Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 11
2.1. Аквакультура; состояние и перспективы развития 11
2.2. Общая характеристика возбудителя болезни 16
2.2.1. География распространения болезни 17
2.2.2. Эпизоотическая обстановка по болезни в России 19
2.2.3. Клинические признаки и патолого-анатомические изменения 21
2.2.4. Строение вириона 22
2.2.5 Антигенные свойства вируса 24
2.3. Диагностика болезни 25
2.3.1. Идентификация возбудителя серологическими методами 26
2.3.2. Идентификация рабдовирусов рыб на основе анализа генома 28
2.4. Филогенетический анализ генома рабдовирусов рыб 32
2.5. Заключение по обзору литературы 36
3. Материалы и методы 37
3.1. Материалы 37
3.1.1. Штаммы 37
3.1.2. Ферменты 37
3.1.3. Реактивы 37
3.1.4 Среды 38
3.1.5. Лабораторное оборудование 38
3.2. Методы 38
3.2.1. Культивирование вирусов 38
3.2.2. Получение патматериала от рыб 39
3.2.3. Концентрирование вируса ВВК 39
3.2.4. Фенольно-детергентный метод выделения РНК 39
3.2.5. Выделение РНК с помощью гуанидин изотиоцианата натрия 40
3.2.6. Синтез кДНК и клонирование 40
3.2.7. Трансформация клеток Е coli с применением СаС12 40
3.2.8. Постановка дот-гибридизации 41
3.2.9. Постановка ОТ-ПЦР 41
3.2.10. Анализ ПЦР продуктов 42
3.2.11. Рестрикционный анализ продуктов ПЦР 42
3.2.12. Компьютерный анализ и сравнение первичных последовательностей нуклеиновых кислот, расчет олигонуклеотидов..42
4. Результаты собственных исследований 44
4.1. Клонирование фрагментов генома вируса ВВК 44
4-2. Разработка тест-системы на основе молекулярной гибридизации 47
4.3. Разработка тест-системы для идентификации вируса ВВК с помощью полимеразной цепной реакции 51
4.3.1. Оптимизация постановки ПЦР 51
4.3.2. Определение специфичности метода ПЦР 54
4.3.3. Сравнительная эффективность выявления вируса ВВК в материалах от рыб методом ПЦР 55
4.4. Дифференциация штаммов и изолятов вируса ВВК на основе анализа генома 62
4.4.1. Дифференциация штаммов и изолятов вируса ВВК методом рестрикционного анализа продуктов ПЦР 62
4.4.2. Дифференциация штаммов и изолятов вируса ВВК при помощи штаммоспецифической ПЦР 69
5. Обсуждение 73
6. Выводы 82
7. Практические предложения 84
8. Список литературы 85
9. Приложение 98
- Клинические признаки и патолого-анатомические изменения
- Идентификация рабдовирусов рыб на основе анализа генома
- Выделение РНК с помощью гуанидин изотиоцианата натрия
- Разработка тест-системы для идентификации вируса ВВК с помощью полимеразной цепной реакции
Введение к работе
1 1.1. Актуальность проблемы. Весенняя виремия карпа (ВВК) — остропротекающая высококонтагиозная вирусная болезнь карпа, Cypnnus сагрю L , характеризующаяся развитием септического процесса и массовой гибелью рыб Заболевание проявляется в виде экссудативно-геморрагического синдрома («краснуха»), обусловленного поражением вирусом эндотелия кровеносных капилляров и почек, что приводит к нарушению водно-минерального баланса и выходу плазмы и форменных элементов крови в окружающие ткани и полости тела (Рудиков, 1988, Fijan et al, 1971, Wolf 1988) По классификации Международного эпизоотического бюро (МЭБ) ВВК относится к категории особо опасных («декларируемых») болезней рыб (OIE, 2004)
В аквакультуре вспышки заболевания провоцируются техногенными стрессами и происходят обычно весной, вскоре после пересадки рыб из зимовальных в нагульные пруды Гибель рыб (преимущественно годовиков и двухлетков, реже - двухгодовиков и производителей) достигает 30-40%, а иногда и 70% (Fijan, 1999) При выращивании в поликультуре с карпом вирус выделяли также от белого амура, белого и пестрого толстолобиков, золотого карася, европейского сома и щуки (Инструкция , 1997)
