Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 5
1.1. Актуальность темы 5
1.2. Цель и задачи исследования 6
1.3. Научная новизна работы 7
1.4. Практическая значимость 7
1.5. Основные положения выносимые на защиту 8
1.6. Личный вклад соискателя 8
1.7. Апробация результатов исследований 8
1.8. Публикации научных исследований 9
2. Обзор литературы 10
2.1. Характеристика вирусной геморрагической септицемии рыб 10
2.2. Клинические признаки 10
2.3. Патологоанатомические изменения 11
2.4. Морфология и физические свойства вириона 12
2.5. Структура генома 14
2.6. Устойчивость вируса 14
2.7. Патогенные свойства вируса ВГС рыб 15
2.8. Эпизоотическая ситуация по вирусной геморрагической септицемии рыб 16
2.9. Профилактика и меры борьбы 20
2.10. Методы диагностики вирусной геморрагической септицемии рыб 20
2.11. Заключение по литературному обзору 33
3. Собственные исследования 35
3.1. Материалы 35
3.2. Методы 39
4. Результаты 44
4.1. Изучение культуральных и биологических свойств штамма ЧФ 1.2 возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыб 44
4.2. Разработка набора препаратов для выявления возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыб методом полимеразной цепной реакции 57
4.3. Филогенетический анализ штамма ЧФ 1.2/К возбудителя ВГС рыб 75
5. Обсуждение 77
6. Выводы 85
7. Практические предложения 86
Список литературы
- Научная новизна работы
- Патологоанатомические изменения
- Методы диагностики вирусной геморрагической септицемии рыб
- Разработка набора препаратов для выявления возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыб методом полимеразной цепной реакции
Введение к работе
Вирусная геморрагическая септицемия (ВГС) рыб - заразная болезнь, поражающая пресноводных и морских рыб. Гибель рыб, в зависимости от возраста, может достигать 50 - 70%.
Переносчиками возбудителя являются беспозвоночные.
Распространению заболевания способствует ввоз живой икры и мальков из эпизоотически неблагополучных зон. Этиологический агент, вызывающий ВГС рыб, относится к роду Novirhabdovirus семейства Rhabdoviridae. По классификации Международного эпизоотического бюро ВГС рыб относится к категории особо опасных, декларируемых болезней рыб.
Возбудитель вирусной геморрагической септицемии распространен на территории США, Канады и ряда европейских стран, таких как Дания, Финляндия, Норвегия, Швеция и в странах Балтии. Резервуары инфекции существуют в Балтийском и Северном морях, а так же в Тихом океане. ВГС рыб была широко распространена на Украине, отмечена в Прибалтике и Грузии. Сегодня ВГС рыб в России не установлена, однако угроза заноса инфекции вполне реальна в связи с ввозом рыбы из мест, неблагополучных по данному заболеванию.
Диагноз на ВГС рыб ставят на основании выполнения комплекса исследований, включающих: анализ эпизоотологических данных, клинических признаков заболевания и патологоанатомических изменений, результаты вирусологических исследований по выделению и серологической идентификации вируса с последующей постановкой биопробы.
Высокая контагиозность и смертность рыб при данной вирусной инфекции обуславливают необходимость разработки экспресс методов диагностики ВГС рыб с целью быстрого и своевременного принятия карантинных мер и профилактических мероприятий. Одним из таких методов является полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая уже нашла применение в диагностических исследованиях в ветеринарии.
Избирательная амплификация отдельных участков вирусного генома с помощью полимеразной цепной реакции, дополняя серологические и вирусологические методы, открывает новые возможности для быстрой идентификации возбудителя ВГС рыб.
