Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 11
2.1. Биологические особенности цирковируса свиней второго типа 12
2.2. Методы выделения и культивирования ЦВС-2 16
2.3. Патологии, обусловленные ЦВС-2 (цирковирусные болезни). 24
2.4. Диагностика, профилактика и меры борьбы с ЦВС-2 28
3. Материалы и методы 35
4. Результаты исследований 49
4.1. Получение и характеристика рекомбинантного антигена ORF2 ЦВС-2 49
4.1.1. Создание генноинженерных конструкций для экспрессии генов нуклеокапсидного белка ORF2 ЦВС-2 в клетках насекомых 50
4.1.2. Очистка и иммунохимическая характеристика рекомбинатного нуклеокапсидного ORF2 белка 57
4.2. Выбор и характеристика конъюгата 62
4.3. Разработка непрямого твердофазного ИФА для выявления антител к цирковирусу свиней второго типа 65
4.3.1. Отработка условий постановки ИФА 65
4.3.2. Оптимизация условий проведения ИФА при исследовании проб в одном разведении 68
4.3.3. Оценка диагностических параметров разработанной иммуноферментной тест-системы. 72
4.4. Разработка технологии изготовления ИФА-набора для выявления антител к цирковирусу свиней второго типа («ЦИРКО-СЕРОТЕСТ») 76
4.4.1. Получение и характеристика положительного и отрицательного контролей для ИФА-набора 77
4.4.2. Определение стабильности специфических компонентов ИФА-набора при хранении 77
4.4.3. Оптимизация комплектации ИФА-набора и разработка инструкции по его применению 80
4.4.4. Контроль воспроизводимости результатов, полученных с помощью ИФА-набора «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ» 85
4.5. Применение ИФА-набора «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ» для эпизоотологического мониторинга цирковирусной инфекции в свиноводческих хозяйствах 87
5. Обсуждение 91
6. Выводы 99
7. Практические предложения 100
8. Список использованной литературы 101
9. Приложение .' 118
- Патологии, обусловленные ЦВС-2 (цирковирусные болезни).
- Очистка и иммунохимическая характеристика рекомбинатного нуклеокапсидного ORF2 белка
- Оценка диагностических параметров разработанной иммуноферментной тест-системы.
- Применение ИФА-набора «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ» для эпизоотологического мониторинга цирковирусной инфекции в свиноводческих хозяйствах
Введение к работе
Цирковирус свиней второго типа (ЦВС-2) является возбудителем болезни поросят, впервые зарегистрированной в Канаде в 1991 году, и в связи с поражением различных систем организма названной «синдромом послеотъем-ного мультисистемного истощения» (СПМИ). Болезнь характеризуется проявлением комплекса клинических признаков, включающих потерю веса, отставание в росте, одышку, диарею, желтуху и пневмонию. В естественных условиях СПМИ чаще отмечают у поросят 6-15 недельного возраста, у которых регистрируют наибольший отход, при этом пик заболеваемости приходится на 10-ти недельный возраст. У инфицированных животных вирус обнаружен в клетках лимфоидной системы (макрофагах, дендритных клетках, Т- и В- лимфоцитах), являющихся клетками-мишенями для ЦВС-2 (Орлянкин Б.Г. и др., 2002; Clarck E.G., 1997; Allan G.M. et al., 1998; Mankertz A. et al., 2000; O'Connor B. et a.l, 2001 и др.). Интенсивное размножение вируса в клетках иммунной системы приводит их к гибели и развитию иммунодефицитного состояния. У таких животных создаются условия для возникновения вторичных инфекций, вызываемых условно-патогенными микробами (Segales J. et al., 2004). В настоящее время ЦВС-2 широко распространен практически во всех странах мира и рассматривается как один из основных (первичных) патогенов, вызывающих поражения легких и развитие респираторных болезней свиней (Орлянкин Б.Г. и др., 2005; Halbur R.G., 1998).
ЦВС-2 представляет собой ДНК-содержащий вирус, относящийся к роду Circovirus семейства Circoviridae, к которому принадлежат вирус анемии цыплят (типовой вирус), ЦВС первого типа (ЦВС-1), являющийся нецитопато-генным контаминантом перевиваемой культуры клеток почек поросят; а также цирковирусы попугаев и голубей. В 1999 г. сообщалось о выделении от носителей из Японии и Западной Африки первого цирковируса человека (Hironori М. et al., 1999; Mushahwar I.K. et al., 1999).
