Введение к работе
Актуальность проблемы В настоящее время в мире сохраняется нестабильная ситуация по лихорадке Западного Нила (ЛЗН) Начиная с 90-х годов XX века вспышки этого заболевания регистрировались в странах как Восточного, так и Западного полушарий и характеризовались большой долей менингитов и менингоэнцефалитов (более 50 %), высокой летальностью (до 10 %) (Венгеров ЮЛ и др , 2000, Львов Д К и др , 2000, Онищенко Г Г и др , 2000, Петров В А и flp,2001,TsaiTF etal, 1998, Han LL etal, 1999,HubalekZ et al, 1999, Lvov D К et al, 2000, Chowere MY et al, 2001)
В Западном полушарии впервые ЛЗН была зарегистрирована в 1999 г (Bnese Т et al, 1999, Lanciotti RS et al, 1999, Weiss D et al, 2001) С момента интродукции на американский континент, вирус Западного Нила (ЗН) распространился практически на всю территорию США (44 штата), южные районы Канады, Латинскую Америку и Южную Америку (Andreadis TG et al, 2001, Kulasekera V L et al, 2001, Marfm A A et al, 2001, Nosal В et al 2004)
Начиная с 1999 г заболевания ЛЗН отмечаются ежегодно и на территории Российской Федерации в Астраханской, Волгоградской, Ростовской областях, Краснодарском крае (Львов Д К и др , 2000, Онищенко Г Г и др , 2000, Стриханов С Н и др, 2000, Ковтунов А И и др, 2001, Петров В А и др, 2001, Соловьев М Ю и др, 2007) За период с 2001 по 2006 гг выявлено 293 случая этой инфекции в Южном федеральном округе (письмо Роспотребнадзора № 0100/8969-07-32 от 04 09 2007 г «Об усилении надзора за лихорадкой Западного Нила и мерах по ее профилактике») Впервые в 2004 г случаи заболевания ЛЗН зарегистрированы в Новосибирской области (Кононова Ю В и др , 2007)
Вследствие вышеперечисленных событий ЛЗН рассматривается как
классический пример возникающего и вновь возвращающегося (emerging-
reemerging) инфекционного заболевания (Львов Д К, 2002, Локтев В Б, 2007,
Нетесов С В , 2007, Hubalek Z et al, 1999) Глобальное потепление климата,
естественная миграция животных, особенно птиц, повышение интенсивности
грузовых и пассажирских потоков, антропогенное вмешательство в дикую природу,
ослабление эпизоотологического и эпидемиологического надзора за природными
очагами арбовирусных заболеваний способствуют ухудшению эпидемиологической
3 ~ '
ситуации по этим инфекциям, приводят к расширению их ареалов, в том числе ареала ЛЗН (Онищенко Г Г, 2000, Львов Д К и др, 2004, Сергиев В П и др, 2004, HubalekZ etal,1999)
В связи с этим актуальной задачей является совершенствование методов лабораторной диагностики ЛЗН и мониторинга природных очагов этой инфекции (Онищенко Г Г и др, 2000, Локтев В Б, 2007, письмо Роспотребнадзора № 0100/8969-07-32 от 04 09 2007 г )
Вирусологический метод, основанный на выделении вируса на чувствительной биологической модели, является «золотым стандартом» диагностики вирусных инфекций, однако может осуществляться только в специализированных лабораториях и требует больших экономических и временных затрат, что значительно ограничивает его практическое применение Низкий уровень содержания вируса в крови или ликворе больных ЛЗН людей и непродолжительный период вирусемии обусловливают недостаточную диагностическую ценность иммуноферментного анализа (ИФА), направленного на выявление антигена вируса, а наиболее широко используемый для диагностики инфекции ИФА с целью выявления специфических антител часто требует исследования парных сывороток, что отдаляет постановку диагноза
Внедрение в схему набораторной диагностики и мониторинга природных очагов ЛЗН метода полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), обладающего высокой чувствительностью и специфичностью, будет способствовать быстрой детекции возбудителя в биологическом материале и ранней постановке диагноза, что позволит своевременно организовать и провести адекватные противоэпидемические мероприятия