1.2.Цель и задачи исследования
Целью данной работы являлась идентификация генома возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыб на основе полимеразной цепной реакции.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Изучить культуральные и биологические свойства штамма ЧФ 1.2/К возбудителя ВГС рыб в различных перевиваемых клеточных линиях и на годовиках радужной форели. Депонировать данный штамм в коллекцию микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ;
2. Провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов структурных белков различных штаммов и изолятов возбудителя ВГС рыб, подобрать специфические праймеры для идентификации данного возбудителя;
3. Отработать методы выделения суммарной рибонуклеиновой кислоты (РНК) из инфицированных культур клеток и проб органов экспериментально зараженных ВГС рыб, оптимизировать условия синтеза кДНК и постановки ПЦР для выявления и дифференциации возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыб от штаммов близкородственных представителей рабдовирусов рыб;
4. Разработать тест-систему на основе ПЦР для идентификации возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыб и оценить ее пригодность для диагностики болезни;
Провести филогенетический анализ отечественного штамма ЧФ 1.2/КВГСрыб. 1.3.Научная новизна работы
Изучены культуральные и биологические характеристики отечественного штамма ЧФ 1.2 возбудителя ВГС рыб, который депонирован в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ под названием штамм ЧФ 1.2/К.
Подобраны праймеры, комплементарные различным участкам генома возбудителя ВГС рыб, позволяющие выявлять и дифференцировать его от близкородственных представителей рабдовирусов рыб (вирусов весенней виремии карпа и инфекционного некроза гемопоэтической ткани) методом ПЦР.
Проведенный филогенетический анализ участка гена штамма ЧФ 1.2/К возбудителя ВГС рыб показал, что уровень гомологии этого участка с таковыми европейских генотипов ВГС рыб составляет 96-99%. 1.4.Практическая значимость
Практическая ценность работы состоит в том, что на основании экспериментальных данных разработана тест-система для идентификации возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыб методом полимеразной цепной реакции, которая успешно прошла комиссионные испытания. Акт комиссионных испытаний рассмотрен на заседании ученого совета (протокол № 6 от 14.07.2006) и утвержден директором института 18.07.2006.
Предложенная тест-система рекомендована для включения в схему лабораторных исследований при диагностике болезни, в настоящее время используется в практической работе и позволяет обнаруживать РНК возбудителя ВГС рыб в инфицированных культурах клеток и пробах органов от больных рыб.
Депонированный в коллекции микроорганизмов института штамм ЧФ 1.2/К ВГС рыб (инв. №2601 от 10.02.2005) используют в ГНУ ВНИИВВиМ при проведении НИР. 1.5.Основные положения выносимые на защиту
- Культуральные и биологические свойства штамма ЧФ 1.2/К возбудителя ВГС рыб, репродуцированного в культурах клеток ЕРС (перевиваемая линия клеток эпидермальных новообразований больного оспой карпа) и RTG2 (перевиваемая линия клеток гонад радужной форели);
- Специфичность ПЦР с использованием подобранных праймеров к участку генов для обнаружения и идентификации возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыб;
- Результаты филогенетического анализа отечественного штамма ЧФ 1.2/К вируса ВГС рыб;
1.6.Личный вклад соискателя
Представленные в диссертационной работе экспериментальные исследования, анализ полученных результатов выполнены автором самостоятельно. В проведении исследований диссертации практическую и консультативную помощь оказывали сотрудники ГНУ ВНИВВиМ: заведующий лабораторией «Здоровье гидробионтов», кандидат биологических наук Щелкунов И.С. (раздел Определение патогенности вируса) и старший научный сотрудник этой же лаборатории Щелкунова Т.И. (раздел Репродукция возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыб); старший научный сотрудник лаборатории «Биофизик», кандидат биологических наук Жигалева О.Н. (раздел Филогенетический анализ штамма ЧФ 1.2/К возбудителя ВГС рыб).
1.7.Апробация результатов исследований
Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на: заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ в 2004-2007 гг.; международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (ВНИТИБП, Щелково, 2005). 1.8.Публикации научных исследований
По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 1 в журнале «Ветеринария».
Научная новизна работы
Изучены культуральные и биологические характеристики отечественного штамма ЧФ 1.2 возбудителя ВГС рыб, который депонирован в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ под названием штамм ЧФ 1.2/К.
Подобраны праймеры, комплементарные различным участкам генома возбудителя ВГС рыб, позволяющие выявлять и дифференцировать его от близкородственных представителей рабдовирусов рыб (вирусов весенней виремии карпа и инфекционного некроза гемопоэтической ткани) методом ПЦР.
