Содержание к диссертации
Введение
1. CLASS Обзор литератур CLASS ы 11
1.1 Биохимическая структура микобактериальной клетки 11
1.2 Иммунитет при туберкулезе 16
1.3 Методы диагностики туберкулеза крупного рогатого скота 18
1.3.1 Эпизоотологические данные 19
1.3.2 Клинический метод 19
1.3.3 Аллергический метод 20
1.3.4 Патологоанатомический и гистологический методы 23
1.3.5 Бактериологический метод 24
1.3.6 Серологический метод 28
1.4 Иммуноферментный анализ 30
1.5 Геномная дактилоскопия 33
1.6 Сполиготипирование 33
1.7 Полимеразная цепная реакция 34
1.8 Полимеразная цепная реакция в диагностике туберкулеза 36
2. Материалы и методы исследований 39
2.1 Материалы 39
2.2 Методы исследования 46
3. Результаты собственных исследований
3.1 Оценка метода выделения ДНК и проведение полимеразной цепной реакции тест-системой НПО «Нарвак» (г.Москва)
3.1.1 Оценка метода выделения ДНК и постановки полимеразной цепной реакции тест-системой для выявления возбудителей туберкулеза M.bovis и M.tuberculosis «MTB-com» ООО «ИнтерЛабСервис» ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ (г.Москва) 56
3.1.2 Оценка метода выделения ДНК и постановки полимеразной цепной реакции тест-системой для обнаружения ДНК Mycobacterium tuberculosis-bovis «Политуб» НПФ «Литех» (г.Москва)
3.2 Оценка метода выделения ДНК набором реагентов для обнаружения ДНК в сыворотке или плазме крови методом полимеразной цепной реакции НПФ «Литех» (г.Москва)
3.2.1 Оценка метода подготовки генетического материала набором реагентов для выделения ДНК из биопроб для анализа методом полимеразной цепной реакции «ДНК-экспресс» НПФ «Литех» (г.Москва)
3.2.2 Оценка метода подготовки генетического материала набором «Выделение ДНК на магнитном сорбенте» 61
3.3 Анализ информативности и специфичности существующих и разработанных праймеров
3.4 Динамика обнаружения вакцинного штамма M.bovis BCG в крови и молоке крупного рогатого скота, иммунизированного данной вакциной
3.5 Эпизоотическая обстановка и результаты комплексного исследования на туберкулез крупного рогатого скота в хозяйствах Республики Татарстан.
4. Обсуждение результатов 83
5. Выводы 102
6. Практические предложения 103
7. Список литературы 104
- Патологоанатомический и гистологический методы
- Полимеразная цепная реакция в диагностике туберкулеза
- Оценка метода выделения ДНК и постановки полимеразной цепной реакции тест-системой для выявления возбудителей туберкулеза M.bovis и M.tuberculosis «MTB-com» ООО «ИнтерЛабСервис» ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ (г.Москва)
- Оценка метода подготовки генетического материала набором «Выделение ДНК на магнитном сорбенте»
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время туберкулез крупного рогатого скота занимает ведущее место в структуре инфекционных заболеваний.
Основным методом прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота является внутрикожная туберкулиновая проба. Однако в связи с образованием неспецифических или парааллергических реакций на туберкулин возникают сомнения в правильности диагностики туберкулеза и диагностической ценности туберкулина. Не все зараженные возбудителем туберкулеза животные реагируют на внутрикожное введение туберкулина. Оставаясь в стаде, такие животные способны инфицировать внешнюю среду и заразить здоровых животных. Установлено также, что здоровые от туберкулеза животные дают положительную реакцию на введение туберкулина и подвергаются необоснованной сдаче на убой, нанося значительные экономические затраты.
Лабораторная диагностика туберкулеза отличается продолжительностью выполнения и относительно низкой эффективностью. Срок бактериологического исследования составляет 3 месяца. Эффективность бактериологического метода зависит от качества питательных сред, концентрации возбудителя в исследуемом материале, степени загрязненности последнего посторонней микрофлорой и времени, прошедшего с момента заражения животного.