ВВК установлена во всех европейских странах с развитым карповодством С 2002 г регистрируется в США (Goodwin, 2002), а в 2004 г была выявлена в Китае (Liu et al, 2004) В последние годы наблюдается тенденция к глобализации инфекции Основным путем распространения болезни являются межхозяйственные перевозки живой рыбы, в т ч декоративных карповых рыб (OIE, 2004)
В бывшем СССР возбудитель ВВК был впервые выделен от больных рыб Н.И Рудиковым (1972) Было обнаружено, что ВВК широко распространена в рыбхозах центральной и южной зон Европейской части страны (в т ч в Белгородской, Курской, Липецкой, Ростовской областях и Краснодарском крае России, а также в Украине, Молдове, Беларуси, Литве и Грузии), где она вызывала гибель до 30-57% карпа -главного объекта выращивания в отечественной аквакультуре (Мамыш и др , 1981, Надточий, Рудиков, 1975, Осадчая, 1977; Рудиков, 1975, 1980, 1988, Рудиков и др , 1986, Скурат и др , 1984 Щелкунов, Щелкунова, 1987, 1990, Щелкунов и др , 1984) В 1993-1995 и 2004 г г ВВК отмечали в рыбоводных хозяйствах Свердловской и Тверской областей, а с 2003 г болезнь регистрируют в Московской области (Пичугина и др, 2004) Существует реальная опасность дальнейшего
РОС. НАЦИОЬ* -і , ,
вивлиотькл
распространения ВВК по территории страны, создающая угрозу значительных материально-экономических потерь в будущем, когда отечественное рыбоводство вновь заработает в полную силу
В России диагноз на ВВК ставят на основании выполнения комплекса классических требований, включающих анализ эпизоотологических данных, клинических признаков заболевания и патологоанатомических изменений, подкрепленный результатами вирусологических исследований по выделению и серологической идентификации вируса с последующей постановкой биопробы Вместе с тем, оставаясь «золотым стандартом», традиционные вирусологические методы, в силу их трудоемкости и продолжительности, уже не в полной мере отвечают требованиям сегодняшнего дня Сегодня диагностика ВВК остро нуждается в экспрессных, чувствительных и специфичных методах детектирования возбудителя Коммерческие наборы для быстрого выявления вируса с помощью поли - и моноклональных антител производят фирмы Чехии, Германии и Бельгии, однако эти наборы недостаточно специфичны Разрабатываемые за рубежом молекулярно-генетические методы диагностики ВВК (зондовой антирибонуклеазной защиты, полугнездовой и гнездовой полимеразной цепной реакции, гибридизации in situ и обратной гибридизации) (Ahne et al, 1998, Dixon, 2003; Koutna et al, 2003, Liu et al, 1998, Sheppard et al, 2003, OIE, 2003), при всех их достоинствах, имеют ряд недостатков (необходимость использования культур клеток рыб, радиоизотопов и др ), ограничивающих их использование на практике
Исследования последних лет показали, что избирательная амплификация участков вирусного генома с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), дополняя серологические методы, способна значительно расширить возможности выявления вируса ВВК непосредственно в клинических образцах
Одним из перспективных направлений является применение метода ПЦР в сочетании с секвенированием ПЦР-продуктов и рестрикционным анализом Данный подход позволяет осуществлять тонкую генетическую дифференциацию штаммов и изолятов вируса Преимуществом этих методов является высокая чувствительность и специфичность, быстрота и уникальный дискриминативный потенциал Поэтому изучение генома вируса ВВК с целью совершенствования имеющихся и разработки новых эффективных средств диагностики болезни-'Является актуальной научной проблемой.
