сахаролитические признаки характеризуются ферментацией сахарозы, глюкозы, декстрина, мальтозы. Однако все вышеперечисленные биохимические признаки микоплазм лабильны [150,151,152]. Микоплазмы весьма чувствительны к изменению условий внешней среды. Они высокочувствительны к действию таких поверхностно активных веществ, как, например, желчь и соли желчных кислот, причем интенсивность ингибирующего воздействия зависит от количества гидроксильных групп в молекуле вещества [117]. Литическое действие оказывают на них мыла, первичные спирты и анионные детергенты. Они проявляют чувствительность к ультразвуку, ультрафиолету, рентгеновскому у-излучению, к 0,5% растворам хлорамина и фенола [13], едкого натра от 1 до 10% и 0,1 - 3%-ного формальдегида, 5% горячей эмульсии ксилонафта-5 при двухчасовой экспозиции. Мышьяковистые препараты не оказывают действия на микоплазмы [23, 153, 155]. Микоплазмы чувствительны к температурам выше 39 С [174, 175, 176]. При 45 С они теряют жизнеспособность через 1 час, при 60-65 С - через 10-15 минут. К низким температурам микоплазмы довольно устойчивы: при минус 25 С они остаются жизнеспособными до 3-х лет, при минус 70 С до 10 лет [14]. Отношение микоплазм к антибиотикам определяется отсутствием у них клеточной стенки; они устойчивы ко всем препаратам, действие которых связано с биосинтетическими процессами белков клеточной стенки, например, дегидрострептомицину, олеандомицину, пенициллину, сульфаниламидным препаратам, и чувствительны к ингибиторам синтеза мембранных и внутрици-топлазматических белков, таким как антибиотики тетрациклинового ряда, лин-козамины и стрептограмины; а также к аминогликозидам и хлорамфениколу [55,69,70,136].
Патогенез и патоморфологические изменения
По клинико-морфологическим проявлениям заболевания, вызываемые микоплазмами сходны с заболеваниями, вызванными другими микроорганизмами: хламидиями, вирусами, грибами и с некоторыми другими инфекционными заболеваниями, имеющими полиэтиологическую природу [43, 89,156].
Инкубационный период при естественном и искусственном заражении колеблется от 4 до 22 дней. Провоцирующее влияние стресс-факторов, таких как секундарные вирусные инфекции, отравления недоброкачественными кормами, инвазии, приводит к проявлению клинически выраженной болезни с признаками общих расстройств - вялостью, депрессией, отсутствием аппетита [15,19,29,76].
Восприимчивы все возрастные группы. Заболевание сопровождается снижением аппетита, яйценоскости и привесов. В 2-3 месячном возрасте у кур наблюдаются первые признаки болезни, проявляющиеся, прежде всего в расстройстве функций органов дыхания. Появляются одышка, кашель, трахеаль-ные хрипы, дыхание с открытым клювом. Часто возникает одно- или двусторонний ринит [110], сопровождающийся истечением из носа серозного или се-розно-фибринозного экссудата, может также наблюдаться синусит. Однако, ведущим признаком респираторного микоплазмоза, по мнению ряда авторов, [26, 79] является наличие аэросаккулита.Для микоплазмозов характерно медленное распространение в стаде и хроническое течение, зачастую со стертой клинической картиной. Смертность среди бройлеров доходит до 20-30 %, у взрослых кур она бывает низкой. Однако в случае смешаных инфекций тяжесть заболевания усиливается и смертность может достигать 80 %.
При анализе патоморфологических изменений можно выделить две стадии воспаления органов дыхания. Первая, чаще встречающаяся катаральная, характеризуется поражением верхних дыхательных путей (носовой полости, инфраорбитальных синусов, трахеи), без изменения воздухоносных мешков, вторая, более тяжелая гнойно-катаральная, связана с комплексным поражением органов дыхания. Однако при хроническом течении заболевания эти изменения не всегда хорошо выражены [42]. При гистологическом иссле 21 довании установлены два типа изменений: множественные гранулемы, преимущественно в легких и серозных оболочках, состоящие из клеточного распада с гигантоклеточной реакцией по периферии или множественные лимфо-фоликулярные очаги в субэпителиальной области синусов, «альвеолярных» стенках легких и серозных мембранах с инфильтрацией псевдоэозинофиль-ными клетками смежных тканей.