Сравнительно недавно для диагностики инфекционных болезней в ветеринарной практике стали применять метод полимеразной цепной реакции. В России, начиная с 1992 года, были созданы отечественные наборы реагентов, предназначенные для определения возбудителя туберкулеза крупного рогатого скота. Однако, остаются пока открытыми вопросы стандартизации и контроля качества тест-систем. В основе метода тест-систем лежит подготовка проб к проведению ПЦР с использованием метода экстракции ДНК, позволяющий концентрировать препараты ДНК и
одновременно очищать их от ингибиторов ПЦР и амплификация специфического участка ДНК микобактерий за счет многократного повторения циклов денатурации ДНК в исследуемой пробе, отжига специфических олигонуклеотидных затравок (праймеров) и синтеза комплементарных цепей ДНК с помощью фермента Taq-полимеразы, с последующей регистрацией результатов реакции гель-электрофорезом.
Для ПЦР-анализа пригодны различные биологические материалы -слизь, моча, мокрота, кровь, сыворотка, молоко, соскобы эпителиальных клеток, кусочки органов, гистологические препараты. ПЦР - метод относится -к прямым методам обнаружения возбудителя, позволяющий обнаружить до одной молекулы ДНК в исследуемой пробе, даже когда организм является нежизнеспособным. Результаты исследования можно получить в день проведения анализа.
Цель и задачи исследования. Целью работы явилось изучение эффективности отечественных тест-систем для выявления и идентификации ДНК микобактерий, при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота в неблагополучных и ранее неблагополучных по туберкулезу хозяйствах, определение роли и места ПЦР-метода для выявления ДНК штамма M.bovis BCG у иммунизированных животных, а также его пригодности для прижизненной и посмертной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота и внедрение ПЦР в ветеринарную практику.
Для выполнения ставились задачи:
Определить пригодность полимеразной цепной реакции для прижизненной и посмертной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота с использованием существующих на сегодняшний день отечественных тест-систем с определением их чувствительности и специфичности.
Отработать различные методы подготовки генетического материала для ПЦР и определить наиболее эффективный для использования при выделении ДНК M.bovis.
Разработать наиболее информативные и специфичные паймеры для ПЦР, проанализировать их эффективность по сравнению с существующими рекомендованными праймерами.
Определить пригодность полимеразной цепной реакции для установления сроков выявления ДНК вакцинного штамма M.bovis BCG у иммунизированных животных.
Проводить системное исследование биологического материала от животных, положительно реагирующих на внутрикожное введение туберкулина из благополучных и ранее неблагополучных хозяйств.
Научная новизна. Установлено, что наиболее чувствительными отечественными тест-системами являются тест-система «МТВ-сот», позволяющая обнаруживать ДНК M.tuberculosis-bovis и тест-система НПО «Нарвак», которая позволяет идентифицировать M.bovis от M.tuberculosis.
Впервые при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота для подготовки генетического материала применялся метод магнитного сорбента, который оказался наиболее эффективным при работе с пробами патматериала, молока, культур. При выделении ДНК из крови установлено, что наиболее эффективным является «Набор обнаружения ДНК в сыворотке или плазме крови методом ПЦР».
Установлено, что праймер, обеспечивающий синтез региона M.tuberculosis-bovis размером 500 н.п. является достаточно чувствительным и специфичным.
Впервые изучена динамика выявления вакцинного штамма M.bovis BCG методом ПЦР и установлено, что ДНК M.bovis BCG обнаруживается в крови и молоке иммунизированных коров в течение 3 месяцев после вакцинации (100%) и через 4 и 5 месяцев у 30% животных.
Установлено, что при посмертной диагностике в неблагополучных и ранее неблагополучных по туберкулезу хозяйствах при исследовании 400
8 проб лимфатических узлов полученных от положительно реагирующих на туберкулин коров, ПЦР-метод дает положительный результат в 17,75 % случаях, бактериологический метод в 5,75 % случаях, патологоанатомический в 15 % случаях.
Полученные результаты регулярно представлялись в Главное Управление ветеринарии КМ РТ для использования в оперативной работе по профилактике туберкулеза крупного рогатого скота.
Практическое значение. Полимеразную цепную реакцию целесообразно использовать для отличия больных животных от животных, иммунизированных вакциной BCG.
