Введение к работе
Актуальность проблемы. Histoplasma capsulatum — диморфный микромицет, возбудитель тяжелого инфекционного заболевания - гистоплазмоза. В настоящее время выделяют: H.capsulatum var. capsulatum – возбудитель классического (американского) гистоплазмоза, высокоэндемичные очаги которого расположены вдоль реки Миссисипи (США) и H.capsulatum var. duboisii - возбудитель африканского гистоплазмоза, распространенного в странах Центральной и Западной Африки. В последнее время гистоплазмоз зарегистрирован в ряде азиатских странах, таких как Индонезия, Тайланд, Индия [Manfredi R. et al., 1994; Poonwan N. et al., 1998].
Еще один вариант H. capsulatum var. farciminosum – возбудитель эпизоотического лимфангоита у лошадей, ослов, мулов. Возбудитель широко распространен в Европе, Северной Африке, Индии и Южной Азии. В патологии людей какого-либо существенного значения не имеет [Kauffman C.A., 2007].
В настоящее время случаи заболевания гистоплазмозом зарегистрированы более чем в 60 странах мира. В России до сих пор не было достоверно подтверждено ни одного случая заболевания гистоплазмозом. Можно предположить, что причина заключается в малой осведомленности работников здравоохранения в отношении этого микоза и отсутствии коммерческих препаратов для диагностики.
Разнообразие клинических проявлений наряду с отсутствием патогномоничных симптомов являются причинами трудностей диагностики гистоплазмоза. В настоящее время лабораторная диагностика основана на использовании культурального, биологического и иммунологического методов.
Традиционная схема лабораторного анализа с выделением культуры занимает до 30 суток. Общим для всех иммуносерологических методов, направленных на выявление антигенов гриба, является их невысокая чувствительность и недостаточная специфичность. В настоящее время интенсивно развиваются альтернативные методы диагностики, позволяющие решить данные проблемы. В первую очередь, это полимеразная цепная реакция, позволяющая выявлять данный патоген независимо от этапа культивирования гриба.
Цель работы заключалась в конструировании амплификационной тест-системы для выявления ДНК H.capsulatum методом полимеразной цепной реакции.
Задачи исследования:
-
Провести анализ нуклеотидных последовательностей, представленных в различных генетических базах данных, с целью подбора праймеров для идентификации H.сapsulatum методом ПЦР.
-
Оптимизировать условия проведения ПЦР, оценить специфичность и чувствительность выбранных олигонуклеотидных затравок HcMs8s-Ms8as3, HcMs8s2-Ms8as, HcCBP1s-HcCBP2as на широком наборе гомологичных и гетерологичных штаммов и разработать амплификационную тест-систему для идентификации H. сapsulatum.
-
Определить оптимальные методы выделения и очистки ДНК возбудителя гистоплазмоза при анализе чистых культур микромицетов, объектов внешней среды и биологического материала, контаминированных клетками H. сapsulatum.
-
Оценить эффективность сконструированной амплификационой тест-системы для диагностики экспериментального гистоплазмоза.
Научная новизна
Впервые для выявления ДНК возбудителя гистоплазмоза в качестве ДНК мишеней для посадки праймеров использовали ген, кодирующий белок мицелиальной фазы MS8 и ген, опосредующий синтез кальций-связывающего белка CBP в дрожжевой фазе.
На основании полученных результатов получено положительное решение о выдаче патента на изобретение №2011127594/10(040875) «Олигонуклеотидные праймеры для идентификации возбудителя гистоплазмоза Histoplasma capsulatum» (от 04.06.2012 г., приоритет от 05.07.2012 г.).
На основе гена ms8 впервые разработана отечественная амплификационная тест-система для идентификации возбудителя гистоплазмоза методом ПЦР и показана ее эффективность при обнаружении ДНК гриба в объектах внешней среды, контаминированных клетками H.сapsulatum и биологическом материале, полученном от экспериментально зараженных животных.
В результате исследований предложен способ выделения ДНК возбудителя гистоплазмоза, позволяющий проводить эффективный лизис клеток и очистку ДНК патогенных грибов, обеспечивающий высокую чувствительность и специфичность реакции амплификации.
Впервые схема лабораторной диагностики гистоплазмоза дополнена этапами ПЦР с использованием разработанной тест-системы при идентификации чистых культур H. сapsulatum, а также обнаружении возбудителя в клиническом материале и пробах из объектов внешней среды.