1.2 Цель и задачи исследования Целью настоящей работы является создание тест-систем для идентификации возбудителя весенней виремии карпа на основе методов анализа генома В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи
сконструировать ДНК-зонды комплементарные различным участкам генома вируса ВВК и оптимизировать условия проведения гибридизации,
определить специфичность и чувствительность метода гибридизации для идентификации РНК вируса ВВК на панели вирусных изолятов;
подобрать специфичные праймеры для амплификации различных участков генома вируса и оптимизировать условия проведения полимеразнои цепной реакции,
- определить специфичность и чувствительность метода ПЦР для
идентификации РНК вируса ВВК в зараженной культуре клеток и клиническом
материале от искусственно и естественно инфицированных рыб,
- провести дифференциацию различных штаммов и полевых изолятов вируса
на основе анализа первичной последовательности участков гена нуклеопротеина и
рестрикционного анализа ПЦР-продуктов
1.3. Научная новизна:
впервые клонированы последовательности генома отечественного референсного штамма ЗЛ4 вируса ВВК и получены фаговые ДНК-зонды, пригодные для выявления РНК вируса ВВК в зараженной культуре клеток методом дот-гибридизации;
- определены праймеры и отработаны условия постановки ПЦР,
позволяющие идентифицировать вирус ВВК в зараженной культуре клеток и
клиническом материале от рыб,
впервые определена нуклеотидная последовательность фрагмента гена нуклеопротеина 7 европейских и 12 отечественных изолятов вируса ВВК с целью установления их генетического родства,
показано, что европейские изоляты вируса ВВК отличаются от изолятов из бывшего СССР более высоким уровнем консервативности гена нуклеопротеина, выявленные различия легли в основу разработки метода рестрикционного анализа для генетического типирования и дифференциации вирусных штаммов в зараженной культуре клеток и клиническом материале от рыб,
- обнаружен комплекс точечных мутаций в последовательности между
генами нуклеопротеина и фосфопротеина, характерный для представителей
отечественной мажорной геногруппы вируса, выявленная особенность
использована при разработке штаммоспецифической ПЦР для быстрой
идентификации агентов данной группы
1.4. Практическая значимость. Разработаны методы, наборы препаратов и
инструкции по применению молекулярной гибридизации и ПЦР для выявления РНК
вируса весенней виремии карпа, которые прошли комиссионные испытания,
одобрены Ученым советом и утверждены заместителем генерального директора
ФГУП «ВНИИПРХ»
Разработаны методы рестрикционного анализа ПЦР-продуктов и штаммоспецифической ПЦР и на их основе предложена схема дифференциации штаммов и полевых изолятов вируса ВВК
Разработанные методы и наборы препаратов рекомендованы для включения в схему лабораторных исследований при диагностике болезни
1.5. Основные положения, выносимые на защиту:
наборы препаратов для выявления РНК вируса ВВК на основе методов молекулярной гибридизации и полимеразной цепной реакции с использованием праймеров комплементарных различным областям вирусного генома,
способы молекулярно-генетической идентификации полевых изолятов и штаммов вируса ВВК в зараженной культуре клеток и пробах клинического материала,
методы дифференциации штаммов и полевых изолятов вируса ВВК с помощью штаммоспецифической ПЦР и рестрикционного анализа
1.6. Апробация результатов работы. Материалы диссертации доложены на
заседаниях Ученого совета ФГУП «ВНИИПРХ» и совместных заседаниях Научно-
консультативного совета по болезням рыб Межведомственной ихтиологической
комиссии и Секции патологии рыб и охраны гидробионтов Отделения ветеринарной
медицины РАСХН (1999 - 2005 г г), Научно-практической конференции «Проблемы
охраны здоровья рыб в аквакультуре» (21-22 ноября 2000 г, г Москва),
Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы иммунологии,
патологии и охраны здоровья рыб» (16-18 ию'ля'2ТГОЗ' г""п*"БЗр5'К'Яросл'а"всКйй обл у,
Второй международной научной конференции «Биотехнология - охране
окружающей среды» (25-27 мая 2004, МГУ, г Москва) Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (26-27 мая 2005 г, г Щелково Московской обл), Всероссийской научно-практической конференции-семинаре «Эпизоотологический мониторинг в аквакультуре состояние и перспективы» (13-14 сентября 2005 г, г Москва), Четвертом Международном симпозиуме по вирусам низших позвоночных (12-15 мая 1998 г, г Веймут Великобритания), Первом и Втором российско-американских симпозиумах по охране здоровья рыб и других гидробионтов (12-19 июля 1998 г, п Рыбное Московской обл и 21-28 сентября 2003 г, г Шефердстаун, США), Девятой и Десятой международных конференциях Европейской ассоциации ихтиопатологов (19-24 сентября 1999 г, Родос, Греция и 9-14 сентября 2001 г, г Дублин, Ирландия), Семинаре референтных лабораторий Евросоюза по диагностике болезней карповых рыб (2-4 июня 2003 г, г Веймут, Великобритания) и 30-ой Восточной конференции по охране здоровья рыб (13-17 июня 2005 г, г Шефердстаун, США)
1.7. Публикация результатов. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ
1 8 Участие соискателя в получении научных результатов. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно Идентификацию вируса ВВК методом ПЦР и рестрикционного анализа продуктов амплификации проводили совместно с к х н Орешковой С Ф
1.9. Объем и структура работы. Материалы диссертации изложены 97 страницах машинописного текста и состоят из следующих разделов введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, список литературы, содержащий 149 отечественных и зарубежных источников, приложение Диссертация иллюстрирована 9 таблицами и 12 рисунками
Клинические признаки и патолого-анатомические изменения
Заболевание протекает в острой, хронической и нервной формах [22, 69]. Острая форма характеризуется внезапным появлением и быстрым течением. Больные рыбы собираются стаями у водоподачи, часто дышат. При наружном осмотре отмечают ерошение и выпадение чешуи, увеличение брюшка, точечные кровоизлияния в межлучевых пространствах плавников, серповидное кровоизлияние вокруг зрачка. Жабры анемичны, позже развивается экзофтальмия. Из ануса выделяются слизистые тяжи с примесью крови. Слизь может приобретать густую консистенцию, похожую на творожистую массу. Выздоравливает лишь небольшая их часть. Хроническую форму наблюдают у незначительной части (около 5 %) заболевших. Рыба не принимает корм, кожные покровы темнеют, могут быть кровоизлияния на поверхности тела или в глазном яблоке. Жабры анемичны, развивается прогрессирующее истощение. Нервную форму регистрируют на завершающей стадии эпизоотии у 3—5 % больных рыб, связана она с проникновением вируса в центральную нервную систему. Внешне клинические признаки выражены слабо, однако заметно подрагивание мышц, повышенный тонус мускулатуры. Вслед за возбуждением наступает фаза угнетения. При экспериментальном инфицировании характерен серозный менингит, иногда развивается паралич нижней челюсти и рот не закрывается. При вскрытии отмечают выраженную гидремию мышц и тканей, в брюшной полости скапливается жидкость желтоватого цвета.