Экономический ущерб, наносимый свинокомплексам болезнями, ассоциированными с ЦВС-2, может быть значительным, что связано с потерями от недополучения продукции и высокой смертностью поросят послеотъемного периода (Sato К. et al., 2001; Harding J.C., 2004). Кроме того, в связи с возрастающим интересом в плане использования свиней в качестве доноров, ЦВС-2 может также представлять собой потенциальную угрозу здоровью людей при передаче через орган, ткань или клеточную трансплантацию (Сатина Т.А., 2003).
Распространение ЦВС-2 в свиноводческих хозяйствах различных стран мира оценивают по обнаружению вирус-специфических антител в сыворотке крови свиней методами иммуноферментного анализа (ИФА), непрямой имму-нофлюоресценции (РИФ) и выявлению вируса, вирусного антигена или вирусной ДНК в тканях и органах поросят методами электронной микроскопии, гибридизации in situ, полимеразной цепной реакции (ПЦР), а также иммуногисто-химически (Onuki A. et al., 1999; Choi С. et al., 2000; Larochelle R. et al., 2000; Sibila M. et al., 2004; Racine S. et al., 2004 и др.). В нашей стране в ЗАО «НПО НАРВАК» и в ФГУ «ВНИИЗЖ» для обнаружения ЦВС-2 разработан и используется метод ПЦР (Кукушкин С.А. и др., 2005), однако этот метод достаточно трудоемок, требует дорогостоящей аппаратуры и квалифицированного персонала. В этой связи использование ИФА представляется наиболее эффективным методом мониторинга цирковирусной инфекции в популяции свиней на территории РФ.
Известно, что одним из перспективных подходов к созданию иммуно-ферментных тест систем для серологических исследований является использование в качестве антигенов рекомбинантных белков. В геноме ЦВС-2 присутствуют две большие открытые рамки считывания ORF1 и ORF2, при этом ORF2 кодирует структурный белок вириона с молекулярной массой около 30 кД, который индуцирует синтез основной массы антител при инфицировании животных (Meehan В.М. et al., 1997; Truong С. et al., 2001). Таким образом, данный белок является самым подходящим антигеном для использования в ИФА.
В мире уже существуют аналогичные разработки иммуноферментных тест-систем (Walker I.W. et al., 2000; Nawagitgul P. et al., 2002; Blanchard P. et al., 2003; Changming L. et al., 2004), однако к началу наших исследований ни одна из них не обрела форму завершенного ИФА-набора, выпускаемого на регулярной основе.
Цель работы. Разработка иммуноферментной тест-системы и технологии производства ИФА-набора для выявления антител к цирковирусу свиней второго типа в сыворотках крови животных.
Основные задачи исследований;
Разработать технологию, получить и охарактеризовать рекомбинантный нуклеокапсидный белок ORF2 цирковируса свиней второго типа.
Разработать методику постановки, учета и интерпретации результатов непрямого твердофазного ИФА для выявления антител к ЦВС-2 в сыворотках крови животных.
Определить диагностическую ценность разработанной иммуноферментной тест-системы для выявления антител к ЦВС-2 в сравнении с методом аналогичной направленности.
На основе иммуноферментной тест-системы разработать технологию производства ИФА-набора. Для этого определить стабильность компонентов набора при хранении, разработать его оптимальную комплектацию и инструкцию по применению.
Провести испытание ИФА-набора по выявлению антител к ЦВС-2 в практических условиях с использованием сывороток крови свиней полученных от животных различных половозрастных групп.
6. Провести эпизоотологический мониторинг ЦВС-2 в отдельных свино
водческих хозяйствах РФ.
Научная новизна работы.
Разработана технология получения и очистки рекомбинантного белка ORP2 цирковируса свиней второго типа. На основе полученных и иммунохими-чески охарактеризованных специфических реагентов разработан метод непря-
мого твердофазного ИФА для выявления антител к цирковирусу свиней второго типа в сыворотке крови свиней. Оптимизированы условия проведения ИФА при исследовании сывороток крови свиней, взятых в одном разведении. В сравнительных исследованиях показана высокая чувствительность и специфичность разработанного теста и установлена положительная корреляция результатов, полученных с помощью ИФА и РИФ.