Проведенный филогенетический анализ участка гена штамма ЧФ 1.2/К возбудителя ВГС рыб показал, что уровень гомологии этого участка с таковыми европейских генотипов ВГС рыб составляет 96-99%. Практическая ценность работы состоит в том, что на основании экспериментальных данных разработана тест-система для идентификации возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыб методом полимеразной цепной реакции, которая успешно прошла комиссионные испытания. Акт комиссионных испытаний рассмотрен на заседании ученого совета (протокол № 6 от 14.07.2006) и утвержден директором института 18.07.2006.
Предложенная тест-система рекомендована для включения в схему лабораторных исследований при диагностике болезни, в настоящее время используется в практической работе и позволяет обнаруживать РНК возбудителя ВГС рыб в инфицированных культурах клеток и пробах органов от больных рыб.
Депонированный в коллекции микроорганизмов института штамм ЧФ 1.2/К ВГС рыб (инв. №2601 от 10.02.2005) используют в ГНУ ВНИИВВиМ при проведении НИР. - Культуральные и биологические свойства штамма ЧФ 1.2/К возбудителя ВГС рыб, репродуцированного в культурах клеток ЕРС (перевиваемая линия клеток эпидермальных новообразований больного оспой карпа) и RTG2 (перевиваемая линия клеток гонад радужной форели); - Специфичность ПЦР с использованием подобранных праймеров к участку генов для онаружения и идентификации возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыб; - Результаты филогенетического анализа отечественного штамма ЧФ 1.2/К вируса ВГС рыб;
Представленные в диссертационной работе экспериментальные исследования, анализ полученных результатов выполнены автором самостоятельно. В проведении исследований диссертации практическую и консультативную помощь оказывали сотрудники ГНУ ВНИВВиМ: заведующий лабораторией «Здоровье гидробионтов», кандидат биологических наук Щелкунов И.С. (раздел Определение патогенности вируса) и старший научный сотрудник этой же лаборатории Щелкунова Т.И. (раздел Репродукция возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыб); старший научный сотрудник лаборатории «Биофизик», кандидат биологических наук Жигалева О.Н. (раздел Филогенетический анализ штамма ЧФ 1.2/К возбудителя ВГС рыб). Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на: заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ в 2004-2007 гг.; международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (ВНИТИБП, Щелково, 2005). По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 1 в журнале «Ветеринария».
Патологоанатомические изменения
Возбудитель ВГС рыб является представителем рода Novirhabdovirus семейства Rhabdoviridae и содержит однонитчатый геном отрицательной полярности. РНК состоит из 11000 нуклеотидов [88]. Геном содержит шесть генов, кодирующих один неструктурный белок (NV) и пять структурных белков, включая нуклеокапсидный белок (N), фосфопротеин (Р), матричный белок (М), гликопротеин (G) и полимеразу (L) [39, 100, 111].
Присутствие уникального NV-гена и высокий уровень гомологии последовательностей этого гена у трех вирусов (ВГС рыб, ВВК, ИНГТ) привели к выделению их в новый род Novirhabdovirus семейства Rhabdoviridae [113]. Кроме того эти вирусы обладают гемагглютинирующей активностью благодаря наличию поверхностного гликопротеина [124,139]. Вирус чувствителен к эфиру, хлороформу и глицерину, а также к колебаниям рН — до 3,5. Он полностью инактивируется при температуре 44С в течение 15 мин, а при 30С теряет свою патогенность лишь на 50%. Находясь в дистиллированной воде при 14С в течение одних суток, вирус инактивируется до 50%, а в прудовой воде — до 90% [104].
Ультрафиолетовые лучи убивают вирус ВГС рыб в течение 10 мин. Дезинфицирующие вещества, такие как 2%-ный раствор едкого натра и 3%-ный раствор формалина, убивают вирус в течение 5- 10 мин [105]. Активный хлор, широко используемый для борьбы с возбудителями инфекционных и инвазионных болезней в индустриальном рыбоводстве, убивает вирус, в зависимости от концентрации, за 2 - 20 мин [102].