Печень с мозаичным рисунком, темно-серого или глинисто-зеленого цвета, желчный пузырь переполнен. Почки набухшие, дряблые. Селезенка темно-вишневого цвета, кишечник пустой с признаками катарального воспаления [3, 18, 22, ]. ВВК вызывает РНК-содержащий Rhabdovirus carpio (синоним Spring viraemia of carp virus —SVCV), предварительно отнесенный к роду Vesiculovirus, пулевидноЙ формы, размером 105—125x70—85 нм. [5, 7, 15, 22, 69, 145]. Кроме того, в состав данного рода входят другие близкородственные вирусы, вызывающие опасные заболевания рыб - рабдовирус мальков щуки (PFRV), рабдовирус угря (Rhabdoviras anguilla), рабдовирус европейской кумжи (ELTV)[138]. Геном рабдовирусов рыб имеет молекулярную массу 4,6 х 10 дальтон и представлен единой нефрагментированной молекулой нуклеиновой кислоты (минус нить, длиной 11019 нуклеотидов у вируса ВВК) [78, 108, 116, 125] (Рис.1). На 3 -конце генома расположена лидерная РНК размером 48 нуклеотидов, которая участвует в транскрипции и регуляции синтеза белка хозяйских клеток [29, 76, 120]. Нуклеокапсид рабдовирусов рыб составляет 14% общей массы вириона, состоит из РНК (4%) и бел ка-нуклео протеи на (96%), представляет собой свернутую однонитчатую спираль длиной 1 мкм, диаметром 10 нм [36, 50]. По данным большинства исследователей, плавучая плотность рабдовирусов рыб равняется 1,16-1,20 г/см3, константа седиментации - 550-650 S, молекулярная масса - 475x10 б дальтон [5, 22, 69]. Геном рабдовирусов рыб кодирует пять отдельных полипептидов. Нуклеокапсид вируса состоит из 3 структурных белков: N, Р и L. Белок N (нуклеопротеин) непосредственно связан с РНК вируса и формирует рибонуклеопротеид [37, 57, 61]. Молекулярная масса фосфопротеина (Р-белка) - 37-40 кДа. Р-белок вместе с N-белком составляют 30-34% от всех вирусных белков и формируют нуклеокапсидный комплекс [35, 92, 99].
Матриксный (М) белок имеет молекулярную массу около 30 кДа. Он является внутренним белком вирусной липопротеидной оболочки. Наружные пепломеры (шины) вирионов построены из гликопротеина (G-белка). G-белок имеет молекулярную массу 65 кДа, что составляет 44-47% от общего количества белка. Он является единственным гликолизированньш белком и отвечает за иммуногенные свойства вириона [33,85,86,87]. L-белок обладает наибольшей молекулярной массой 190-200 кДа и представляет собой основной вирусный белок, ответственный за транскриптазную активность вириона [102]. Рабдовирусы рыб содержит два основных антигена, один из которых представляет собой гликопротеин вирусной оболочки, второй -внутренний нуклеопротеин вириона [32, 34, 39, 41]. Гликопротеин оболочки вириона является структурным компонентом, индуцирующим образование вируснейтрализуїощих антител, которые имеют важное значение в диагностике болезни [84, 86, 110, 118]. Исследованиями последних десятилетий установлено, что некоторые изоляты, выделенные в Европе, содержат общий нуклеопротеиновый антиген, который обнаруживается во всех серологических реакциях [138, 119, 123]. Однако, изоляты рабдовирусов рыб различаются при сравнении их в реакциях нейтрализации и перекрестной защиты, что свидетельствует об их антигенном различии [105, 129, 130]. На основе данных Комитета экспертов МЭБ все вирусы были разделены на 4 серотипа [112, 133, 137]. Постепенно стала обозначаться еще одна проблема: накапливались факты обнаружения «ускользающих от нейтрализации» изолятов VHS-, IHN-, а затем и SVC-вирусов [90, 112, 137]. Появление таких изолятов отражало высокую мутационную изменчивость РНК-геномных вирусов [95] и в практическом плане грозило повышением частоты ложно-негативных диагнозов. Ситуация требовала привлечения новых методов для тонкой идентификации и типирования вирусных изолятов [103,104].