Респираторный микоплазмоз и инфекционный синовит широко распространены в птицеводчеких хозяйствах различных стран мира [129]. Этому способствует высокая концентрация поголовья на ограниченной территории, что связано с использованием промышленной технологии в птицеводческих предприятиях и специализации их по производству мяса, яиц и выращиванию племенного молодняка [50, 144]. Высокая численность птиц приводит к повышению чувствительности организма. В патологии «перенаселения» важное место принадлежит инфекционным болезням органов дыхания.
Источником возбудителя респираторного микоплазмоза являются больные птицы и микоплазмоносители [14]. В неблагополучных пунктах при отсутствии клинических признаков заболевания серологическим методом с различными антигенами, обнаруживают до 77-100% позитивно реагирующих птиц. В распространении болезни основное значение имеет трансовариальный способ передачи. Изменения в воздухоносных мешках, свойственные респираторному микоплазмозу, установлены у 8-30% эмбрионов, павших на выводе и в 9-20% случаев у цыплят суточного возраста. Авторы полагают, что инфицирование зародышей птиц происходит гематогенным путем. О возможности контактного заражения сообщают B.C. Осколков с соавт.(1987), Kerr К.М., Olson N.O. (1967) [111]. При спонтанном заболевании к возбудителю весьма восприимчивы цыплята 30-45 дневного возраста и куры в период начала яйцекладки, когда общий обмен организма повышается на 5-10%. Следует отметить, что куры специализированных пород, чувствительнее аборигенных.
Ряд исследователей сообщает о влиянии условий содержания на проявление и течение микоплазмозов. Б.Ф. Бессарабов (1974), А.Б. Байдевлятов (1979), А.А. Закомырдин (1981) [1a] указывают на то, что в птицеводческих помещениях промышленного типа птица полностью изолирована от естественных условий обитания. На этом основании авторы считают, что соблюдение условий микроклимата служит необходимым фактором профилактики респираторных болезней. Влажность и температура воздуха, движение воздушных масс, их химический состав оказывают существенное влияние на бактериальную загрязненность и запыленность помещений. В этом аспекте представляют интерес материалы исследований о снижении продуктивности и сохранности птиц вследствие возникновения респираторных расстройств из-за нарушения физиологического равновесия между аэродинамической функцией органов дыхания и мышечной активностью птиц [68].Проявлению инфекционного процесса, кроме неблагоприятных условий содержания, способствуют транспортировка птиц, перемещение внутри хозяйства, применением живых противовирусных вакцин против инфекционного ларинготрахеита, болезни Ньюкасла, бронхита кур, пастереллеза и влияние других факторов, ослабляющих естественную резистентность организма [21, 22].
В свою очередь микоплазмоносительство является одной из основных причин недостаточной иммунологической реактивности птиц в ответ на вакцинацию против респираторных заболеваний.Среди факторов, имеющих значение в эпизоотологии микоплазмозов, определенное место занимают смешанные инфекции, прежде всего колибак-териоз, так как эндотоксин эшерихий способствует возникновению стресса у домашних птиц. Показано, что значительное число эшерихий, изолированных от больных птиц, обладает инвазивными и токсигенными свойствами, вследствие чего микоплазмоз в сочетании с развивающимся на его фоне колибак-териозом имеет более острое течение и сопровождается высокой смертностью.
Такие вирусные заболевания, как инфекционный ларинготрахеит, инфекционный бронхит, болезнь Ньюкасла, теносиновит, как уже говорилось выше, обостряют течение микоплазмозов у птиц [24,165,166]. Микоплазмы могут вызывать локальную инфекцию [173]. Однако нередко наблюдается диссеминация возбудителя в организме, что приводит к генерализации процесса и способствует хроническому рецидивирующему течению инфекции с длительным персистированием возбудителя в организме [57]. Всвязи с этим, микоплазмы обнаруживаются в течении длительного времени в организме клинически здоровых птиц. Персистирующие микоплазмозы могут активироваться под влиянием стрессовых ситуаций и инфекций, вызванных другими агентами [139]. В этой связи следует уделять особое внимание бессимптомным и стертым формам, а также учитывать, что клиническое благополучие, наступающее после активной специфической терапии, часто не сопровождается гибелью возбудителя, а способствует переходу острой формы в латентную, затрудняющую индикацию возбудителя.