Тест-систему «МТВ-com» и праймер, образующий в результате амплификации последовательность размером 500 н.п. из региона М. tuberculosis-bovis, целесообразно использовать в лабораторной диагностике туберкулеза крупного рогатого скота для индикации Mycobacterium tuberculosis-bovis. Для идентификации микобактерий целесообразно использовать тест-систему НПО «Нарвак».
Для более эффективного выделения ДНК из патматериала, молока, полевых культур целесообразно использовать метод магнитного сорбента, из крови - «Набор реагентов для обнаружения ДНК в сыворотке или плазме крови».
Использование ПЦР-метода в ветеринарной службе РТ позволили сократить сроки диагностики и дифференциальной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на:
Всероссийской научной конференции (Казань, КГАВМ, 2002 г);
Конференции молодых ученых и специалистов Казанской государственной академии ветеринарной медицины (22 января 2004 г);
Международной научной конференции, посвященной 131-летию КГАВМ (Казань, 2004);
Научной конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии», посвященной 200-летию КГУ (Казань, июнь 2004);
III Международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», посвященная 30-летию ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии (Москва, 2004);
Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 19-21 октября 2004 г).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ.
Внедрение. Результаты исследований широко используются в практике ветеринарной службы Республики Татарстан, в лабораторных исследованиях КГАВМ, включены в учебный процесс по специальности эпизоотология, микробиология, биохимия.
На защиту выносятся: 1. Результаты исследований методом полимеразной цепной реакции в прижизненной и посмертной диагностике туберкулеза крупного рогатого скота. 2. Сравнительная оценка ПЦР-метода по сравнению с другими методами исследования, такими как аллергическая проба и бактериологический метод, а также возможность определения сроков выделения с молоком вакцинного штамма M.bovis BCG у иммунизированных данной вакциной животных. 3. Использование полученных данных в ветеринарной службе Республики Татарстан.
Диссертация изложена на 127 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов, списка литературы, включающего 222
*
10 источника, из них 91 иностранных авторов. Диссертация иллюстрирована 8 таблицами и 11 рисунками.
Патологоанатомический и гистологический методы
Инструкцией по борьбе с туберкулезом предусмотрено, животных, имеющих положительную реакцию на туберкулин сдавать на убой в течение 14 дней после выявления, подвергать контрольно-диагностическому убою с последующим тщательным патологоанатомическим исследованием.
По данным многих исследователей, при туберкулезе наиболее часто обнаруживаются поражения легких, печени, почек, селезенки, серозных покровов, половых органов, молочной железы, костей (51; 108; 215).
Отмечено, что у больного туберкулезом крупного рогатого скота лимфатические узлы грудной полости поражаются в 100% случаев, легкие -99%, селезенка - 5%, вымя - 3% случаев (51).
Макроскопически сформировавшийся туберкулезный узелок представляет собой округлое образование различной величины. Центральная его часть желтовато-белого цвета, крошится наподобие творога (казеозный некроз), в ней можно увидеть и прощупать крупинки извести. По периферии располагается серовато-белый пояс грануляционной ткани.
Однако, при заражении крупного рогатого скота микобактериями человеческого и птичьего видов, сапрофитами и атипичными типами патологоанатомические изменения обнаруживаются редко (95).
В последние годы установлены случаи проявления особой формы туберкулезного процесса, когда в организме находятся жизнеспособные микобактерии туберкулеза, а специфические туберкулезные изменения отсутствуют. Не выявленные животные с таким латентным процессом являются основным источником повторного возникновения болезни в ранее оздоровленных от туберкулеза хозяйствах (108). Сущность метода заключается в выявлении и выделении культур микобактерий, определение вида возбудителя туберкулеза.
Бактериоскопический метод. Бактериоскопипю проводят с целью определения наличия и степени обсемененности материала кислотоустойчивыми микобактериями. Используют молоко, бронхиальную слизь, фекалии, истечения из влагалища, кусочки пораженных паренхимотозных органов. В лаборатории прежде всего проводят бактериоскопию мазков, окрашенных по Цилю-Нильсену. Сущность метода заключается в способности микобактерий, окрашенных фуксином, удерживать краситель после обесцвечивания в солянокислом спирте (17).
