Введение к работе
Актуальность темы исследования. В связи с увеличением численности населения планеты все более масштабным становится распространение различных инфекционных заболеваний, особенно вирусной природы. Своевременная индикация возбудителей или маркеров инфекций у людей и животных способна предотвратить возникновение эпидемий и эпизоотии.
Глобальную проблему для населения Земли представляют вирусные гепатиты, в частности вирусный гепатит В (ВГВ). По оценкам Всемирной организации здравоохранения, более 600 тыс. человек ежегодно умирает от острой или хронической формы гепатита В (Шляхтенко Л.И., 2004; Ивашкин В.Т., 2006; MastE.E. et al., 1993). Учитывая продолжающийся рост заболеваемости ВГВ в связи с распространением наркомании, а также внутрибольничным инфицированием медицинских работников и доноров крови, проблема профилактики, диагностики и лечения ВГВ в России является одной из наиболее важных (Шахгильдян И.В. и др., 2004; Шаповалова И.В. и др., 2007; Colin J.F. et al., 1999).
В Российской Федерации основной метод этиологической лабораторной диагностики ВГВ - серологический. В настоящее время «золотым стандартом» в диагностике ВГВ, помимо клинико-биохимических признаков, является выявление поверхностного антигена ВГВ - HBsAg.
За последние 5-10 лет значительно возросла чувствительность и специфичность существующих тест-систем. В качестве диагностического средства используются моноклональные антитела, полученные с помощью гибридомной технологии, и сывороточные поликлональные антитела, полученные от животных-доноров. Производство диагностических антител к HBsAg является длительным и дорогостоящим. Стоимость 1 г монокло-нальных антител к HBsAg (производства ЗАО «Вектор-Бест» (Россия) составляет около 1500 рублей. Использование птиц, в частности перепелов, в качестве продуцентов диагностических иммуноглобулинов экономически более эффективно, чем использование антител, полученных методом гибридомной технологии, и от различных видов животных, так как финансовые затраты на единицу массы получаемых специфических иммуноглобулинов значительно ниже (табл. 1).
Таблица 1. Эффективность использования различных видов жи-.
вотиых-продуцентов диагностических иммуноглобулинов (_
Эти особенности побудили нас рассмотреть возможность использования диагностических препаратов на основе желточных иммуноглобулинов (Ig Y, от англ. yolk) от различных видов птиц (гусей, уток, кур, перепелов и др.). Иммуноглобулины птиц не обладают неспецифическим взаимодействием с компонентами сыворотки крови человека, т.к. птицы эволюционно представляют собой отдельную ветвь развития. Кроме того, взятие крови у лабораторных животных представляет сложную, болезненную процедуру, а получение яиц от иммунизированных птиц, которые содержат специфические иммуноглобулины, является физиологичным и неинвазивным.
Помимо вышеперечисленных преимуществ и особенностей, используя птиц в качестве продуцентов биологического сырья для изготовления диагностических и лечебно-профилактических препаратов, становится возможным круглогодичное получение недорогих диагностических иммуноглобулинов, а также осуществление быстрой замены продуцента с минимальным сроком восстановления его продуктивности.
Целью исследования является разработка тест-системы на основе желточных иммуноглобулинов иммунизированных перепелов {Coturnix со-turnixjaponicd) для индикации HBsAg.
Задачи исследования:
Разработать биологическую модель - продуцента диагностических иммуноглобулинов.
Определить влияние препаратов для иммунизации и факторов окружающей среды на биологическую модель.
Сформировать опытный образец тест-системы для индикации HBsAg на основе желточных иммуноглобулинов и разработать схему его получения.
Провести лабораторные испытания разработанной тест-системы на основе желточных антител для индикации HBsAg и оценить её чувствительность и специфичность.
Научная новизна работы состоит в том, что впервые для нужд медицины для получения диагностических иммуноглобулинов были использованы перепела вида Coturnix coturnix japonica. Впервые разработана методика иммунизации самок перепелов HBsAg с последующим получением в качестве конечного продукта специфических антител. Впервые создана тест-система на основе желточных иммуноглобулинов для индикации HBsAg с высокой чувствительностью и специфичностью и разработана схема получения лабораторного образца диагностической тест-системы на основе Ig Y для индикации HBsAg.
Научно-практическая значимость работы. На основании проведённых исследований разработана тест-система для этиологической лабораторной диагностики ВГВ. Разработана биологическая модель и экспериментально обоснована её биологическая и диагностическая целесообразность. Разработана схема получения лабораторного образца диагностической
тест-системы на основе Ig Y для индикации HBsAg.
Разработаны методические рекомендации «Создание биологической модели для получения диагностических иммуноглобулинов» (2009), предназначенные для вирусологов, микробиологов и других специалистов, работающих в области создания иммунодиагностических средств медицинского и ветеринарного назначения.
Разработанные рекомендации и фактический материал используются в качестве теоретического обоснования и практического воплощения при проведении научно-исследовательских работ в Государственном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства Российской академии сельскохозяйственных наук», а также при обучении слушателей и курсантов Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия имени СМ. Кирова».
Основные положения, выносимые на защиту:
Применение перепелов вида Coturnix coturnixjaponica для получения специфических диагностических иммуноглобулинов к HBsAg, исходя из их иммунофизиологических показателей и возможности поддержания статуса SPF (specific pathogen free - свободный от специфических патогенов), является обоснованным.
Тест-система на основе желточных иммуноглобулинов иммунизированных перепелов является высоко эффективной для диагностики ВГВ.
Разработанная схема производства диагностической тест-системы для индикации HBsAg на основе Ig Y иммунизированных перепелов применима для практического использования.
Апробация работы. Основные результаты исследования были доложены и обсуждены на двух Всероссийских конференциях: «Современные проблемы 'здоровья населения и военнослужащих» (СПб., 2007 г.), «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (СПб., 2008 г.), IV международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (СПб., 2008 г.), на научной конференции Северо-западного научно-методического центра Российской академии сельскохозяйственных наук «Нанотехнологии в зоотехнии и ветеринарной медицине: реализация и перспективы» (СПб., 2008 г.), V съезде общества биотехнологов России имени Ю.А. Овчинникова (М., 2008 г.), XVI конференции Российского отделения Всемирной научной ассоциации по птицеводству «Современное производство: исследования и инновации» (М., 2009 г.), заседании отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в Санкт-Петербурге и Ленинградской области (СПб., 2009 г.) и XIV Европейском конгрессе по биотехнологии (Барселона, Испания, 2009 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 4- в изданиях, рекомендованных ВАК. Получены 3 удостоверения на рационализаторские предложения (№11522/11, № 11523/11, № 11524/11 от 13 ноября 2008 г.) и справка о регистрации в Федеральном институте промышленной собственности заявления о выдаче патента Российской Федерации на изобретение: «Способ получения диагностических иммуноглобулинов для выявления HBsAg» (вх. № 009557, per. №2009107142 от 27.02.2009 г.).
Личный вклад автора. Автором лично сформулированы цель и задачи исследования, составлен план экспериментов, осуществлён сбор и анализ научной информации по теме исследования. Самостоятельно спланированы и проведены исследования, систематизация, обработка и анализ полученных результатов.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 130 страницах компьютерного набора и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы исследования и результаты), обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложений.
Список литературы включает 207 источников, из них 92 отечественных и 115 иностранных.
Текст диссертации содержит 22 таблицы, 29 рисунков, 2 приложения.