На основе иммуноферментной тест-системы разработана оптимальная комплектация и технология производства ИФА-набора. Установлена возможность длительного хранения компонентов ИФА-набора и его диагностическая эффективность в лабораторных исследованиях, направленных на выявление антител к ЦВС-2.
Практическая значимость исследований.
На основании результатов исследований разработан и внедрен в ветеринарную практику России диагностический ИФА-набор «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ» который целесообразно использовать при проведении массовых скрининговых исследований свинопоголовья для эпизоотологического мониторинга ЦВС-2. На изготовление и применение ИФА-набора «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ» разработана нормативно-техническая документация, утвержденная в установленном порядке (ТУ 9388-010-42418073-04).
Впервые проведены серологические исследования и получены данные о распространении ЦВС-2 в свиноводческих хозяйствах РФ.
Основные положения, выносимые на защиту.
Полученные экспериментальные данные позволяют вынести на защиту следующие основные положения:
результаты экспериментов по получению рекомбинантного белка ORF2 цирковируса свиней второго типа, разработке иммуноферментной тест-системы и созданию на ее основе ИФА-набора для выявления антител к ЦВС-2;
результаты испытаний ИФА в экспериментальных и практических условиях;
результаты эпизоотологического мониторинга ЦВС-2 в популяции свиней на территории Российской Федерации.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы до
ложены на 1-м Всероссийском совещании директоров ветеринарных лаборато-
І рий субъектов Российской Федерации (г.Брянск, 2004); научно-производствен-
ных совещаниях сотрудников ЗАО «НПО НАРВАК» (г. Москва, 2003 - 2005 гг.); межлабораторном совещании сотрудников Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН (г. Москва, 2006 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано три научные работы и одна принята в печать.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на
118 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, опи
сания материалов и методов исследований, собственных результатов ис
следований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений,
щ списка цитированной литературы и приложения. Материалы диссертации ил-
люстрированы 7 таблицами и 16 рисунками. Список литературы включает 165 источников (11 отечественных и 154 зарубежных авторов).
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Инфекционные респираторные болезни свиней широко распространены практически во всех странах мира с развитым свиноводством и причиняют значительный экономический ущерб. Одним из возбудителей такой инфекции является цирковирус свиней второго типа (ЦВС-2), представитель семейства Cir-coviridae.
Цирковирусы - это самые мелкие (~20 нм в диаметре), безоболочечные ДНК-содержащие вирусы. Семейство Circoviridae состоит из одного рода Cir-covirus, в состав которого входят цирковирусы свиней, вирус анемии цыплят (типовой вирус), а также цирковирусы попугаев, голубей и человека (Ignjatovic J., 1995; Miyata Н. et al.,1999; Mushahwar I.K. et al., 1999).
Впервые цирковирус свиней (ЦВС) был обнаружен и описан в 1974 году немецкими исследователями, как нецитопатогенный контаминант перевиваемой культуры клеток почки поросенка РК-15 и считался непатогенным агентом (Tischer I., Rasch R. et al., 1974). И лишь в 1994 году появилось сообщение о том, что ЦВС является причиной врожденного тремора у новорожденных поросят (Hines R.K et al., 1994). Исследователи из Канады и Северной Ирландии установили связь между ЦВС и новой болезнью, которая, в связи с поражением различных систем организма поросят, была названа синдромом послеотъемного мультисистемного истощения (СПМИ).
Было выявлено, так же, что ЦВС, вызывающий СПМИ, отличается по антигенным и генетическим признакам от непатогенного клеточного конта-минанта клеток РК-15 (Allan G.M. et al., 1998; Borel N., Burgi E., 2001; Ellis J., Hassard L., 1998; Meehan B.M. et al., 1998; Morozov I. et al., 1998). В связи с чем, «новый» патогенный вирус обозначили как ЦВС-2, а исходный непатогенный контаминант клеток РК-15, как ЦВС-1 (Allan G. et al., 1998; Meehan B.M. et al., 1998).