Микоплазменные инфекции часто сопровождаются различными иммунопатологическими реакциями, степень выраженности которых зависит от чувствительности хозяина к возбудителю.При естественных и экспериментальных микоплазменных инфекциях протективный иммунитет складывается из местных защитных реакций и генерализованного клеточного и гуморального иммунного ответа [35, 66]. Первым барьером на пути развития инфекции является местная защитная реакция, выражающаяся в фагоцитозе микоплазм разными субпопуляциями А-клеток и клеточными макрофагами, активированными продуцированием лимфокинов, комплемента и секреторных антител. Кроме того, секреторные антитела препятствуют прикреплению микоплазм к клеткам мерцательного эпителия и оп-сонируют клетки микоплазм, ограничивая распространение инфекционного агента. Что касается гуморального иммунитета, необходимо отметить, что его уровень в значительной степени определяет степень резистентности птиц к микоплазменным инфекциям [124,126]. По данным Bryant В. J. (1973 г.) у бур-сэктомированных птиц уровень специфических антител к Mycoplasma gallisepicum и Mycoplasma synoviae значительно ниже, чем у птиц с фабрициевой сумкой, главным лимфоидным органом В-гуморального иммунитета, и устой чивость к инфекции находятся в прямой зависимости от количества сохраненной лимфоидной ткани [97]. Клеточный иммунитет (Т-иммунитет) также играет важную роль в протективном иммунитете при заболеваниях микоплазменной этиологии, что подтверждается данными реакции бласттрансформации лимфоцитов. Микоплазмы индуцируют синтез антител всех классов, динамика накопления которых отслеживается с помощью серологических реакций. Существующие меры борьбы включают антибиотикотерапию, вакцинопрофилакти-ку, искоренение инфекции путем уничтожения серопозитивных птиц [10, 11, 174,176].
Наибольший эффект достигается при применении сульфаниламидных препаратов. Эффективность профилактики тилозином для контроля мико-плазмозов у птиц была установлена более десяти лет назад [101, 102, 103, 104,105]. Также широко используются для этих целей тилан и байтрил.Успех вакцинации против микоплазмозов зависит от специфической активации клеточного и гуморального звеньев иммунитета, т.е. от специфической сенсибилизации лимфоцитов и продукции антител к Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae. Для специфической профилактики заболевания применяют живые и инактивированные вакцины (бактерины) [170]. Широкое распространение живых вакцин в настоящее время связано с одной стороны с их способностью поддержания иммунитета на относительно высоком уровне при условии совместного содержания разновозрастной птицы, с другой стороны с их относительно невысокой стоимостью. Во многих странах используют бактерины, содержащие инактивированную Mycoplasma gallisepticum в составе водно-масляной эмульсии или сорбированную на гидроокиси алюминия (ГОА) [113, 114, 115, 84, 147]. Также прошли испытание вакцины на основе новых адъювантов и носителей, таких как INSOM: липосо-мы и иммуностимулирующие комплексы [140].
Преимущество бактеринов перед живыми вакцинами заключается в их безвредности, а также в невозможности реверсии возбудителя. Наличие у вакцинированных птиц антител к Mycoplasma gallisepticum не оказывает негативного влияния на эффективность бактеринов.