При температуре минус 20С и ниже вирус сохраняет инфекционную активность более 2 лет, но при этом его титр активности снижается примерно на 2 порядка [78].
Возбудитель болезни проникает в организм рыб через жабры. Вначале вирус размножается в эндотелиальных клетках всей кровеносной системы и затем попадает во все внутренние органы и ткани, вызывая в них глубокие патологические изменения [63].
Поражение мозга приводит к появлению нервных симптомов заболевания, а эндотелия сосудов — к нарушению их порозности и образованию кровоизлияний. Стенки сосудов становятся ломкими, что и обусловливает геморрагический синдром, особенно резко выраженный при остром течении болезни.
При хроническом течении отмечают отечность в результате токсикоза и нарушений осморегуляторного процесса. При нервной форме болезни нарушается равновесие и координация движений. Анемия связана с некротическими изменениями, возникающими в тканях гемопоэтическои системы, а также с прямым действием- вируса или токсинов, освобождающихся при развитии патологического процесса [58].
Отмечают гипергликемию, снижение содержания липидов, значительные колебания концентрации электролитов. Заметно уменьшается количество общего белка в сыворотке крови и особенно резко — количество сывороточных альбуминов. В то же время количество альфа- и бета-глобулинов у больных рыб намного больше, чем у здоровых [72]. При этом обнаруживают только одну гамма-глобулиновую фракцию. Альбумин-глобулиновый коэффициент у больных годовиков составляет 0,17, у трехлеток — 0,25, у здоровых же годовиков он равен 0,91 и у трехлеток— 1,3 [11].
Таким образом, под действием вируса и его токсинов в организме больных рыб происходят тяжелые некротические и биохимические изменения, которые приводят их к гибели.
Впервые возбудитель вирусной геморрагической септицемии рыб был впервые выделен в 1965 году (Jensen, 1965). Вначале возбудитель ВГС рыб изолировали из клинического материала рыб в основном на Европейском континенте, затем от взрослого Тихоокеанского лосося в штате Вашингтон в 1988 г. [85].
В 1968 году возбудитель ВГС рыб был занесен в водоемы ЧССР из Дании вместе с оплодотворенной икрой радужной форели, а к 1989 г. возбудитель ВГС рыб был обнаружен в 13-ти европейских странах, включая Испанию, а так же Соединенных Штатах [65, 82].
Появление этой болезни в нашей стране также возможно с завозом оплодотворенной икры из зарубежных хозяйств, неблагополучных по ВГС рыб.
Эпизоотии сопровождаются массовой гибелью больных рыб, отход составляет 9 — 78%. ВГС рыб характеризовалась сезонностью, вспышки болезни и острое течение ее наблюдали главным образом осенью и зимой при температуре воды 8 — ЮсС [76, 83].
В теплое время года болезнь, как правило, протекает латентно, но при неблагоприятных условиях содержания и кормления рыб она может проявляться клинически и летом при температуре воды 15 — 20С.
ВГС рыб поражается форель в возрасте до одного года при размере рыб _ 5 — 7 см. Мальки и сеголетки, а также рыбы более старших возрастных групп более устойчивы к ВГС [64].
Источник инфекции -— больная рыба, ее выделения, трупы погибшей форели. Здоровая рыба заражается и через ложе и воду прудов, инфицированных вирусом ВГС. Заразное начало передается путем прямого контакта здоровой рыбы, с водой и инвентарем, живорыбной тарой, а также беспозвоночными животными-носителями инфекции [53].
Методы диагностики вирусной геморрагической септицемии рыб
Lorenzen et al. (1988) получил несколько клонов не нейтрализующих МА, специфически распознававших отдельные структурные белки вируса ВГС рыб [98]. Он показал, что МА к нуклеопротеину (IP5B11) являются ценным и специфическим реагентом, пригодным для быстрого обнаружения вируса ВГС рыб с помощью методов иммуноблоттинга, ELISA с захватом антигена и РИФ, позволяющим распознавать высоко консервативный эпитоп, присутствующий на белке N [99].