ЦВС-2 также ассоциирован с рядом патологических состояний свиней, включающих дерматит и синдром нефропатии (ДСНП), пролиферативно- нек-
ротизирующую пневмонию (ПНП) (Pesch S. et al., 2000), конгенитальный тремор типа АН (КТ - АН), перинатальный миокардит и нарушение репродукции (Harding J.C., 2004; Segales J. et al., 2004). Зачастую, цирковирусная инфекция отягощается дополнительными инфекциями, которые провоцируют более тяжелое течение болезни (Thomson J.R. et al., 2001; Choi С, Chae С, 2001; Segales J. etal., 1998).
Патологии, обусловленные ЦВС-2 (цирковирусные болезни).
В 1994 году появилось сообщение о том, что ЦВС является причиной .врожденного тремора у новорожденных поросят (Hines R.K., 1994).
В работе Stevenson G.W. с соавт. (2001), сообщалось о выделении ЦВО подобного вируса у поросят с врожденным (когенитальным) тремором типа А2 и экспериментальной вертикальной передаче болезни, путем инокуляции супоросных свиноматок этим вирусным изолятом (Illanes О. et al., 2000).
Клинические признаки врожденных треморов очень различаются и варьируют от сильных до слабых проявлений (Lukert P.D., 1999). Количество пораженных в помете поросят тоже может существенно варьировать. Тяжелые треморы могут приводить к смерти животного в течение первой недели жизни из-за неспособности животного принимать пищу: поросята погибают от истощения. Поросята, выжившие в течение первой недели, как правило, остаются в живых. При слабо выраженной форме этот тремор проходит, и большинство животных выздоравливает через 3 недели. Пораженные пометы обычно бывают у молодых племенных животных, недавно поступивших на ферму, что указывает на то, что серонегативные племенные животные подвергались воздействию вируса на критической стадии супоросности.
У поросят с врожденными треморами не наблюдали макроскопических поражений. Единственное известное поражение, ассоциированное с тяжелыми случаями ВТ, является задержка депонирования миелина в спинном мозге, что определяется гистологически (Hines R.K., Lukert P.D., 1994).
Исследования, проведенные Stevenson G.W. с сотрудниками на четырех фермах Среднего Запада США во время вспышек ВТ (2001), показали, что все больные и большинство клинически здоровых поросят были инфицированы цирковирусом свиней второго типа. Применение методов гибридизации in situ, ПЦР и реакции непрямой иммунофлюорисценции показали, что вирус был широко распространен в тканях инфицированных поросят и наиболее часто встречался в тканях центральной нервной системы (ЦНС) и печени. У поросят с ВТ ЦВС-2-инфицированных клеток в головном мозге было намного больше, чем у клинически здоровых поросят. Наиболее часто инфицируемыми ЦВС-2 клетками в головном и спинном мозге были большие нейроны. В тканях, не относящихся к нервной системе, наиболее часто инфицируемым типом клеток были макрофаги.
Пролиферативно-некротизирующая пневмония свиней (ПНП, porcine proliferative and necrotizing pneumonia) - сравнительно новая инфекционная патология, проявляющаяся пролиферативно-некротическим воспалением легочной ткани у поросят послеотъемного периода. Первые вспышки этой болезни зарегистрировали в 1988 г. в Канаде (Halbur P.G. et al., 1993). В связи с этим, большинство работ, посвященных ПНП свиней, опубликовано канадскими исследователями (Bikour М.Н. et al., 1994; Drolet R. et al., 2003; Ellis J. et al., 2004; Ellis J.A. et al., 1999; Larochelle R. et al., 1994)
ПНП клинически проявляется, как правило, у подсвинков старшего возраста или на средней стадии откорма (при массе тела 25-50 кг), редко у поросят-сосунов, у свиней на конечной стадии откорма или племенных животных (Кукушкин С.А. с соавт., 2005). Увеличение случаев инфекции отмечают в сырое и холодное время года. ПНП возникает неожиданно, в группе откармливаемых свиней в течение недели заболевают все животные. Болезнь протекает очень тяжело, животные, как правило, находятся в лежачем положении, затрудненное дыхание сопровождается кашлем, у некоторых животных температура тела повышается до 41 С. Выздоровление идет очень медленно, при этом отдельные особи отстают в росте. При паталогоанатомическом вскрытии обнаруживают изменения, характерные только для этой патологии: оба легких отечны с пятнами красно-фиолетового, частично серо-коричневого цвета, легочная ткань резиноподобной консистенции, в краниальных долях могут быть гнойные воспаления, вызываемые вторичной инфекцией (Кукушкин С.А. с соавт., 2005).