Диагностика респираторного микоплазмоза и инфекционного синовита
Всвязи с атипичным течением заболевания диагноз устанавливают на основании комплексного диагностического исследования, включающего выделение и идентификацию возбудителя, эпизоотологические, серологичские, клинические и патоморфологические данные [46, 51, 143, 145]. При этом из-за отсутствия характерных признаков заболевания окончательный диагноз устанавливают на основе лабораторного микоплазматического исследования, включающего методы ранней и ретроспективной диагностики [122,131, 180]. возбудителей. Для выделения возбудителя используют материал от эмбрионов, не вылупившихся птенцов, живых птиц или свежих трупов, так как у павших птиц быстро происходит посмертное бактериальное инфицирование органов. В связи с этим, а также учитывая гематогенный способ распространения возбудителя, многие авторы предлагают отбирать материал для исследований не только из органов дыхания (трахеи, воздухоносных мешков, гортани, но и из головного мозга, а для Mycoplasma synoviae и из суставных полостей, печени, селезенки, почек, содержимого желточного мешка [14, 17]. Сходство L-форм бактерий с микоплазмами по культуральным и биохимическим признакам, часто затрудняет идентификацию последних [167].
Поэтому первичная подготовка патологического материала заключается в де-контаминации от бактерий обработкой пенициллином (5 тыс. ЕД/мл) и уксус-но-кислым таллием (1:2000-1:4000), обладающими L-трансформирующими свойствами [8]. Для выделения используют бульон или агар, но обычно перед выполнением идентификации необходимо получить колонии возбудителя на агаре [9,160,179]. Идентификация возбудителей. Биохимические тесты, такие как: сбраживание глюкозы, отсутствие гидролиза аргинина или образования пленки и пятен, частичное или полное отсутствие фосфатазной активности, восстановление трифенил тетразоль хлорида помогают в определении возбудителя, тем не менее они неспецифичны и требуют получения чистой культуры путем клонирования. Поэтому большое значение для определения возбудителя имеют методы лабораторной диагностики: РЗР, ПЦР, РСК, РГА, ИФА. Реакция задержки роста (РЗР). Впервые была предложена D. Edvard и W. Fitzgerald (1954) [63, 64]. В этой реакции рост клонированной культуры возбудителя, взятой в оптимальной концентрации (104 колонеобразующих единиц (КОЕ)) подавляется специфической антисывороткой, что позволяет определить вид микоплазм [157]. Сыворотка должна быть получена от млекопитающих, так как сыворотка кур неэффективно подавляет рост, и должна обладать высоким титром и моноспецифичностью. В дальнейшем реакция подверглась различным модификациям [56], сущность которых заключается в разнообразии засева культур и контакта микоплазм с антисыворотками. Реакция малочувствительна, так как скорость роста микроорганизма, наряду с другими факторами (концентрация, чистота материала и т.д.), может влиять на подавление роста в опыте [13]. Реакция связывания комплемента (РСК). D. Card, Н. Keller (1960) предложили использовать этот тест для типизации микоплазм.
Реакцию осуществляют в два этапа. На первом этапе реакции участвуют антиген и антитело (один из этих компонентов известен заранее, как и оттитрованное количество комплемента). Этот комплекс связывает комплемент при соответствии антигена и антител. Последнее выявляют на втором этапе с помощью индикаторной системы, в которую входят эритроциты барана и антисыворотка к ним. Результаты постановки РСК положительны в том случае, если комплемент свяжется с комплексом антиген - антитело и не произойдет лизиса эритроцитов. Для повышения специфичности и чувствительности реакции 3. П. Федорова с соавт. (1970) [19а] предложили использовать антисыворотки белых крыс и растворимые антигены, полученные путем 10-кратного замораживания и оттаивания отмытой и концентрированной биомассы при 70 С. Однако из-за сложности подготовки компонентов и постановки реакции, РСК не получила широкого распространения для массовых исследований. Иммуноферментный анализ (ИФА). «Сэндвич-вариант» и блокирующий вариант ИФА используют для выявления микоплазм в антигенсодержащем сырье (более подробно описан в п. Полимеразная цепная реакция. Геном возбудителя можно выявить в реакции гибридизации с ДНК зондом, но в настоящее время общепринято применять ПЦР для амплификации специфичных участков ДНК в исследуемом материале [39, 177, 178]. Этот метод позволяет производить диагностику в течение 6-8 часов [75]. Комбинирование этого метода с рестрикционным анализом повышает специфичность метода, давая возможность не только идентифицировать возбудителя до вида, но и дифференцировать вакцинные штаммы от полевых изолятов. Являясь методом, выявляющим напрямую нуклеиновую кислоту возбудителя, ПЦР позволяет обнаруживать ее или ее остатки в материале даже если они находятся там в минимальных количествах, тем самым метод не уступает по чувствительности культуральным [126]. Благодаря этому становится возможной ранняя диагностика заболевания, когда еще отсутствуют клинические признаки и не выявляется иммунный ответ лабораторными методами [71, 72].