Бактериоскопические исследования являются наиболее быстрыми, относительно простым и дешевым способом обнаружения микобактерий туберкулеза. Однако, способ световой микроскопии обычно дает положительный результат при содержании 100 тыс и более бактериальных клеток в 1 мл исследуемого материала (127).
Люминесцентный метод основан на способности микобактерий к окрашиванию люминесцентными красителями и свечению под действием сине - фиолетового освещения. Данный метод считается более чувствительным. Так, по данным (52) Колычева Н.М., люминесцентный метод позволил повысить чувствительность микроскопической диагностики на 17% , сократив трудоемкость исследования в 3 - 4 раза.
Разработан ускоренный метод выделения туберкулезных микобактерий из молока с помощью прямого флюорохромирования, При этом в 100% случаев результаты подтверждены классическим методом - заражением животных и выделением чистой культуры (43).
В целях повышения вероятности обнаружения микобактерий бактериоскопическим методом, рекомендуется использовать методы обогащения исследуемого материала путем флотации, седиментации и гомогенизации (100; 23). В этом плане наиболее широкое распространение получил метод флотации, при котором туберкулезные бактерии извлекают из водной суспензии при помощи углеводородов или других жидкостей с меньшей, чем у воды, относительной плотностью - ксилол, бензин, керосин и др. (35). С помощью этого метода микобактерий туберкулеза обнаруживаются на 10 - 15% чаще, чем обычным способом приготовления мазков (127).
Однако, ни один из выше перечисленных способов не позволяет провести четкую дифференциацию между возбудителем туберкулеза и атипичными микобактериями. Поэтому, данные методы бактериоскопии могут быть использованы лишь в комплексе с другими диагностическими методами.
Культуральный метод дает положительные результаты при наличии 20-100 микобактерий в 1 мл исследуемого материала (37; 94).
В основе бактериологической диагностики туберкулеза крупного рогатого скота лежит способность микобактерий размножаться in vitro на соответствующих питательных средах.
Установлено, что при бактериологических исследованиях мышц и лимфатических узлов, реагирующих на туберкулин, но не имеющих видимых патоморфологических изменений животных, микобактерий туберкулеза можно выявить в 10 - 15% случаев (53).
Чтобы получить чистые культуры возбудителя туберкулеза, материал подвергают предварительной обработке. Предложено множество методов обработки патологического материала с применением кислот, щелочей и других веществ, которые гомогенизируют материал и убивают сопутствующую микрофлору. Выбор метода зависит от свежести материала. Наиболее часто применяют общеизвестные методы А.Н. Аликаевой, Гона, Левенштейна, Сумиоши, Мазури и др.. Однако, по мере увеличения концентрации кислоты или щелочи при обработке, снижается вероятность выделения возбудителя из патологического материала. Так, обработка материла 2% -ным раствором NaOH приводит к потери микобактерий до 90% (57).
Обработанный для исследования материал высевают в 5 - 10 пробирках с питательной средой Левенштейна-Йенсена и одну из следующих сред: Гельберга, Петраньяни, Финн-2, ФАСТ-ЗЬ. Засеянные пробирки укладывают в наклонном положении и инкубируют в термостате при 37С. Для выявления начального роста пробирки с посевами просматривают не реже одного раза в неделю. Если обнаруживается рост, то у выделенных культур изучают характер колоний, тинкториальные свойства при окраске по Циль -Нильсену, морфологические свойства. Рост микобактерий туберкулеза бычьего вида чаще обнаруживают на 20-60 сутки, человеческого на 20-30, птичьего - на 10-20, атипичных микобактерий - на 3-30 сутки.
Полимеразная цепная реакция в диагностике туберкулеза
Анализ литературных данных за последние 5 лет показывает, что в диагностике туберкулеза и микобактериозов превалируют методики, связанные с применением ПЦР (93; 21; 70; 31; 26; 124; 64).
