Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 14
1.1. Молекулярно-генетическая диагностика 14
1.1.1. Методы выделения нуклеиновых кислот 14
1.1.1.1. Детергентный метод 14
1.1.1.2. Фенольный метод 15
1.1.1.3. Фенольно-детергентный метод 16
1.1.1.4. Сорбционный метод 18
1.1.2. Методы амплификации нуклеиновых кислот 18
1.1.2.1. Полимеразная цепная реакция и ее модификации 18
1.1.2.2. Альтернативные методы амплификации 26
1.1.3. Генотипирование с учетом полиморфизма единичных нуклеотидов (SNP-генотипирование) 32
1.1.4. Проблема контаминации. Методы деконтаминации 38
1.2. Таксономия и номенклатура хламидий 43
1.2.1. Семейство Chlamydiaceae 46
1.2.1.1. Род Chlamydia 47
1.2.1.2. Род Chlamydophila 49
1.2.2. Семейство Parachlamydiaceae 58
1.2.3. Семейство Simkaniaceae 59
1.2.4. Семейство Waddliaceae 60
1.2.5. Семейство Criblamydiaceae 61
1.2.6. Хламидиозы рыб 61
1.2.7. Критический взгляд на классификацию хламидий 62
1.3. Исторический ракурс изучения проблемы хламидиозов животных на постсоветском пространстве 64
1.3.1. Характеристика некоторых штаммов хламидий, выделенных от млекопитающих 65
2. Материалы и методы 74
2.1. Штаммы хламидий. Исследованный материал 74
2.2. Эпизоотологическое обследование . 76
2.3. Выделение и идентификация возбудителя хламидиоза 76
2.4. Серологические реакции 78
2.5. Люминесцентная микроскопия 80
2.6. Очистка и концентрирование хламидий 81
2.7. Экстракция нуклеиновых кислот исследованного материала 82
2.8. ПНР. ПДРФ. Горизонтальный гель электрофорез 89
2.9. Секвенирование. Выравнивание и филогенетический анализ 104
3. Результаты собственных исследований 109
3.1. Совершенствование способов генодиагностики 109
3.1.1. Разработка способа выделения ДНК хламидий 109
3.1.2. Разработка способа проведения НЦР 111
3.1.3. Разработка способа защиты ОТ-ПЦР от контаминации продуктами амплификации на основе разрушающего действия урацил-ДНК-гликозилазы 118
3.2. Результаты исследования плотоядных животных на хламидиоз 122
3.2.1. Оценка эпизоотического состояния зверосовхоза «Вятский»
Кировской области РФ в отношении хламидиоза пушных зверей. 122
3.2.2. Лабораторная диагностика хламидиоза лисиц в зверосовхозе «Вятский» Кировской области РФ 124
3.2.2.1. Вирусологические исследования 124
3.2.2.2. Серологические исследования 125
3.2.2.3. Молекулярно-генетические исследования 126
3.2.3 Совершенствование молекулярно-генетической индикации возбудителей хламидиоза 126
3.2.3.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) со специфичными праймерами для индикации хламидий 127
3.2.3.2. Выявление возбудителя хламидиоза в патологическом материале при помощи ПЦР со специфичными праймерами.130
3.3. Результаты лабораторных исследований рептилий, амфибий и декоративных птиц на хламидиоз 131
3.4. Молекулярно-генетический анализ хламидий 135
3.4.1. Сравнительная характеристика хламидий по отрі-геву 135
3.4.2. Сравнительная характеристика хламидий по отр2-тену 154
3.4.3. Сравнительная характеристика хламидий по 16SpPHK, 2SSpPHK и наличию экстрахромосомной плазмиды (рСр) 159
4. Обсуждение результатов исследования 172
5. Выводы 198
6. Практические предложения 200
Список использованной литературы 203
Приложения 260
- Генотипирование с учетом полиморфизма единичных нуклеотидов (SNP-генотипирование)
- Экстракция нуклеиновых кислот исследованного материала
- Разработка способа защиты ОТ-ПЦР от контаминации продуктами амплификации на основе разрушающего действия урацил-ДНК-гликозилазы
- Результаты лабораторных исследований рептилий, амфибий и декоративных птиц на хламидиоз
Введение к работе
Актуальность темы. Научные достижения последних десятилетий в
области молекулярной биологии, генетики, биохимии, пересекающиеся с
микробиологией, вирусологией, иммунологией и другими смежными
дисциплинами, привели к созданию, развитию и внедрению в практику
диагностических лабораторий молекулярно-генетических методов
исследования геномов эукариот, прокариот и вирусов. Генодиагностические подходы, базовыми направлениями которых являются гибридизационные, амплификационные, сиквенсные и другие технологии ДНК/РНК-анализа, постоянно совершенствующиеся в плане специфичности, чувствительности, экономии и безопасности, позволяют осуществлять широкий спектр задач индикации и идентификации биологических объектов. На сегодняшний день они являются одними из самых эффективных приемов при постановке диагноза на инфекционные болезни (P. Singleton, 2000; N. Woodford et al, 2004; G.J. Viljoen et al, 2005; M. Klint et al, 2007; K. Sachse et al, 2008). В этом плане весьма актуальным представляется решение вопросов номенклатуры и классификации микроорганизмов, что является основой идентификации болезнетворных агентов.