Несмотря на то, что с пособы обнаружения вируса ЗН, основанные на методе ОТ-ПЦР, разработаны рядом авторов (Прилипов А Г и др , 2003, Альховский С В и др, 2004, Петров АА и др , 2004, Терновой В А и др , 2004, Карань Л С и др, 2006, Lanciotti R S et al, 2000), сертифицированный диагностический препарат, разрешенный к применению и производству в Российской Федерации, включающий комплекты ]эеагентов для всех этапов ПЦР-анализа, до настоящего времени отсутствует
Цель работы - конструирование и апробация тест-системы для выявления РНК вируса Западного Нила в биологическом материале методом ОТ-ПЦР
Основные задачи исследования:
-
Провести анализ нуклеотидных последовательностей генома вируса ЗН различных генетических вариантов, представленных в базе данных GenBank, с целью подбора специфичных праймеров
-
Оценить специфичность и чувствительность ПЦР с использованием выбранных праймеров на панели гомологичных и гетерологичных штаммов микроорганизмов и сконструировать ПНР-тест-систему, позволяющую выявлять РНК вируса ЗН в биологическом материале
-
Для обеспечения биологической безопасности при работе с диагностическим препаратом создать к тест-системе рекомбинантный положительный контрольный образец и стандартный образец предприятия
-
Разработать нормативную документацию на созданную тест-систему и представить в ГИСК им Л А Тарасевича три экспериментально-производственные серии диагностического препарата для проведения Государственных испытаний
-
Провести апробацию сконструированной тест-системы при исследовании клинического и полевого материала
-
Оценить возможность использования ПЦР-анализа с разработанной тест-системой при изучении особенностей циркуляции вируса ЗН на примере Саратовской области
Научная новизна работы
Впервые разработана тест-система для выявления РНК вируса ЗН методом ОТ-ПЦР - «ГенНил», включающая комплекты реагентов для всех этапов ПЦР-анализа (выделения РНК, проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР, учета результатов) Доказано, что чувствительность тест-системы составляет 1 х103 ГЭ/мл, специфичность - 98,3 %, воспроизводимость результатов - 100 %
Оценена диагностическая информативность тест-системы при исследовании клинического и полевого материала
Показана возможность использования ПЦР-анализа в ходе эпизоотологического обследования природных очагов ЛЗН
Изучены особенности циркуляции вируса ЗН на территории Саратовской области с применением с» онструированной тест-системы
Практическая значимость работы.
На созданную тест-систему для выявления РНК вируса ЗН методом ОТ-ПЦР разработан пакет нормативной документации (фармакопейная статья предприятия, пояснительная записка, инструкция по применению тест-системы, отчет о лабораторно-экспериментальном изучении препарата, внутренняя и внешняя маркировки, проект паспорта, пояснительная записка о получении положительного контрольного образца для диагностического препарата «ГенНил», инструкция по применению Стандартного образца предприятия (СОЩ+ ЗН), свидетельство на СОПк+ ЗН, проект паспорга на СОПк+ ЗН)
Сконструирован и депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» (Саратов) 2 мая 2007 г под номером Escherichia coli KM 201 генетически модифицированный штамм Е coli TGI pWN ApR На основе этого штамма был создан положительный контрольный образец к разработанной ПЦР-тест-системе и стандартный образец предприятия (СОПк+ ЗН) СОЩ+ ЗН может быть использован для стандартизации процедуры контроля чувствительности и специфичности диагнос'П'їческого препарата «ГенНил» в условиях производства
Проведены Государственные испытания разработанной тест-системы для выявления РНК вируса ЗН методом ОТ-ПЦР в ГИСК им Л А Тарасевича Тест-система рекомендована Ученым советом ГИСК им Л А Тарасевича и Комитетом МИБП к регистрации в Российской Федерации, а нормативная документация на нее - к утверждению в установленном порядке (протокол № 1 от 17 01 Об г заседания Ученого совета ГИСК им Л А Тарасевича, протокол № 1 от 09 02 06 г заседания Комитета МИБП)
Тест-система «ГенНил» была использована при эпизоотологическом
обследовании территорий Саратовской области, Ставропольского края и
Республики Калмыкия с целью выявления и изучения особенностей циркуляции