В настоящее время выпускаются специальные наборы для полимеразной цепной реакции для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота, комплект приборов для проведения этой реакции. Следует отметить, что метод требует высокой квалификации исполнителя, правильного выбора праймера - затравки. Геном возбудителя туберкулеза содержит порядка 6 млн. пар нуклеотидов и первичная структура ДНК генома возбудителя туберкулеза крупного рогатого скота стала известна совсем недавно (2002 год), поэтому праймеры, включенные в наборы для ПНР, определены лишь опытным путем и не являются абсолютно специфичными для M.Bovis, о чем свидетельствуют результаты исследования А.Н.Шарова и др (125, 126). Анализируя литературные данные по применению ПЦР в диагностике туберкулеза, следует отметить, что в основном используются тест-системы, основанные на амплификации элемента IS6110 имеющийся у представителей любого из четырех видов M.tuberculosis Comlex (5), гена, кодирующего белок теплового шока размером 65 кД, фрагмента гена МРВ 64 и гена 16 S р РНК, гена белка размером 70 кД (93).
Основным недостатком, препятствующим в настоящее время широкому использованию ПЦР в клинической практике диагностики является относительная высокая стоимость тест-систем и необходимость транспортировки их при температуре не выше +20С особенно на большие расстояния. Нарушение температурного режима на любом из этапов доставки наборов ведет к уменьшению сроков использования праймеров для проведения ПЦР. Также на основании появившихся в последние годы публикаций можно предположить и наличие определенного процента гипердиагностики за счет выявления в ПЦР не только живых, но и мертвых микобактерий, получение ложноотрицательных результатов, вызванных эндогенными ингибиторами полимеразы (162, 197; 187) и неправильный выбор антикоагулянтов для крови (126). Учитывая это, в процессе проведении ПЦР при диагностике туберкулеза нужно особое внимание уделять подготовке проб с целью удаления ингибиторов ПЦР и накоплению в пробе специфичной ДНК микобактерий для успешного проведения ПЦР. С этой целью применяются различные методы, основанные прежде всего на лизисе и адсорбции проб, многократной промывке, и элюции (21). Однако этот путь пробоподготовки может привести к потере некоторого количества специфичной ДНК микобактерий туберкулеза. Более эффективный метод пробоподготовки предлагают Владимирский М.А. и др. Он основан на иммуномагнитной сепарации микобактерий в минимальном объеме с последующим их лизисом. Полимеразная цепная реакция требует высокой аккуратности проведения анализа, так, по данным Панина А.Н., Обухова И.Л., Шипулина Г.А. и др. (81), следовые количества положительной ДНК при попадании в реакционную пробирку также вызывают в процессе ПЦР амплификацию специфического фрагмента ДНК и, как следствие, появление ложноположительных результатов.
Из преимуществ ПЦР важно отметить высокую чувствительность метода в диагностике туберкулеза. Так, по данным С.Н. Радюк, Г.Р. Мацевич (93), была определена чувствительность ГЩР-тест-системы "АмлиСенс МТБ-ком" (ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ) с помощью метода лимитирующих разведений в Nested-варианте ПЦР и составила 2 копии ДНК МВТ в пробе. По их данным, чувствительность метода ПЦР достигает до 97%.
Возможности ПЦР-анализа настолько широки, что позволют обнаружить ДНК М.tuberculosis у 1% скелетов периода от 2000 до 1500 лет до н.э., а также у перуанских мумий 1000-летней давности (93)
Метод ПЦР может быть полезен для идентификации микобактерий. Так же по данным С.Н. Радюк, Г.Р. Мацевич (93), выявление вариаций в последовательности нуклеотидов гена, кодирующего белок 32 кД, а также в последовательности разделяющей гены 16S и 23S р-РНК, позволяет проводить идентификацию различных видов микобактерий туберкулеза и штаммов одного вида.
Все вышеизложенное свидетельствует о широчайших возможностях метода. Внедрение ПЦР-технологии в широкую ветеринарную практику позволит осуществлять диагностику на качественно новом уровне.
