Введение к работе
Актуальность работы.
В связи с отсутствием эффективных средств защиты и иммунопрофилактики ВИЧ-инфекции, огромную роль в предотвращении и распространении этой инфекции играет качественная и своевременная диагностика. В последние годы в диагностике ВИЧ-инфекции широкое распространение получили методы выявления генома ВИЧ. С помощью этих методов можно не только подтверждать наличие ВИЧ-инфекции, но и судить об активности вируса в организме инфицированного человека, прогнозировать развитие заболевания, наблюдать за эффективностью противовирусной терапии. Одним из наиболее переспективных вариантов метода является специфическая амплификация нуклеиновых кислот in vitro - полимеразная цепная реакция. Развитие технологии получения ПЦР-тест-систем, организация производственного выпуска препаратов для ПЦР, мониторинг качества выпускаемых препаратов, определили необходимость создания системы контроля тест-систем, создания и аттестации стандартных образцов (как отраслевых - ОСО, так и стандартов предприятия - СОП) для оценки чувствительности и специфичности диагностических препаратов.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы было: стандартизация и создание системы контроля препаратов для генодиагностики ВИЧ-инфекции. В соответствии с этим необходимо было решить следующие задачи:
изучить основные характеристики препаратов для генодиагностики ВИЧ-инфекции;
стандартизовать основные методы оценки качества тест-систем -аналитическую чувствительность и специфичность;
разработать и аттестовать стандартные образцы: ОСО и СОП;
оценить диагностическую чувствительность и специфичность ПЦР-тест-систем при исследовании клинического материала для решения вопроса о целесообразности внедрения препаратов для генодиагностики ВИЧ-инфекции в практику здравоохранения.
Научная новизна.
На основе проведенных исследований впервые в стране разработана
система контроля качества препаратов для генодиагностики ВИЧ-инфекции. С
этой целью разработаны, аттестованы и применены при оценки качества ПЦР-
тест-систем отраслевой стандартный образец - ОСО «ДНК ВИЧ-1 К+»,
стандартные образцы предприятия: СОП «ПКО ДНК ВИЧ-1» и СОП «РНК ВИЧ», разработанные совместно с ФГУН ЦНИИЭ.
В процессе выполнения данной работы была аттестована и подтверждена высокая чувствительность гибридизационно-ферментнои детекции продуктов амплификации по сравнению с электрофоретическим методом детекции, было показано, что наиболее технологичным является метод выделения лимфоцитов путем гемолиза цельной крови,.
Впервые в РФ проведены независимые клинические шифрованные испытания отечественных и зарубежных ПЦР-тест-систем с целью решения вопроса о целесообразности внедрения этих препаратов в практику здравоохранения.
Научно-практическая значимость.
Разработан, аттестован и зарегистрирован в Реестре национальных стандартов МИБП РФ - отраслевой стандартный образец «ДНК ВИЧ-1 К+» - ОСО 42-28-303-98. На ОСО оформлено свидетельство и инструкция по применению. В настоящее время ОСО с успехом применяется для контроля аналитической чувствительности и специфичности ПЦР-тест-систем для выявления ДНК ВИЧ-1.
Аттестованы разработанные в ФГУН ЦНИИЭ стандартные образцы предприятия СОП «ПКО ДНК ВИЧ-1» и СОП «РНК ВИЧ». Показана возможность применения этих образцов для оценки аналитической чувствительности выпускаемых серий тест-систем, а так же для приготовления контрольных образцов, входящих в состав тест-систем. Применение стандартов (ОСО, СОП) включено в нормативную документацию на тест-системы в разделы «Подлинность» и «Специфическая активность».
На представительном клиническом материале проведены шифрованные клинические испытания ПЦР-тест-систем в соответствии с утвержденными Комитетом МИБП Протоколами государственных испытаний. Показано, что отечественные ПЦР-тест-системы по своей диагностической чувствительности и специфичности не уступают зарубежным препаратам. В настоящее время прошли регистрацию в РФ и разрешены к применению в диагностической практике следующие ПЦР-тест-системы: «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96», «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М», «АмплиСенс ДНК-ВИЧ FRT» «АмплиСенс ВИЧ Монитор», «Амлликор ВИЧ-1 Монитор Тест».
Положения, выносимые на защиту: 1. Проведены исследования и подтверждены оптимальные условия выделения
лимфоцитов из цельной крови при постановке ПЦР для выявления ДНК ВИЧ-1 из
, 2 '.і
цельной крови, изучены два метода детекции для тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96»;
Проведена оценка чувствительности и специфичности тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96» в шифрованном клиническом опыте;
Разработан и аттестован ОСО «ДНК ВИЧ-1 К+», показана целесообразность применения этого стандарта для контроля качества выпускаемой продукции и для оценки чувствительности;
Проведена оценка чувствительности и специфичности отечественных и зарубежных ПЦР-тест-систем «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М», «АмплиСенс ДНК-ВИЧ FRT», «АмплиСенс ВИЧ Монитор», «Ампликор ВИЧ-1 Монитор Тест» в шифрованных клинических испытаниях;
Аттестованы разработанные в ЦНИИЭ СОП «ПКО ДНК ВИЧ-1» и СОП «РНК ВИЧ»; показана целесообразность применения этих стандартных образцов для получения и калибровки положительных контрольных образцов, входящих в состав наборов, а так же для оценки чувствительности ПЦР-тест-систем.
Апробация работы Основные экспериментальные материалы и положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на IV международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы» Санкт-Петербург, 1997 г, XII Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии», Гурзуф, 2004 г, Международной научно-практической конференции по вопросам ВИЧ-инфекции и вирусных парентеральных гепатитов», Суздаль 2004 г. , 1-ой Всероссийской конференции по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций», Москва, 2004 г.
Материалы диссертации изложены в 9 публикациях, в том числе в 3 статьях и 6 тезисах в материалах отечественных и международных конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждения результатов, заключение, выводы, список литературы. Работа содержит 14 рисунков, и 30 таблиц. Библиография включает 111 источников литературы отечественных и зарубежных авторов.