Электронная микроскопия. Изучение морфологии микоплазм - важный этап при определении их таксономической принадлежности. Электронная микроскопия позволяет провести первичную идентификацию микоплазм в чистой культуре и как контами-нантов вируссодержащего материала [168]. Отсутствие ригидной клеточной стенки обуславливает разнообразие форм возбудителя. Поэтому интерпретация результатов требует определенного опыта [127]. Реакция геммаглютинации (РГА). Бульонные культуры микоплазм обладают способностью агглютинировать эритроциты кур. Эта реакция используется для дифференциации Mycoplasma gallisepticum от Mycoplasma gallinarum и для проверки активности вакцин против респираторного микоплазмоза и инфекционного синовита птиц. При этом необходимо учитывать, что различные факторы, такие как состав и кислотность сред, оказывают значительное влияние на гемагглютинирующую способность культур. Недостатком реакции является то, что отдельные партии сред (бульоны Мартена, Хоттингера и Эдварда) обладают агглютинирующей активностью. Кроме того гемагглютинирующая активность культур микоплазм непостоянна и при длительном культивировании на бесклеточных питательных средах она снижается или полностью утрачивается [154]. Результаты реакции сложно интерпретировать и при наличии в материале гетерологичных гемагглютинирующих антигенов (при контаминации сырья или при изготовлении ассоциированных вакцин).
Разработка тест-систем для определения антител к Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae на основе непрямого варианта иммуноферментного анализа
Следующим этапом нашей работы была разработка тест-систем на основе непрямого варианта ИФА для выявления и количественной оценки специфических антител к Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae. Для этих целей использовались препараты соответствующих антигенов, полученные по пункту 3.2.1. Контроль активности полученных препаратов осуществляли с помощью электронной микроскопии, а также в Б-ИФА и РГА. Так титр антигенсодержащей культуры составлял 1:3200 в ИФА и 7 log2 в РГА, после инактивации - 1:1600 в ИФА и 6 Іод2 в РГА. Контроль специфичности препаратов осуществляли в непрямом варианте ИФА при взаимодействии Mycoplasma gallisepticum или Mycoplasma synoviae, взятыми в рабочей концентрации, с ге терологическими сыворотками, реакция с которыми не должна превышать фоновый уровень (реакция с неиммунной сывороткой). Специфические сыворотки, используемые как положительный контроль, получали путем двукратной иммунизации кур в возрасте 60 дней инактивиро-ванной вакциной из штамма "S6" (Mycoplasma gallisepticum) или из штамма "WVU 1853" (Mycoplasma synoviae) внутримышечно в область бедра в дозе 1,0 мл с интервалом 14 дней. Активность полученных сывороток крови кур в РТГА была не ниже 1:512, а в ИФА не ниже 1:6400. Нормальную сыворотку получали путем обескровливания SPF цыплят в возрасте 3 дней. Разработка тест- систем включала в себя определение рабочего разведения сывороток, выведение уравнения линейной регрессии для вычисления титра, определение оптимального диапазона оптической плотности контролер установление позитивно-негативного порога и на его основе наименьшего отрицательного титра для количественного учета результатов. Оптимальное разведение сыворотки. Непрямой вариант иммунофер-ментного анализа проводили по стандартной методике с использованием субстратов: ОФД и АБТС (для Mycoplasma gallisepticum). Для выбора оптимального рабочего разведения исследовали сыворотки с разным уровнем антител к Mycoplasma gallisepticum в разведениях 1:100, 1:200, 1:400 и вычисляли значения S/P (отношение оптической плотности испытуемой сыворотки к разнице между оптическими плотностями положительного и отрицательного контролей): S/P10o, S/P2oo, S/P4oo.