Идентификация рабдовирусов рыб на основе анализа генома
Применение клонирования и секвенирования генов рабдовирусов рыб позволило существенно продвинуться вперед в изучении молекулярной структуры и механизмов изменчивости вируса [87]. В настоящее время эти методы все шире используются для диагностических целей [34,36, 37, 38]. Метод молекулярной гибридизации. Сущность метода основана на идентификации генома вирусов с использование специфических ДНК зондов [80]. Изучение генома SVCV было начато еще четверть века назад [76, 92] и продолжено в сравнительных исследованиях с другими рабдовирусами после весьма длительного перерыва [38, 42]. Ahne et al. (1998) использовали данные Bjorklund et al. (1996) для создания зонда, комплементарного мРНК G-гена европейского референтного штамма Fijan вируса SVC и разработки на его основе метода RPA. Метод надежно отличал SVCV от PFRV и выявил существование у первого генетических вариантов (гаплотипов). Опираясь на опубликованные последовательности М- и G-генов SVCV М. Rossius, G-gene sequence, GenBank accession No. Z37505; [41, 120,] Oreshkova et al. (1995, 1999) предложили первые варианты методов дот-блот гибридизации и RT-PCR для выявления вируса в культуре клеток и патологическом материале от рыб, a Koutna et al. (2003) разработали высоко чувствительный метод детектирования вируса с помощью гнездовой RT-PCR. Deering, R.E. с соавторами (1991) использовали метод дот-гибридизации для обнаружения РШС вируса IHN в пробах органов экспериментально зараженных мальков. В качестве ДНК зонда использовали фаг М13, несущий вставки, комплементарные гену нуклеопротеина рабдовирусов рыб. Чувствительность метода составляла 80 нг вирусной РНК, выделенной из проб органов, инфицированных вирусом. Была установлена корреляция данных по выделению вируса IHN в культуре клеток и выявлению его антигена методами флуоресцирующих антител и дот-гибридизации [72]. Hiney, M. (1998) с сотрудниками использовали метод дот-гибридизации in situ для обнаружения РНК вируса VHS в гистосрезах органов инфицированных рыб. В качестве РНК зонда авторы использовали, меченые S или Н3 рекомбинантную плазмиду, содержащую 96% кодирующей последовательности нуклеопротеина вируса VHS. Сравнительная оценка результатов обнаружения РНК вируса ВВК при помощи гибридизации in situ и выявление специфического антигена вируса иммунопероксидазньтм методом показала, что оба метода имеют одинаковую чувствительность.
Однако гибридизация in situ дает более четкие результаты и позволяет определять малое количество инфицированных клеток из общего числа. Это дает преимущество в диагностике на ранней стадии инфекции, когда в инфекционный процесс вовлечено небольшое количество клеток [114]. В другой работе Leong, J.С. (1995) с сотрудниками использовали метод гибридизации in situ для изучения репродукции изолятов вируса IHN в ж органах инфицированных рыб. С этой целью авторы использовали меченые радиоактивным тритием одноцепочечные РНК зонды, комплементарные пяти различным генам рабдовирусов рыб (N, Р, М, G и L). Был обнаружен высокий уровень репликации штамма IHN в головном мозге, печени, селезенке рыб. При этом сигналы, полученные с зондами, специфичными к мРНК, распределялись диффузно в инфицированных клетках. Таким образом, гибридизацию in situ можно применять для ретроспективной диагностики, а также для исследования молекулярных механизмов патогенеза инфекции in vivo с использованием РНК зондов, комплементарных различным генам рабдовирусов рыб. Основные работы по созданию молекулярно-генетических методов диагностики инфекции велись в референтной лаборатории МЭБ по SVC (г. Веймут, Англия). Сотрудниками лаборатории впервые для данного вируса были разработаны методы полугнездовой ШДР, гибридизации in situ и обратной гибридизации [54, 55]. Однако следует отметить, что, обладая набором важных достоинств, перечисленные выше методы не были свободны от ряда нежелательных элементов, ограничивающих их использование на практике. А именно: работали только в связке с методом культуры клеток, что удлиняло процедуру постановки диагноза (RPA, гибридизация in situ и дот-блот), требовали применения радиоактивной метки (RPA) или основывались на детектировании сравнительно высоко вариабельных G- и М-генов вируса, что теоретически уменьшало скрининговые возможности методов (ПЦР-методы и обратная гибридизация). В 2001 г. в GenBank были независимо депонированы две полные геномные последовательности референтного европейского штамма Fijan (синонимы: S 30, АТСС VR 1390) вируса SVC (accession numbers U18101, AJ318079) [26]. Stone et al. (2003) использовали их при выборе праймеров для первого филогенетического исследования группы везикуловирусов рыб из 36 изолятов, включавших 15 изолятов SVCV из государств Европы, Китая и бывшего СССР. Компьютерный анализ кДНК средней части G-гена размером 550 пн позволил разделить исследованные изоляты на четыре геногруппы (I-IV). При этом изоляты SVCV вошли в геногруппу I, которая, в свою очередь, распадалась на четыре генетические подгруппы.