Практическая ценность
Материалы научных исследований использованы при разработке МУ 3.4.3008-12 «Порядок эпидемиологической и лабораторной диагностики особо опасных «новых» и «возвращающихся» инфекционных болезней» (утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 28.03.2012 г.), проекта Методических рекомендаций «Идентификация возбудителей особо опасных микозов по таксономическим признакам и эпидемиологической значимости» (представлены для утверждения в Федеральную службу по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека).
По результатам диссертационной работы составлены Методические указания «Лабораторная диагностика особо опасных микозов» (представлены для утверждения в Федеральную службу по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 3.04.2012 г.), методические рекомендации «Использование олигонуклеотидных праймеров для выявления возбудителей гистоплазмоза с помощью полимеразной цепной реакции» (утверждены директором института 30.06.2009 г.) и методические рекомендации «Подготовка проб контаминированных возбудителями гистоплазмоза для исследования методом ПЦР» (утверждены директором института 10.10.2011 г.).
Для государственной регистрации проведены внутриинститутские комиссионные испытания параметров качества сконструированной амплификационой тест-системы (чувствительность, специфичность) (акт испытаний от 30.06.2010 г.), разработана и утверждена нормативная документация, в том числе Пусковой регламент, Технические условия и Инструкция по применению к «Набору реагентов для выявления ДНК микромицетов вида Histoplasma методом полимеразной цепной реакции «Амплиген Гисто» (утверждены директором института 10.10.2011 г.).
Сконструированную амплификационную тест-систему и предложенные праймеры используют в лабораториях Волгоградского научно-исследовательского противочумного института для анализа генетических особенностей музейных штаммов H. сapsulatum и испытательно-лабораторном центре при исследовании поступающих проб на наличие возбудителей микромицетов II группы патогенности.
Материалы включены в лекционный материал программы повышения квалификации врачей по специальности «Лабораторная микология» утвержденной Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 21.04.2005 г.; курсов повышения квалификации врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму утвержденных Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 24.09.2007 г.; программы профессиональной переподготовки по специальности «Бактериология. Основы безопасной работы с патогенными биологическими агентами (ПБА) I-II группы» утвержденной Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 27.08.2010 г.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Группоспецифические праймеры HcMs8s-Ms8as3 подобранные, на основе нуклеотидной последовательности гена, кодирующего белок мицелиальной фазы Ms8 и праймеры HcCBP1s-HcCBP2as сконструированные на основе гена кальций-связывающего белка CBP, обеспечивают амплификацию ДНК H. сapsulatum var. capsulatum, H. сapsulatum var. duboisii и H. capsulatum var. farciminosum.
-
Амплификационная тест-система, сконструированная на основе праймеров HcMs8s-Ms8as3, позволяет детектировать H. сapsulatum var. capsulatum, H. сapsulatum var. duboisii и H. capsulatum var. farciminosum в концентрации не ниже 1х104 кл/мл со 100 % специфичностью при анализе чистых культур и проб из объектов окружающей среды (почвы, воды), искусственно контаминированных возбудителями гистоплазмоза.
-
Метод ПЦР с разработанной тест-системой эффективен для диагностики гистоплазмоза при исследовании биологического материала от экспериментально зараженных животных.
-
Праймеры HcMs8s2-Ms8as, обеспечивают дифференциацию H. сapsulatum var. capsulatum и H. capsulatum var. farciminosum от H. сapsulatum var. duboisii методом ПЦР с чувствительностью 1х105 – 1х106 кл/мл.
Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены на V Всероссийском конгрессе по медицинской микологии, Москва, Национальная Академия Микологии 2007 г.; на III Международной (XII Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции Москва, 2008 г.; научно-практической конференции по медицинской микологии «XI Кашкинские чтения» Санкт-Петербург, 2008 г.; на Междисциплинарных микологических форумах, Москва Национальная Академия Микологии 2009 и 2010 гг.; на научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире» Оболенск, 2009 г.; на Международной научно-практической конференции «Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней» Новосибирск, Россия, 2009 г.; научно-практической конференции по медицинской микологии «XII Кашкинские чтения» Санкт-Петербург, 2009 г.; на V Международной (XIV Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции, Москва, 2010 г.; на научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» Оболенск, 2010 г.; на научно-практической конференции по медицинской микологии «XIII Кашкинские чтения» Санкт-Петербург, 2010 г.; на VII Всероссийской научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика 2010» Москва, 2010 г.; на III научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» Оболенск, 2011 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, из них 7 – в рецензируемых периодических изданиях, рекомендованных ВАК для защиты докторских и кандидатских диссертаций.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 118 листах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, 6-ти глав собственных исследований, иллюстрированных 9 таблицами и 13 рисунками, заключения, выводов и библиографического указателя, включающего 159 источников (27 отечественных и 132 иностранных авторов).