Микроскопически (гистологически) ПНП характеризуется гипертрофией и гиперплазией пневмоцитов II типа, коагуляцией некротических клеток в альвеолах, синтициальных клетках и некрозом эпителия в респираторном тракте и концевых бронхиолах (Кукушкин С.А. с соавт., 2005).
До недавнего времени вопрос о возбудителе этой новой патологии оставался открытым. При первоначальных исследованиях острых вспышек ПНП в 1990-1992 гг. ученые неоднократно обнаруживали новые типы вируса гриппа А свиней, до этого не зарегистрированных в Канаде (Bikour М.Н. et al., 1994; Segales J. et al., 2004). Позднее (после 1994 г), стали чаще выделять вирус РРСС и ЦВС-2 (Drolet R. et al., 2003; Magar R. et al., 1995).
Drolet R. с соавт. (2003), при исследовании проб легочной ткани 60 больных ПНП свиней, в 55 случаях (92%) выявили вирус РРСС, в 25 (42%) - ЦВС-2 и только в 1 (2%) - вирус гриппа. В 30 случаях (50%) обнаружили только вирус РРСС, а в 25 других (42%) - комбинацию вирусов РРСС и ЦВС-2. Все пробы положительные по ЦВС-2, были от поросят послеотъемного периода и всегда в ассоциации с вирусом РРСС. В последнее время исследователи ПНП сходятся во мнении, что эта патология - результат ассоциированной инфекции, вызванной вирусами РРСС и ЦВС-2. Определенную роль в ней могут играть вирус гриппа А свиней и некоторые другие возбудители респираторных болезней свиней. Диагноз на ПНП ставят комплексно на основании эпизоотологических и клинических данных, макро- и микроскопических изменений в легких, а так же вирусологических исследований (Кукушкин С.А. с соавт., 2005).
Очистка и иммунохимическая характеристика рекомбинатного нуклеокапсидного ORF2 белка
Ключевым вопросом при очистке белка является выбор подходящей тех ники и оптимизация ее для получения максимального выхода продукта при ми нимальном количестве стадий очистки. Развитие рекомбинантных ДІЖ- техно логий революционизировало процесс получения белка. Рекомбинантные белки могут быть продуцированы в форме, значительно облегчающей их дальнейшую хроматографическую очистку, а именно, они могут содержать на своем N- или С- конце так называемый «маркерный хвост» (tag tail), в состав которого входят химические группы, способные играть роль лиганда в аффинной хроматогра фии. Такими группами могут быть имидазольные остатки гистидина (His) или сульфгидрильные группы цистеина (Cys), которые образуют достаточно проч ную координационную связь с положительно заряженными ионами таких ме таллов, как медь, никель, цинк или кобальт. На этом принципе основана метал-4 ло-аффинная хроматография, которая впервые была использована для очистки белков в 1975 году (Porath J., Carlsson J., Olsson I., Belfrage G., 1975). % Нами в бакуловирусной системе был получен рекомбинантный белок, содержащий на своем N-конце (His)6 tag. Наличие на заданном продукте шести», имидазольных остатков позволило ему образовать прочную хелатную связь с ионами Ni2+ и закрепиться на агарозе через нитрилотриацетатный (NTA) мостик.
Прочность связи иона никеля определяется четырьмя координационными связями с NTA-агарозой. Две координационные связи образуются между Ni и имидазольными остатками, входящими в состав (His)6 tag. Такое взаимодействие не зависит от третичной структуры белка, поэтому содержащий (His)6 tag рекомбинантный белок может быть очищен в денатурирующих условиях. Исходя из этого, полученную биомассу, содержащую рекомбинантный белок ORF2 (п.п.4.1.1), размораживали, ресуспендировали в лизирующем буфере, обрабатывали, как описано в разделе «Материалы и методы» наносили на стеклянную колонку размером 1 х 3 см с Ni-NTA-агарозой. Процесс хромато-графической очистки и выход белка с колонки контролировали по показателям A280, белковый спектр полученных фракций, идентификацию и степень чистоты рекомбинантного белка ORF2 проверяли методом электрофореза в ПААГ-ДСН, его антигенную активность и специфичность - в ИФА и иммуноблоттин-ге с использованием МкА и референтных положительных и отрицательных сывороток крови свиней. Предварительные исследования по очистке рекомбинантного белка ЦВС-2 показали, что при выделении в нативных условиях, практически весь продукт остается в осадке. Поэтому для очистки продукта металло-аффинной хроматографией были выбраны денатурирующие условия: все отмывочные растворы содержали мочевину, а продукт элюировался с сорбента повышающимися концентрациями имидазола (рис.6). Результаты по определению антигенной активности белков, содержащихся во фракциях, полученных в процессе хроматографической очистки, представлены на рисунке 7.