Представителей каждой подгруппы, как правило, связывала общая география происхождения, корреляции с видами рыб-хозяев установлено не было. Применяемые лабораторные методы диагностики ВВК все еще остаются трудоемкими и недостаточно эффективными. За последние годы накапливается все больше сообщений о применении ПЦР в диагностике болезни [40, 42,43, 46]. В настоящее время ОТ-ГЩР уже широко используется в мире для обнаружения фрагментов генома РНК-содержащих вирусов [101, 107, 139, 141, 142, 149]. Chiou, P.P. (1995) с сотр. сообщили об обнаружении РНК вируса IHN с использованием ОТ-ПЦР. Для амплификации использовали гнездовые праймеры, фланкирующие ген нуклеопротеина вируса IHN [48]. При исследовании проб органов рыб, для которых диагноз был подтвержден методами МФА и биопробой, была установлена 100% сопоставимость результатов. Чувствительность метода составляла 8 пикограмм РНК вируса IHN. Кроме того, с помощью ПЦР можно проводить молекулярно-эпизоотологические исследования при анализе вирулентных штаммов и полевых изолятов без предварительной адаптации к клеточным культурам [56]. Метод ПЦР применяют также и для штаммовой дифференциации вируса VHS [51]. Estepa, А (1995) сообщил о применении ПЦР для исследования штаммов вируса VHS, выделенных от рыб в Испании. Метод ПЦР был использован и для определения генотипов рода везикуловирусов, распространенных на большинстве континентах мира [64]. Guillou, J. P. (1999) описал чувствительный и быстрый метод ОТ-ПЦР для определения различных серотипов возбудителя VHS. Шестьдесят изолятов были успешно определены при помощи ОТ-ПЦР и Саузерн блот гибридизации. Сравнение результатов, полученных с помощью метода флюоресцирующих антител и ОТ-ПЦР показало, что ОТ-ПЦР выявляет вирусную РНК даже через 3 суток после заражения [89].
Выделение РНК с помощью гуанидин изотиоцианата натрия
К 100 мкл вируссодержащего лизата добавляли 1 мл 6М раствора гуанидин изотиоцианата натрия. Затем последовательно добавляли 0,1 мл 2М Na-ацетата, (рН 4,0) 0,5 мл фенола и 0,2 мл хлороформа, тщательно перемешивали 30 сек и центрифугировали при 10000 g 20 мин при 4 С. РНК из водной фазы осаждают изопропанолом при -20С не менее одного часа и центрифугировали при 10000 g 20 мин. Полученный осадок РНК растворяли в 0,3 мл раствора 6М раствора гуанидин изотиоцианата натрия [44, 49] и осаждали добавлением 0,6 объема изопропанола в течение 1 часа. Осадок РНК промывали 75% этанолом и растворяли в 50 мкл стерильной бидистиллир о ванной воды. Синтез кДНК и клонирование проводили с использованием реагентов для синтеза кДНК, мечения биотином и выявления биотиновых групп (фирма "Вектор-Биопродукт" (пос. Кольцове, Новосибирская обл.), а также наборов фирм «Promega» и «Fermentas». В качестве затравок использовали «рассеянную затравку», а также олигонуклеотиды длиной 19-20 оснований, комплементарные последовательностям N и М генов вируса ВВК. Клетки Jm-109, выращенные до ранней логарифмической стадии роста (ОД550 = 0,3) в объеме 100 мл, охлаждали, собирали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин при +4 С. Удаляли супернатант и суспендировали в 50 мл ледяного буфера (50 мМ СаС12 10 мМ трис-НО, рН 8,0), выдерживали 15 мин, центрифугировали, удаляли супернатант и ресуспендировали в 6 мл того же буфера. 0,2 мл суспензии клеток смешивали с 30 иг плазмидной ДНК, инкубировали при температуре 42С в течение 2 минут, после чего добавляли 1 мл LB и оставляли на 1 час при 37 С без перемешивания. Высевали на селективную среду по 0,2 мл суспензии на чашку [59].
