Введение к работе
1 1.1 Актуальность темы
Миксоматоз (лат. — Mixomatosis cuniculi; англ. — Infectious myxoma of rabbits) — остро протекающая, высококонтагиозная болезнь кроликов, характеризующаяся воспалением слизистых оболочек и появлением студенисто- гнойных отеков в области головы, ануса, гениталий и кожи [2].
К вирусу высокочувствительны как домашние, так и дикие кролики независимо от возраста. Болезнь часто заканчивается летальным исходом. Смертность может достигать 95-100% поголовья [1].
C момента открытия миксоматоза кроликов в 1896 г. и до настоящего времени, благодаря высокой контагиозности вируса миксомы и способности к быстрому распространению, болезнь стали регистрировать практически во всех странах мира [2].
Однако основное значение в распространении возбудителя миксоматоза в природе имеют кровососущие насекомые, такие как комары, клещи и блохи, в организме которых вирус сохраняется до 7 месяцев, создавая очаг возбудителя в природе [1].
При этом единственный в России надежный метод выявления вируса миксомы кроликов - биопроба на кроликах с последующим выделением вируса в культуре клеток, что делает актуальной задачу разработки новых методов лабораторной диагностики миксоматоза, позволяющих выявлять вирус в течение короткого времени из различных биологических материалов и объектов ветеринарного надзора (кровь, кожа, шерсть, смывы, насекомые и т.п.) и контролировать распространение и изменчивость изолятов вируса.
Настоящая работа посвящена разработке чувствительных и специфических методов выявления генома вируса миксомы кроликов с помощью различных модификаций полимеразной цепной реакции (классическая, мультиплексная, а также ПЦР в режиме реального времени).
В целом ряде случаев во время эпизоотий возникала необходимость исследования патологического материала, поступающего на экспертизу в ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, как на миксоматоз, так и на ВГБК. Оба вируса поражают одни и те же виды животных, обладают перекрывающимися ареалами и вызывают инфекции со сходными клиническими проявлениями, что явилось побудительным мотивом разработки мультиплексной ПЦР для
одновременного выявления геномов вирусов миксомы кроликов и геморрагической болезни кроликов.
1.2 Степень разработанности проблемы Изучению вируса миксомы кроликов посвящено большое количество работ отечественных и зарубежных исследователей. Лабораторное подтверждение диагноза на миксоматоз в России проводят с помощью серологических методов, электронной микроскопии и постановкой биопробы на кроликах с последующим выделением вируса в культуре клеток. Эти методы являются длительными, трудоемкими и далеко не всегда позволяют дифференцировать данную болезнь от оспы кроликов [1,2,6].
За рубежом для выявления генома вируса миксомы широко используется метод ПЦР. Данный метод является не только необходимой диагностической реакцией, но и этапом для последующего определения первичной структуры фрагментов генома для дифференциации штаммов и изолятов вируса, а также изучения роли отдельных генов в патологии и эволюции вируса [3,4,5].
Однако в отечественной ветеринарной практике нет данных о разработке тест-систем для выявления генома вируса миксомы кроликов, что затрудняет диагностические исследования и не позволяет провести генетический анализ циркулирующих в Российской Федерации полевых изолятов вирусов.
1.3 Цели и задачи исследования Цель настоящего исследования - разработка методов выявления генома вирусов миксомы кроликов на основе различных вариантов ПЦР.
В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:
на основе анализа нуклеотидной последовательности участков генома вируса миксомы кроликов рассчитать и синтезировать специфичные праймеры;
оптимизировать условия постановки ПЦР и разработать тест-систему на основе ПЦР с электрофоретической детекцией для выявления генома вируса миксомы;
разработать тест-систему для выявления геномов вирусов миксомы кроликов методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени;
определить специфичность и чувствительность разработанных тест-систем при идентификации генома вируса миксомы кроликов.
провести филогенетический анализ вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса миксомы кроликов.
1.4 Научная новизна исследований
Впервые определены нуклеотидные последовательности фрагментов гена M022L двух отечественных вакцинных штаммов (В-82 и Микс-98) и четырёх полевых изолятов вируса миксомы кроликов, выделенных в различных регионах РФ в 2009-2012 гг.
Показано, что отечественные вакцинные штаммы В-82 и Микс-98 формируют отдельную ветвь филограммы с зарубежными штаммами RIAM, Borghi и отличаются от нуклеотидных последовательностей данного участка полевых изолятов вируса миксомы кроликов, выделенных в РФ.
Установлено, что полевые изоляты вируса миксомы кроликов, выделенные в период с 2009-2012 гг. в разных субъектах Российской Федерации, идентичны друг другу, имеют наибольшее сходство (99 %) с группой вирусов, выделенных на территории Европы (шт. Lausanne, изолятами из Греции GR-La1, GR-Th1, GRS/07).
Впервые в России разработан комплекс методов для идентификации геномов вирусов миксомы кроликов, фибромы Шоупа и геморрагической болезни кроликов на основе различных вариантов ПЦР (ПЦР в формате электрофоретической детекции, ПЦР в режиме реального времени).
1.5 Практическая и теоретическая значимость
Разработан метод идентификации генома вируса миксомы кроликов методом ПЦР в формате электрофоретической детекции.