Из приведенных рисунков 6 и 7 видно, что хроматограмма представлена тремя основными пиками А280. Фракции первого пика содержали белки клеточной биомассы и часть не связавшегося с носителем рекомбинантного продукта. Белки, содержащиеся во фракциях второго пика, не обладали антиген ной активностью в ИФА и, по-видимому, относились к белкам с относительно высоким содержанием гистидиновых остатков. После добавления 250 мМ ими дазола происходила элюция небольшого количества белка (фракции 3-го пика), имеющего высокую активность в ИФА и соответствующего рекомбинантному ORF2 продукту. Таким образом, установлено, что оптимальная концентрация имидазола для элюции рекомбинантного продукта составляет 250 мМ. Как показал электрофорез в ПААГ-ДСН, рекомбинантный ORF2 белок, находящийся в этой фракции, был практически гомогенен, а его молекулярная масса составляла 30-32 кД, что полностью согласуется с приведенными в литературе данными (рис. 8). Антигенную активность и специфичность выделенного и очищенного рекомбинантного белка ORF2 подтверждали в иммуноблоттинге с ЦВС-2 - положительной и отрицательной референтыми сыворотками (рис.9). Анализ полученных нами данных свидетельствует о том, что методом металлоаффинной хроматографии получен гомогенный препарат рекомбинантного нуклеокапсидного белка ORF2, который после электрофоретического разделения и окрашивания в иммуноблоттинге хорошо заметен в виде полосы с соответствующей молекулярной массой. Данный белок обладает выраженной антигенной активностью и специфически взаимодействует с референтными антителами к ЦВС-2 как в ИФА, так и иммуноблоттинге. При этом реакция полученного рекомбинантного белка ORF2 с пробами, не содержащими антител к ЦВС-2, была отрицательной в обеих методах исследования.
Оценка диагностических параметров разработанной иммуноферментной тест-системы.
Известно, что основными параметрами всех диагностических тест-сис тем является их чувствительность и специфичность. Традиционно эти пара метры высчитываются согласно стандартам МЭБ {Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 2004, где, а + с - общее количество референтных положительных проб, из которых: а - количество положительных проб, определенных в испытуемой тест-системе (истинно положительные пробы); с - количество положительных проб, не определенных в испытуемой тест-системе (ложноотрицатель-ные пробы); d + b - общее количество референтных отрицательных проб, из которых d - количество отрицательных проб, определенных в испытуемой тест-системе (истинно отрицательные пробы); b - количество отрицательных проб, не определенных в испытуемой тест-системе (ложноположительные пробы).
Исходя из этого, следующим этапом нашей работы было определение показателей качества разработанной иммуноферментной тест-системы в сравнении с методом аналогичной направленности. Дополнительно высчитывали процент совпадаемости результатов двух сравниваемых методов по формуле:
В наших исследованиях в качестве референтного метода была использована реакция непрямой иммунофлюоресценции, основанная на образовании комплекса антиген-антитело, где антигеном служит ЦВС-2, локализованный в цитоплазме монослоя клеток РК-15, а специфические антитела содержатся в исследуемых сыворотках. После взаимодействия иммунного комплекса с антителами к IgG свиньи, меченными ФИТЦ, происходит появление светящихся вирусных частиц в цитоплазме инфицированных клеток, видимых под флюоресцентным микроскопом (рис.14). При анализе результатов РИФ видно, что сыворотки крови, содержащие антитела к ЦВС-2, положительно реагировали с вирусом клеточного монослоя. При этом наблюдали специфическую флюресценцию иммунных комплексов ЦВС-2-антитело (рис.14, А и Б), в отрицательном случае свечения не наблюдалось (рис.14, В и Г).