Оценка метода выделения ДНК и постановки полимеразной цепной реакции тест-системой для выявления возбудителей туберкулеза M.bovis и M.tuberculosis «MTB-com» ООО «ИнтерЛабСервис» ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ (г.Москва)
Диагностическая тест-система «MTB-com» нами применялась при исследовании проб 400 проб лимфатических узлов из хозяйств: ООО «Яшь-Куч» Алькеевского района, СПК «Макулово», ПХ «Восход», СХПК им.Вахитова, СХПК «Волга», ООО «Красный Восток» Перхнее-Услонского района, КП «Комсомолец», КП «Озерное», КП «Кугеево», КП «Косяковский», КП «Приволжье» Зеленодольского района, ОПХ «Столбищенское», СПК «Победа» Лаишескогорайона, СКП «Иске Рязап» Спасского района Республики Татарстан, колхоз «Восточный» Бугурусланского района Оренбургской Области и 150 проб крови и молока из хозяйств СПК «Урожай», ОАО «Токарликова» Альметьевского района, КП «Родина» Дрожжановского района, СХП «Мир», АККХ «Чулпан», АККХ «Заря», АККХ «Авангард», ТНВ «Колос», АКХ «Юлдуз», АКХ «Подберезье», АККЪХ «Яна Юл» Кайбицкого района, ООО «Химокам-Агро» Нижнекамского района, КП «Фрунзе» Тюлячинского района, СКП «Весна» Чистопольского района Республики Татарстан, колхоз «Заветы Ленина», колхоз «Новая жизнь» Бугурусланского района Оренбургской области.
Данная тест-система обладает высокой чувствительностью и специфичностью. С помощью нее нам удалось обнаружить ДНК M.bovis в музейном туберкулезном препарате лимфоузла, фиксированного в формалине. После исследовании полевых штаммов M.bovis, выращенных в Республиканской ветлаборатории все пробы регистрировались как ПНР положительные с четко выраженной светящейся полосой на уровне положительного контроля. Большим преимуществом тест-системы является использование в процессе амплификации внутреннего контрольного образца (ВКО), который позволяет контролировать процесс прохождения реакции амплификации, а также тестировать наличие в пробах веществ, ингибирующих полимеразную цепную реакцию. Использование данного контроля позволяет определить наличие ингибиторов ПЦР в каждой отдельной пробе, а не только по наличию контролей. Тест-система позволяет выявить M.tuberculosis-bovis Complex. Данная тест-система не требует таких жестких условий транспортировки и хранения как тест системы «Нарвак» и «Политуб».
Оценка метода выделения ДНК и постановки полимеразной цепной реакции тест-системой для обнаружения ДНК Mycobacterium tuberculosis bovis «Политуб» НПФ «Литех»
Данную тест-систему использовали при исследовании 400 проб лимфатических узлов из хозяйств ООО «Яшь-Куч» Алькеевского района, СПК «Макулово», ПХ «Восход», СХПК им.Вахитова, СХПК «Волга», ООО «Красный Восток» Перхнее-Услонского района, КП «Комсомолец», КП «Озерное», КП «Кугеево», КП «Косяковский», КП «Приволжье» Зеленодольского района, ОПХ «Столбищенское», СПК «Победа» Лаишескогорайона, СКП «Иске Рязап» Спасского района Республики Татарстан, колхоз «Восточный» Бугурусланского района Оренбургской Области и 150 проб крови и молока их хозяйств: ТОО «Чути», ТОО «Урал», СПК «Хансверкино» Бавлинского района, СПК «Бухурай», СПК «Hyp» Заинского района, КПП «Красный Маяк», АП «Балтач» Камско-Устьинского района, СХК «Яна Арыш», КП «Урахча» Рыбно-Слободского района Республики Татарстан, ООО «Горный» Бугурусланского района Оренбургской области. Данной тест-системы не позволяет дифференцировать M.tuberculosis и M.bovis, обнаруживает комплекс этих микроорганизмов. Однако не всегда после применения данной тест-системы нам удавалось регистрировать ПЦР-положительные пробы в агарозном геле, которые после электрофореза в полиакриламидном геле регистрировались как ПЦР-положительные.
Суть метода заключается в подготовке генетического материала (ДНК микобактерий) фенол-хлороформенным методом. Данный набор нами был испытан на 12 штаммах полевых культур M.bovis, на одном штамме M.tuberculosis, штамме M.bovis BCG, 12 атипичных культур микобактерий, 41 пробе лимфатических узлов которые имели видимые туберкулезные поражения, 10 пробах крови от животных через 30 дней после иммунизации вакциной BCG. Во всех случаях набор надежно работал. В состав набора входит раствор т-РІЖ, который может существенно увеличить количество выделяемой ДНК за счет того, что РНК не будет конкурировать с ДНК за связывание с сорбентом.