вируса ЗН, а также при мониторинге природного очага ЛЗН в Астраханской области
Материалы диссертации использованы при составлении практического руководства «Специфическая индикация патогенных биологических агентов» (утверждено Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г Г Онищенко 1107 2006 г), применяются при чтении лекций на курсах подготовки и усовершенствования специалистов по особо опасным инфекциям в РосНИПЧИ «Микроб» и на курсах повышения квалификации «ПЦР в диагностике инфекционных болезней и индикации патогенных микроорганизмов»
Работа выполнена в рамках Федеральной целевой научно-технической программы - «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006 годы и договоров с ГУ НИИ вирусологии им Д И Ивановского РАМН (Москва) «Выявление и анализ специфичных участков геномов вирусов Западного Нила и Конго-Крымской геморрагической лихорадки, создание ГЩР-тест-систем, разработка нормативной документации» и «Сертификация ОТ-ПЦР-тест-систем для выявления РНК вирусов Крымской-Конго геморрагической лихорадки и лихорадки Западного Нила Разработка сиквенс-систем и алгоритма комплексной лабораторной диагностики Крымской геморрагической лихорадки и лихорадки Западного Нила», а также плановой НИР «Мониторинг очагов арбовирусных инфекций на территории юго-востока европейской части России и разработка системы специфической диагностики и профилактики» (№ Государственной регистрации 01 200 111496)
Основные положения, выносимые на защиту
-
Праймеры Wn 10149, Wn 10149 (1), Wn 10588, Wn 10213, Wn 10318, комплементарные З'-концу нуклеотидной последовательности РНК вируса ЗН, включая участок, кодирующий неструктурный белок NS5, обеспечивают специфическую детекцию штаммов вируса ЗН
-
Разработанная тест-система для выявления РНК вируса ЗН методом ОТ-ГЩР «ГенНил» характеризуется чувствительностью 1><103ГЭ/мл, специфичностью - 98,3 %, воспроизводимостью результатов - 100 % и позволяет детектировать возбудитель ЛЗН в биологическом материале сыворотке (плазме)
крови, суспензиях клещей, комаров, суспензиях органов животных (мозг, селезенка)
-
Положительный контрольный образец и стандартный образец предприятия (СОПк+ ЗН), разработанные на основе сконструированной рекомбинантной плазмиды pWN штамма Е colt TGI pWN ApR, позволяют стандартизировать процедуру контроля чувствительности и специфичности тест-системы
-
ПЦР-анализ с применением тест-системы «ГенНил» может быть использован в ходе мониторинга природных очагов ЛЗН, при эпизоотологическом обследовании территорий с целью выявления и изучения циркуляции возбудителя, а также для лабораторной диагностики заболевания
Апробация работы.
Материалы диссертации были представлены и обсуждены на ежегодных научно-практических конференциях в ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов) «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» в 2004 - 2007 гг, а также на Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология-XXI век» (Саратов, 2004), VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств участников содружества независимых государств проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005), IV Российском конгрессе детских инфекционистов «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики у детей» (Москва, 2005), VH Межгосударственной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербуржского саммита «Группа восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых государств» (Оболенск, 2006), VII Российском съезде нфекционистов «Новые технологии в диагностике и лечении инфекционных болезней» (Н Новгород, 2006), научно-практической конференции «Арбовирусы и арбовирусные инфекции» (Астрахань, 2006), IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007)
Публикации
Основные положения диссертации отражены в 11 опубликованных научных работах, в том числе 2 - в изданиях, рекомендованных ВАК Российской Федерации и 9 - в сборниках материалов Межгосударственных и Всероссийских конференций
Объем и структура диссертации