Sanz et al (1993) получили MA против испанского изолята вируса ВГС рыб. При исследовании 5 испанских и 3 референс-штаммов возбудителя ВГС рыб с помощью МА в реакции иммуноблоттинга, РИФ, ELISA и РН были выявлены определенные различия в реакционной способности [121].
Однако необходимо подчеркнуть, что использование одного-единственного вида МА не позволяет обнаружить все изоляты данного вируса [69].
ПЦР оказала революционное воздействие на молекулярную биологию и привела к значительным усовершенствованиям в диагностике болезней, благодаря своей способности копировать несколько копий определенной последовательности нуклеиновых кислот возбудителя в миллионы копий в течение короткого периода времени [17]. Сравнительно быстро ГЩР стали использовать для обнаружения геномов вирусов рыб [68].
Поскольку возбудитель ВГС рыб имеет однонитчатый РНК-геном, для постановки ПЦР на первоначальном этапе необходимо синтезировать кДНК с помощью обратной транскриптазы (ОТ-ПЦР), которая в дальнейшем служит матрицей для термостабильной ДНК-полимеразы, используемой в ПЦР [81].
Кроме того, описаны одноцикловые и гнездовые варианты постановки ОТ-ПЦР. При этом чувствительность гнездового варианта ПЦР для обнаружения генома вирусов была значительно выше [101].
Ряд исследователей разработали мультиплексный вариант ПЦР для одновременного обнаружения нескольких патогенов [134].
Bernard J. et al (1992) использовали специфические праймеры для ОТ-ПЦР-амплификации фрагмента N-гена вируса ИНГТ величиной в 252 нуклеотидов. Специфичность полученных ГЩР-продуктов была подтверждена с помощью биотинилированного ДНК-зонда с применением Саузерн- и дот-блот- анализов [47]. Из клинического материала зараженной рыбы с помощью данного метода последовательности гена вируса ИНГТ были обнаружены у радужной форели через 32 недели после заражения [48].
Chiou et al. (2006) [57] использовали модифицированный вариант ОТ-ПЦР для обнаружения генома вируса ИНГТ в зафиксированных в формалине и покрытых парафином тканях. Специфичность ПЦР-ампликона подтверждали с помощью дигоксиген-меченого ДНК-зонда. Данный метод представляет собой эффективное средство для обнаружения нуклеиновых кислот вируса ИНГТ «архивных» материалов.
Williams et al (1999) использовали данный метод для обнаружения последовательностей N-гена вируса ИНГТ в зафиксированных в формалине тканях радужной форели спустя 1 год после проведения экспериментального заражения [141].
Имеются сообщения и о других вариантах применения ГЩР для обнаружения генома возбудителя ВГС рыб. Kurath и др. (1997) [93] использовали иммуномагнитные гранулы (immunomagnetic beads) для связывания вируса из лизата инфицированной культуры клеток, которые затем использовали в качестве матрицы для ОТ-ПЦР.
Nishizawa Т. et al сообщали об использовании ОТ-ПЦР для амплификации фрагмента N-гена вируса ВГС рыб длиной в 510 п.о., при этом специфичность ПЦР-ампликонов подтверждали с помощью Саузерн-гибридизации с использованием внутреннего ДНК-зонда. С помощью данного метода выявлено 5 штаммов вируса ИНГТ, выделенных в Северной Америке и Японии, однако не получено специфических ПНР продуктов при анализе пяти других рабдовирусов рыб.
Разработка набора препаратов для выявления возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыб методом полимеразной цепной реакции
Для выделения РНК возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыб из лизата инфицированных клеток и органных материалов использовали фенольно - детергентный метод и выделение на сорбенте.