Рыхлый осадок, который образуется в результате центрифугирования на дне пробирки очень легко не заметить, поэтому при работе с ним рекомендуется ориентировать пробирки в роторе центрифуги, обозначая таким образом местоположение осадка. Набор предусматривает использование фенола, работать с ним нужно предельно осторожно и внимательно.
Оценка метода подготовки генетического материала набором «Выделение ДНК на магнитном сорбенте»
Магнитные частицы покрытые БіОг поставляются в виде водной суспензии в готовом для использования виде. Высокое содержание окиси железа позволяет быстро собирать частицы. Частицы прочно удерживаются на стенке пробирки магнитом, что облегчает промывку и отбор жидкости из пробирки.
Применяемые в наборе магнитные частицы обладают повышенной емкостью связывания ДНК по сравнению с обычными сорбентными методами.
Основные преимущества предлагаемых магнитных частиц по сравнению с обычными сорбентами на основе SiO?:
возможность выделения ДНК из образцов в выездных лабораториях, где отсутствуют условия для использования токопотребляемых приборов (центрифуги, встряхиватели и т.д.);
отсутствие необходимости осаждать образец центрифугированием приводит к минимальному повреждению выделяемой ДНК;
обладают более высокой удельной емкостью при связывании ДНК и способностью легче «отдавать» связанную ДНК при элюции;
возможность практически полностью отбирать водную фазу без риска захватить мелкие частички сорбента, так как сорбент собирается и прочно удерживается на стенке пробирки, помещенной в магнитный штатив;
возможность легко маштабировать эксперимент по выделению практически с линейным выходом. Что невозможно с сорбентами.
Для эффективного использования магнитных частиц предлагаются простые и удобные в использовании универсальные магнитные штативы.
Штатив предназначен для работы с шестью пробирками объемом 1,5 мл и/или шестью пробирками объемом 5,4 мл и рассчитан на внешний диаметр пробирки 12 мм.
Штатив позволяет быстро собирать магнитные частицы из объема 1-5 мл.
Используемые в штативе магниты могут произвольно регулироваться по высоте, а также могут размешаться как в горизонтальном, так и в вертикальном положении.
Полимеразную цепную реакцию проводили с праймерами тест-систем «Нарвак», «Политуб», «МТБ-ком» по инструкции изготовителя, также с праймерами, образующие в результате амплификации последовательность размером 347, 500 и 247 н.п.
Для подбора праймеров пользовались специально разработанными компьютерными программами и базой данных о нуклеотидной последовательности. Температуру плавления праймеров определяли с помощью специализированных компьютерных программ, в частности программы «Oligos». Грубый подсчет температуры плавления праймеров проводили вручную с помощью формулы: Tm = 4C(G+C)+2C(A+T)-5C. Считается, что данная формула справедлива для относительно коротких праймеров длиной до 20 нуклеотидов.
В отдельной пробирке готовили общую реакционную смесь по количеству образцов (Таб.2), в число которых входили положительный контроль ПЦР (ДНК M.bovis BCG) и отрицательный контроль (J деионизованная вода )
Реактивы вносили в последовательности, приведенной в таблице. Смесь перемешивали и разливали по 20 мкл в предварительно промаркированные пробирки для ПЦР. В каждую пробирку вносили по 5 мкл испытуемой ДНК и по 40 мкл (примерно 2 капли) минерального масла, затем пробы помещали в предварительно прогретый амплификатор. Для амплификации использовали температурный режим, представленный в таблице 3.
Амплифицированную ДНК разделяли методом горизонтального электрофореза в 2%-ном агарозном геле с трис-боратным буфером в присутствии бромида этидия (результаты регистрировали, просматривая гель в ультрафиолетовом свете), а также методом вертикального электрофореза в 6%-ном полиакриламидном геле, с последующим окрашиванием геля нитратом серебра (рис. 5).
В результате амплификации было установлено, что при испытании данных праймеров на 12 штаммах M.bovis на штамме М.tuberculosis, на вакцинном штамме M.bovis BCG и на атипичных культурах микобактерий мы получили следующий результат. Рис. 5 Камера для вертикального электрофореза Праймер, предложенный Streevatsan S, синтезирующий участок генома размером 347 н.п. со всеми штаммами, в том числе и с атипичными микобактериями давал 100 %-ный ПЦР-положительный результат (рис.6).