В сравнительном аспекте с использованием ИФА и РИФ было исследовано 140 сывороток крови свиней различных половозрастных групп, полученных из 5 свинокомплексов, расположенных в различных регионах РФ (табл. 4). Постановку и интерпретацию полученных результатов осуществляли как описано в разделе «Материалы и методы», все испытуемые пробы были исследованы в двух методах в разведении 1:100.
Анализ полученных данных показал положительную корреляцию результатов по определению сывороточных антител к ЦВС-2, полученных с помощью разработанного ИФА и РИФ (r=0,88; Р 0,05), совпадаемость результатов двух методов составила 95,7%. Это свидетельствует о том, что разработанная нами иммуноферментная тест-система сопоставима по специфичности и чувствительности с РИФ и вследствие дополнительных своих преимуществ (экспрессность и простота проведения анализа, наличие инструментального учета реакции и возможность автоматизации всех ее этапов, стабильность при хранении всех необходимых реагентов и воспроизводимость результатов) может быть использована в качестве основного скрини-рующего теста при массовом обследовании животных.
Анализ литературных данных и диагностического рынка в России и за рубежом, свидетельствует о том, что должна быть проведена определенная работа, чтобы иммуноферментная тест-система приобрела форму завершенного и коммерчески доступного ИФА-набора, созданного на ее основе. Поэтому, на наш взгляд, необходимо дать определение двум этим понятиям. A) Иммуноферментная тест-система - набор охарактеризованных компонентов, находящихся у разработчика и предназначенных для проведе ния соответствующих исследований на рабочем месте (at home). Основные требования, предъявляемые к тест-системе: чувствительность, специфич ность и воспроизводимость результатов. B) ИФА-набор - коммерческий продукт, способный к транспортиров ке и длительному (не менее 1 года) хранению, представляющий собой набор расфасованных, готовых к употреблению компонентов и наставление по их применению. Нормативно-техническая документация (НТД) на его произ водство и применение должна быть утверждена в установленном порядке. Основным требованием, предъявляемым к набору, является его практическая эффективность (с сохранением всех требований, предъявляемых к тест системе) в сравнении с утвержденным к применению набором аналогичной направленности. Исходя из этого, конечной целью нашей работы была разработка технологии изготовления набора реагентов (ИФА-набора) предназначенного для выявления антител к ЦВС-2 и внедрение данного набора в ветеринарную практику. За основу данного набора была взята разработанная специфичная и чувствительная иммуноферментная тест-система (см. предыдущие разделы работы), а основными этапами работ в этом направлении были следующие: получение и характеристика положительного и отрицательного контроля для ИФА-набора;
Применение ИФА-набора «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ» для эпизоотологического мониторинга цирковирусной инфекции в свиноводческих хозяйствах
Заключительным этапом нашей работы было испытание разработанного ИФА-набора в лабораторных и производственных условиях.
Распространение ЦВС-2 в свиноводческих хозяйствах Российской Федерации изучали по результатам определения вирусспецифических антител в сыворотке крови свиней. Для этого с помощью разработанного ИФА-набора «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ» было исследовано 1650 сывороток крови, полученных от животных из 20 свиноводческих хозяйств промышленного типа в которых отмечали массовые заболевания 1,5-4 месячных поросят с респираторным синдромом: ФГУП "Пермский свинокомплекс" Пермская обл.; ЗАО «Племзавод - Юбилейный», Тюменская обл.; Племзавод-Агрофирма ЗАО «Краснодонское», Волгоградская обл.; ОАО «Племхозяйство «Лазаревское», Тульская обл.; ЗАО «Троицкое», Белгородская обл.; МХП «Николаевское», Воронежская обл.; ЗАО «Ботово», Вологодская обл.; ЗАО «Шувалово», Костромская обл.; ГУП с/х "Большевик", Пензенская обл.; ЗАО «Агрофирма Буденовец», Московская обл.; Совхоз «Восточный», Ленинградская обл.; ЗАО «Кудря-шовское», Новосибирская обл.; ОАО «Медведовский мясокомбинат», Башкирия; Свинокомплекс «Томский», Томская обл.; СПК «Егорьевский»; ЗАО «Залесье», Ярославская обл.; СПК «Новая жизнь», Тульская обл.; С/х «Прогресс», Пензенская обл.; С/к «Северный», Республика Беларусь и «Тропарево», Московская обл. В четырех из вышеперечисленных хозяйств были проведены предварительные выборочные исследования патологического материала от свиней методом ПЦР, результаты которых показали наличие ЦВС-2 в лимфоидных органах животных.