Для мечения ДНК биотином и выявления биотиновых групп использовали наборы фирмы "Вектор-Биопродукт" (пос. Кольцове, Новосибирская обл.). К 50 мкл водного раствора ДНК (30-40 мкг) добавляли равный объем 1 М 4-аминооксибутиламина и прогревали смесь на кипящей водяной бане 7 мин с последующим охлаждением во льду. Процедуру повторяли еще раз, затем модифицированную ДНК отделяли гель-фильтрацией на колонке с Sephadex G-50. После этого кДНК добавляли раствор N-гидроксисуксинимидного эфира е- аминокапроилбиотина, смесь выдерживали 1,5 ч, затем отделяли биотинилированный ДНК-зонд на сефадексе G-50. Для гибридизации с биотинилированными ДНК-зондами образцы вирусных РНК, выделенные из инфицированной культуры клеток или из органов рыб, наносили на фильтры. Дот-гибридизацию вели при 65 С в растворе: 6 х SSC, 5 х Денхардт, 0,5% SDS, 0,05 мг/мл денатурированной ДНК лосося, ДНК-зонд в концентрации ОД мкг/мл. Биотиновые группы на фильтрах выявляли с помощью конъюгата стрептавидина со щелочной фосфатазой и красителей 5-бром-3-индолилфосфата и нитротетразолевого синего. Плотность окрашенных пятен после дот-гиб-ридизации измеряли в относительных единицах на денситометре ДО-1 (Приборостроительный завод г. Изюм, Харьковская обл.). Суммарную РНК (Імкг) гибридизовали с 15 пикоМ праймера и транскрибировали 60 мин при 42 градусах в реакционной смеси объемом 20 мкл, содержащих 10-100 единиц обратной транскриптазы ( AMV или М-MLV фирм Promega, Fetmentas, Вектор) , 1 шМ каждого dNTP и 4 единицы Rnasin. Раствор РШС/кДНК гибрида (10 мкл) амплифицир овали в 50 мкл реакционной смеси на термоциклере Hybaid (Англия) по следующей программе: 5 циклов (денатурация 94 С - 60 сек, отжиг 45( С - 90 сек, пауза 50 С - 20 сек, элонгация 72 С - 90 сек) следующие 30 циклов денатурация и элонгация проводились 30 сек и 60 сек соответственно; для G-L праймеров - 30 циклов ( денатурация 94 С -50 сек, отжиг 45 С - 90 сек, элонгация 72 С - 120 сек). Аликвоты ПЦР продуктов от 5 до 10 мкл разрезали соответствующими ферментами рестрикции и разделяли в 1,5 - 2,0% агарозном геле. Учет результатов проводили по размеру ПЦР-продуктов с помощью электрофореза в агарозном геле. На основании размеров и расстояний пробегов маркерных ДНК (рестрицир о ванная Hindlll ДНК фага лямбда), вычисляли размеры исследуемых фрагментов ДНК [59]. Дифференциацию штаммов и изолятов вируса ВВК проводили при помощи рестрикционного анализа ПЦР продуктов гена нуклеопротеина или псевдогена. Полученный продукт ПЦР, расщепляли различными эндонуклеазами рестрикции, специально подобранными для дифференциации штаммов вируса ВВК.