В работе приведены данные зависимости log S/P от разведения сыворотки для Mycoplasma gallisepticum, полученные с использованием субстратов ОФД и АБТС (табл. 14 и 15). Результаты обрабатывали с применением компьютерной программы Statistica (Correlation matrices). Для каждого разведения определяли коэффициент корреляции со значением титров, определенным методом последовательных разведений, который составил 0,90, 0,94, 0,95 (субстрат ОФД) и 0,86, 0,93, 0,94 (субстрат АБТС), разведения 1:100, 1:200, 1:400, соответственно. Подобные исследования с применением субстрата АБТС были проведены для Mycoplasma synoviae. Коэффициент корреляции составил 0,94 для разведения 1:100, 0,95 для разведения 1:200, 0,97 для разведения 1:400. Разведение 1:400, имевшее для обоих антигенов наибольший коэффициент корреляции для АБТС (0,94, 0,97) и ОФД (0,95), было выбрано рабочим. Позитивно - негативный порог. Для объективной оценки иммунного ответа было необходимо установить позитивно - негативный порог (ПНП). Для этого 53 сыворотки крови от цыплят, не имеющих антител к Mycoplasma gal-lisepticum (субстрат ОФД) и 30 сывороток от цыплят, не имеющих антител к Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae (субстрат АБТС), протестированных с помощью коммерческого набора фирмы KPL, были исследованы методом последовательных разведений. В качестве положительного и отрицательного контроля были взяты стандартные контрольные сыворотки. ПНП определяли путем расчета средних значений оптической плотности отрицательных сывороток для каждого разведения, прибавляя три значения стандартного отклонения. Полученный в результате в виде прямой ПНП представляет границу, отражающую верхние 0,5% отрицательных величин, если допустить нормальную оптическую плотность отрицательных сывороток. В табл. 16, 17, 18 приведены результаты расчетов по методу, описанному выше. Для субстрата ОФД среднее значение оптической плотности отрицательных сывороток суммированное с утроенным значением стандартного отклонения соответствующее нижнему положительному титру антител к Mycoplasma gallisepticum и являющаяся средним значением для представленных чисел, составило 0.213.
Средние значения оптической плотности контрольных сывороток высчи-тывались из суммы оптических плотностей всех разведений в трех повторно-стях. Определялось пороговое S/P: С учетом возможных погрешностей, допустимых в пределах одного разведения, где Т/2 Т Т 2, выделялась сомнительная зона. Таким образом, титр антител в пределах 0 - 575 считался отрицательным, 576 - 1138 - сомнительным, от 1139 и выше - положительным. Аналогично вычислялись пороговые значения для субстрата АБТС. Значение оптической плотности, соответствующее минимальному положительному титру антител к Mycoplasma gallisepticum, равнялось 0,193, пороговое S/P = 0,1523, LG S/P = -0,8173. Титр от 0 до 416 считался отрицательным, от 417 до 833 - сомнительным, от 834 и выше - положительным. Расчеты, произведенные по выведенному уравнению линейной регрессии для Mycoplasma synoviae, выглядят следующим образом: среднее значение оптической плотности отрицательных сывороток суммированное с утроенным значением стандартного отклонения составило - 0,196, пороговое S/P - 0,1546, наименьший положительный титр, вычисленный по формуле: Lg Т = 3,7303 + 1,3591 (LG S/P), - 425. Таким образом в отрицательную зону вошли сыворотки с титром от 0 до 425, от 426 до 850 - в сомнительную, от 851 и выше - в положительную зону. Выбор допустимых значений контрольных сывороток. Для получения достоверных результатов при подсчете титра антител в исследуемых сыворотках необходимо учитывать входят ли значения оптических плотностей положительного и отрицательного контролей в диапазон допустимыных значений. Эти диапазоны были определены как среднее значение исследованных контрольных сывороток из разных серий с учетом доверительного интервала (расчёты для антигена Mycoplasma gallisepticum представлены в табл. 19, 20).