Разработан метод идентификации геномов вирусов миксомы кроликов и фибромы Шоупа методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени.
Разработан метод для выявления геномов вирусов миксомы и геморрагической болезни кроликов методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени.
Разработанная тест-система для выявления генома вируса миксомы кроликов методом ПЦР в формате электрофоретической детекции применена для мониторинговых исследований 45 проб от домашних кроликов из частных хозяйств, отобранных в различных регионах РФ (Московской, Смоленской, Тверской и Ивановской областях и др.) в период вспышки миксоматоза. В 20 пробах обнаружена ДНК вируса миксомы кроликов. Данные ПЦР подтверждены результатами биопробы.
Разработаны и утверждены академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии Смирновым А.М.: «Методические положения по выявлению ДНК вируса миксомы кроликов методом полимеразной цепной реакции» 16.11.2011, «Методические положения по выявлению нуклеиновой кислоты вируса миксомы кроликов и фибромы Шоупа методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени» 12.12.2012, «Методические положения по выявлению нуклеиновых кислот вирусов геморрагической болезни кроликов и миксомы кроликов методом мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени» 28.5.2012.
1.6 Соответствие содержания диссертации паспорту специальности, по которой она рекомендуется к защите
В соответствии с формулой специальности 03.02.02 Вирусология, охватывающей проблемы исследования вирусов, их химического состава, механизмов их размножения, молекулярно-генетических аспектов их взаимоотношений с клеточными организмами, а также проблемы инфекционности вирусов, разработки средств диагностики, вызываемых вирусами заболеваний, включая области исследований: изучение химического состава, структуры и строения вирусов, антигенных свойств вирусов; исследование особенностей репродукции вирусов и их взаимоотношений с восприимчивыми к вирусам клетками; стратегию вирусного генома; разработку диагностики и совершенствование лабораторных диагностических систем в диссертационной работе представлены данные по разработке тест - системы для выявления генома вируса миксомы кроликов методом ПЦР с электрофоретической детекцией, тест - система для выявления генома вируса миксомы кроликов и фибромы Шоупа методом ПЦР в режиме реального времени и тест-система для выявления геномов вирусов миксомы и геморрагической болезни кроликов методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени. Приведены результаты секвенирования и филогенетического анализа фрагментов генома вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса миксомы кроликов, выделенных в РФ.
Результаты научного исследования соответствуют пунктам паспорта специальности - 2, 3,4, 6,10.
1.7 Апробация работы
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (2010-2013 гг.). Материалы диссертации доложены на Международной научно- практической конференции «Молекулярная диагностика 2010» (г. Москва, 2010 г.), Международной научно-практической конференции «Задачи ветеринарной науки в реализации доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации» (г. Покров, 2011 г.), Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина XXI века. Инновации, опыт, проблемы и пути их решения» (г. Ульяновск, 2011 г.).
1.8 Публикация научных исследований По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 1 статья опубликована в журнале «Ветеринарная патология», включенном в перечень изданий, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.
1.9 Основные положения диссертации, выносимые на защиту: 1.Тест-система на основе ПЦР с электрофоретической детекцией для идентификации генома вируса миксомы кроликов позволяет определять наличие генома возбудителя в пробах крови, органов и тканей больных животных
л л
c аналитической чувствительностью до 0,5 Ig ТСГО50/см или 0,5 Ig ЬЭ50/см .
2. Тест-система для идентификации геномов вируса миксомы кроликов и вируса фибромы Шоупа методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени позволяет быстро и надежно выявлять вирусы с
л л
аналитической чувствительностью до - 0,5 Ig ТСГО50/см или -0,5 lg LD 50/см в одном образце.
-
Тест-система для выявления геномов вирусов миксомы и геморрагической болезни кроликов методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени позволяет быстро и надежно выявлять ДНК вирусов с
л л
аналитической чувствительностью 0 Ig LD^/см и менее - 0,5 Ig ТСГО50/см при исследовании биоматериала на наличие ДНК вируса миксомы кроликов, а также
- 0,5 lg LD50^ при исследовании патологического материала на наличие РНК вируса геморрагической болезни кроликов.
-
Результаты филогенетического анализа вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса миксомы кроликов позволяющие утверждать, что отечественные вакцинные штаммы В-82 и Микс-98 и зарубежные штаммы
RIAM и Borghi формируют отдельную ветвь филограммы и отличаются от нуклеотидных последовательностей данного участка гена M022L полевых изолятов вируса миксомы кроликов, выделенных в период с 2009-2012 гг. в разных субъектах Российской Федерации, идентичных друг другу и имеющих наибольшее сходство (99 %) с группой вирусов, выделенных на территории Европы (шт. Lausanne, изолятами из Греции GR-Lal, GR-Thl, GRS/07).
1.10 Структура и объем диссертационной работы Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста и состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы, методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, список использованной литературы, включающий 13 отечественных и 98 иностранных источников и 2 интернет-ресурса, дополнена приложениями. Диссертация содержит 9 таблиц и 15 рисунков. В приложении представлены документы, подтверждающие достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.