Выделение РНК фенольно-хлороформенной экстракцией занимало минимальное количество времени, и включало несколько этапов: - 10% суспензию органов или монослой инфицированных клеток ресуспендировали во фреоне 113 из расчета 0,2 см фреона на 1 см препарата. Затем проводили гомогенизацию суспензии и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. Отбирали верхнюю жидкую фазу, добавляли додецилсульфат натрия и протеиназу К до конечной концентрации 0,5% и 100 мкг/см3, соответственно, инкубировали при 37С в течение 10 мин. - Освобождение РНК от белков проводили забуференным фенолом (рН 4,5), внося его в смесь в соотношении 1:1 по объему. После перемешивания в течение 5 мин суспензию осаждали центрифугированием при 12000 об/мин. Затем верхнюю жидкую фазу обрабатывали равным объемом хлороформа и суммарную РНК осаждали этанолом в присутствии ацетата натрия.
При выделении РНК с использованием сорбента Silica проходило в несколько этапов, включающих лизирование клеточного материала, двухкратное отмывание РНК от клеточных включений (примесей).
При выделении методом нуклеосорбции к пробе объемом 150 мкл добавляли 600 мкл, лизирующего буфера, содержащего гуанидин тиоционат (ГТЦ). Затем к полученной смеси добавлялся сорбент (20 мкл) и пробу инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин, после чего сорбент осаждали центрифугированием (6-14 тыс.об.мин., 10 сек). Супернатант удаляли, сорбант ресуспендировали в отмывочном буфере, содержащем ГТЦ, после чего проводили центрифугирование при тех же режимах и супернатант удаляли. Затем сорбент ресуспендировали в 70% этаноле, осаждали при тех же условиях, супернатант удаляли, после чего сушили в пробирке с открытой крышкой при температуре 56С в течение 5 мин. Затем к сорбанту добавляли 40 мкл деионизованной воды, ресуспендировали и оставляли в термостате при температуре 56 С на 5 мин. После чего пробу центрифугировали и супернатант использовали для синтеза кДНК и ПЦР. Такое выделение является более трудоемким и длительным методом по сравнению с вышеописанным.
При сравнительной оценке методов получения суммарной РНК установлено, что применение фенола позволяет получать большие количества суммарной РІЖ. Однако при синтезе кДНК и постановке ПЦР нуклеиновую кислоту приходится разводить в десятки раз, чтобы избежать ингибирования реакции. При выделении РНК на сорбенте убираются ингибиторы реакции и количество получаемого материала для проведения дальнейшей работы получается стандартным. Поэтому в дальнейшей работе мы использовали при выделении РНК этот метод.
При выделении суммарной РНК из проб органов инфицированных рыб установлено, что для диагностических исследований лучше всего использовать почки и селезенку, так как эти органы в первую очередь поражаются возбудителем ВГС рыб.
Возбудитель ВГС рыб также выявлен во всех органах и тканях инфицированных рыб, поэтому в качестве исходного материала для выявления вирусной геморрагической септицемии рыб был также использован общий пул органного материла, а также жабры и жаберные крышки. С этой целью органный материал взвешивали, размельчали и гомогенизировали в lxSTE буфере (рН 7,6) в отношении 1:9. 4.2.2. Подбор праймеров
Для разработки набора препаратов для идентификации возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыб методом полимеразной цепной реакции необходимо было определить участок генома, структура которого с— одной стороны была бы достаточно вариабельной для надежной дифференциации данного вируса от других представителей рода Novirhabdovirus, а с другой стороны являлась бы достаточно консервативной, чтобы фиксировать структурные изменения и существенные этапы генетической модификации вируса, обусловленные различными селективными факторами.
Подбор праймеров осуществляли на основе анализа нуклеотидных последовательностей возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыб, имеющихся в генбанке. Нуклеотидные последовательности генов, кодирующих нуклеопротеин и гликопротеин, были проанализированы с помощью компьютерной программы «BioEdit». При ее помощи были найдены 100% гомологичные участки в последовательностях данных генов, на которые были рассчитаны олигонкулеотиды при помощи другой компьютерной программы «OLIGO 6.0». Праймеры были оптимизированы таким образом, чтобы обеспечить комплементарное взаимодействие с возможно большим количеством матриц, принадлежащих всем представителям рода Novirhabdovirus семейства Rhabdoviridae. Локализация праймеров на геноме и расчетные длины специфических продуктов ПЦР приводятся на рис. 4.4.