Разработка тест-системы для идентификации вируса ВВК с помощью полимеразной цепной реакции
К 100 мкл вируссодержащего лизата добавляли 1 мл 6М раствора гуанидин изотиоцианата натрия. Затем последовательно добавляли 0,1 мл 2М Na-ацетата, (рН 4,0) 0,5 мл фенола и 0,2 мл хлороформа, тщательно перемешивали 30 сек и центрифугировали при 10000 g 20 мин при 4 С. РНК из водной фазы осаждают изопропанолом при -20С не менее одного часа и центрифугировали при 10000 g 20 мин. Полученный осадок РНК растворяли в 0,3 мл раствора 6М раствора гуанидин изотиоцианата натрия [44, 49] и осаждали добавлением 0,6 объема изопропанола в течение 1 часа. Осадок РНК промывали 75% этанолом и растворяли в 50 мкл стерильной бидистиллир о ванной воды. Синтез кДНК и клонирование проводили с использованием реагентов для синтеза кДНК, мечения биотином и выявления биотиновых групп (фирма "Вектор-Биопродукт" (пос. Кольцове, Новосибирская обл.), а также наборов фирм «Promega» и «Fermentas». В качестве затравок использовали «рассеянную затравку», а также олигонуклеотиды длиной 19-20 оснований, комплементарные последовательностям N и М генов вируса ВВК. Клетки Jm-109, выращенные до ранней логарифмической стадии роста (ОД550 = 0,3) в объеме 100 мл, охлаждали, собирали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин при +4 С. Удаляли супернатант и суспендировали в 50 мл ледяного буфера (50 мМ СаС12 10 мМ трис-НО, рН 8,0), выдерживали 15 мин, центрифугировали, удаляли супернатант и ресуспендировали в 6 мл того же буфера. 0,2 мл суспензии клеток смешивали с 30 иг плазмидной ДНК, инкубировали при температуре 42С в течение 2 минут, после чего добавляли 1 мл LB и оставляли на 1 час при 37 С без перемешивания. Высевали на селективную среду по 0,2 мл суспензии на чашку [59]. Для мечения ДНК биотином и выявления биотиновых групп использовали наборы фирмы "Вектор-Биопродукт" (пос. Кольцове, Новосибирская обл.). К 50 мкл водного раствора ДНК (30-40 мкг) добавляли равный объем 1 М 4-аминооксибутиламина и прогревали смесь на кипящей водяной бане 7 мин с последующим охлаждением во льду.
Процедуру повторяли еще раз, затем модифицированную ДНК отделяли гель-фильтрацией на колонке с Sephadex G-50. После этого кДНК добавляли раствор N-гидроксисуксинимидного эфира е- аминокапроилбиотина, смесь выдерживали 1,5 ч, затем отделяли биотинилированный ДНК-зонд на сефадексе G-50. Для гибридизации с биотинилированными ДНК-зондами образцы вирусных РНК, выделенные из инфицированной культуры клеток или из органов рыб, наносили на фильтры. Дот-гибридизацию вели при 65 С в растворе: 6 х SSC, 5 х Денхардт, 0,5% SDS, 0,05 мг/мл денатурированной ДНК лосося, ДНК-зонд в концентрации ОД мкг/мл. Биотиновые группы на фильтрах выявляли с помощью конъюгата стрептавидина со щелочной фосфатазой и красителей 5-бром-3-индолилфосфата и нитротетразолевого синего. Плотность окрашенных пятен после дот-гиб-ридизации измеряли в относительных единицах на денситометре ДО-1 (Приборостроительный завод г. Изюм, Харьковская обл.). Суммарную РНК (Імкг) гибридизовали с 15 пикоМ праймера и транскрибировали 60 мин при 42 градусах в реакционной смеси объемом 20 мкл, содержащих 10-100 единиц обратной транскриптазы ( AMV или М-MLV фирм Promega, Fetmentas, Вектор) , 1 шМ каждого dNTP и 4 единицы Rnasin. Раствор РШС/кДНК гибрида (10 мкл) амплифицир овали в 50 мкл реакционной смеси на термоциклере Hybaid (Англия) по следующей программе: 5 циклов (денатурация 94 С - 60 сек, отжиг 45( С - 90 сек, пауза 50 С - 20 сек, элонгация 72 С - 90 сек) следующие 30 циклов денатурация и элонгация проводились 30 сек и 60 сек соответственно; для G-L праймеров - 30 циклов ( денатурация 94 С -50 сек, отжиг 45 С - 90 сек, элонгация 72 С - 120 сек). Аликвоты ПЦР продуктов от 5 до 10 мкл разрезали соответствующими ферментами рестрикции и разделяли в 1,5 - 2,0% агарозном геле. Учет результатов проводили по размеру ПЦР-продуктов с помощью электрофореза в агарозном геле. На основании размеров и расстояний пробегов маркерных ДНК (рестрицир о ванная Hindlll ДНК фага лямбда), вычисляли размеры исследуемых фрагментов ДНК [59]. Дифференциацию штаммов и изолятов вируса ВВК проводили при помощи рестрикционного анализа ПЦР продуктов гена нуклеопротеина или псевдогена.
Полученный продукт ПЦР, расщепляли различными эндонуклеазами рестрикции, специально подобранными для дифференциации штаммов вируса ВВК.