В ИФА были исследованы животные различных половозрастных групп: хряки-производители, свиноматки, супоросные свиноматки, ремонтный молодняк и поросята различных возрастов. Опыты проводили с использованием ИФА-наборов из выпущенной экспериментальной серии. Постановку реакции, учет и интерпретацию результатов ИФА проводили, как описано выше. Параллельно часть проб была исследована на наличие ДНК вируса методом ПЦР.
В результате исследований было установлено, что из 1650 испытуемых сывороток крови положительными в ИФА оказалось 823 пробы (49,9%) и отрицательными-827 проб (50,1%). При этом распределение серопози-тивных и серонегативных животных в разных половозрастных группах было неравномерным (табл. 6, 7).
Из данных, приведенных в таблице 6, видно, что увеличение количества ЦВС-2-серопозитивных поросят зависит от их возраста. Максимальный процент таких животных регистрировали в возрастных группах молодняка от 80-90 дней и старше. Параллельное выборочное исследование положительных проб методом ПНР, позволило идентифицировать ДНК вируса в 50% случаев.
Анализ результатов таблице 7, свидетельствует о том, что ЦВС-2 -серопозитивные животные преобладали в группах ремонтного молодняка и свиноматок. Минимальное их количество установлено у хряков.
Поскольку в ранее опубликованных работах (F.J.Pallares et al., 2002; Y.Choi et al., 2003 и др.) было установлено, что респираторные болезни поросят в 76-88% случаев ассоциированы со смешанными инфекциями, причем одними из основных этиологических агентов являются ЦВС-2 и вирус РРСС, то 965 сывороток крови были параллельно исследованы на наличие антител к вирусу РРСС с помощью ИФА-набора «РРСС-СЕРОТЕСТ», выпускаемого ЗАО «НПО НАРВАК» согласно ТУ 9388-012-42418073-04.
В результате исследований было установлено, что из 965 сывороток крови, исследованных на наличие антител к ЦВС-2 и вирусу РРСС, 500 проб (51,8%) было положительными к одному или двум вирусам и 465 (48,2%) -отрицательными. Из 500 положительных проб 130 (26%) содержали антитела к двум вирусам, в 80-ти (16%) были выявлены антитела к вирусу РРСС и в 290 (58%) - к ЦВС-2 соответственно (рис.16). Таким образом, в обследован ной популяции животных преобладали свиньи, содержащие антитела только к ЦВС-2.
По результатам исследований нами был сделан вывод о том, что с помощью разработанного нами ИФА-набора «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ» можно дифференцировать ЦВС-2-специфические и отрицательные сыворотки крови свиней при массовом обследовании животных, а сам набор соответствует своему основному назначению и может использоваться в качестве скрини-рующего теста для эпизоотологического мониторинга цирковируснои инфекции в свиноводческих хозяйствах.
Проведенный с помощью данного набора серологический мониторинг цирковируснои инфекции свидетельствует о широком распространении ЦВС-2 в обследуемых хозяйствах России. Цирковирусы свиней были обнаружены сравнительно недавно, и их роль в развитии различных патологий животных была практически неизвестна. Только в 1994 году появилось первое сообщение о том, что цирковирусы имеют непосредственное отношение к заболеванию поросят. До этого времени ЦВС считали непатогенным вирусом. Но обнаружение нового типа цирковируса свиней - ЦВС-2 и непосредственная ассоциация его с различными синдромами у поросят позволили сделать вывод о его патогенности. Установлено, что ЦВС-2 является возбудителем болезни поросят названной синдромом мультисистемного послеотъемного истощения (СПМИ).
Работе по созданию средств серодиагностики ЦВС-2 предшествовало изучение литературных данных о распространенности возбудителя на территории различных стран мира, результаты которого показали необходимость проведения мониторинга данной инфекции на территории нашей страны, в связи, с чем возникла необходимость в разработке диагностического ИФА-набора для выявления антител к ЦВС-2.