Хламидиозы - группа разнообразных по проявлению контагиозных болезней животных, возбудителями которых являются внутриклеточные микроорганизмы со своеобразным циклом развития (J. Storz, 1988). Геномы хламидии являются перспективным объектом исследования, а генетический критерий идентификации служит одной из конструктивных звеньев построения их классификации (K.D. Everett et al, 1999а, 1999b; J.C. Hartley et al, 2001; M. Van Loock, 2003; N.R. Thomson et al, 2005, 2008; R.S. Stephens et al, 2009).
Особенностью хламидиозов, значительно усложняющей контроль за развитием заболевания, является частое латентное или хроническое течение со стертой клинической картиной. Кроме того, обладая низкой иммуногенностью, не обеспечивающей выработку достаточного количества антител, инфекция часто приобретает персистирующий характер и способствует образованию тлеющего очага.
Лабораторные методы диагностики хламидиоза, основанные на обнаружении возбудителя путем световой и люминесцентной микроскопии, выделении инфекционного агента на куриных эмбрионах, выявлении в сыворотках крови больных и переболевших животных специфических антител, имеют ряд недостатков, связанных с низкой чувствительностью и специфичностью, а также длительностью получения ответа. Это обусловливает необходимость изыскания и внедрения чувствительных средств диагностики, позволяющих выявлять хламидии при любой форме проявления инфекционного процесса (J.C. Hartley et al, 2001; К. Sachse et al, 2009).
Исходя из этого, перспективным направлением является совершенствование лабораторной диагностики хламидиозов на основе молекулярно-генетических методов исследования.
Цель и задачи исследования. Цель исследования - создание научно-практических основ генодиагностики биологических объектов и проведение системного молекулярно-генетического анализа хламидии на предмет их таксономической принадлежности.
В соответствии с целью работы для решения были поставлены следующие задачи:
разработать способ выделения нуклеиновых кислот хламидии для получения препаратов ДНК высокой степени чистоты и нативности;
разработать способ проведения ПЦР, обеспечивающий эффективную наработку специфичных ампликонов с исключением амплификации неспецифичных продуктов реакции;
разработать способ деконтаминации амплификационных реакций на основе урацил-ДНК-гликозилазного метода защиты от контаминации;
провести комплекс исследований по выяснению этиологической роли хламидии в патологии клеточных пушных зверей, птиц, рептилий и амфибий;
подобрать условия проведения индикации и идентификации хламидии в клиническом и патологическом материале методами ПЦР и ПЦР-ПДРФ-анализа;
провести молекулярно-генетические исследования типичных представителей рода Chlamydophila штаммов «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93» на предмет их таксономической принадлежности на основании сравнительного анализа по ompl-, отр2-, 16S рРНК- и 23S рРНК-тенам с соответствующими фрагментами геномов официально зарегистрированных видов хламидии, а также по наличию экстрахромосомной плазмиды.
Научная новизна.
Впервые на основании системного молекулярно-генетического анализа представителей семейства Chlamydiaceae охарактеризован новый, ранее не изученный генотип хламидии, обозначенный нами «генотип G», с предложением соотнесения изолированных от млекопитающих при абортах штаммов «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93» рода Chlamydophila в новый вид хламидии, Chlamydophilaparapsittaci sp.nov.
Разработка фенольно-детергентного способа выделения ДНК хламидии (Патент РФ на изобретение № 2230120 - «Способ выделения ДНК микроорганизмов»).
Разработка методики высокоточной ПЦР (Патент РФ на изобретение № 2299240 - «Способ проведения ПНР»).
Разработка способа защиты ОТ-ПЦР от контаминации продуктами амплификации на основе разрушающего действия урацил-ДНК-гликозилазы (из Е. соїї) (Патент РФ на изобретение № 2307167).
Научная новизна и приоритет разработок диссертации защищены охраноспособными документами, отражены в публикациях ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАК и глобальной
электронной базе данных генбанков NCBI (США), EMBL (Великобритания), DDBJ (Япония).
Научно-практическая значимость.
Результаты молекулярно-генетических исследований типичных представителей рода Chlamydopila штаммов «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93», характеризующие собой новый, ранее не изученный генотип хламидий («генотип G»), с предложением выделения изученных штаммов в новый вид хламидий, Chlamydophila parapsittaci sp.nov., существенно повышают уровень знаний о природе хламидийных инфекций и позволяют эффективно использовать полученную информацию в научно-практической деятельности ветеринарной и гуманитарной медицины.
Разработан способ выделения ДНК хламидий для последующего молекулярно-генетического анализа. Предложенная разновидность фенольно-детергентного метода экстракции нуклеиновых кислот микроорганизмов проста в эксплуатации, экономична во времени и средствах, дает приемлемые результаты в отношении нативности, чистоты и концентрации препаратов ДНК хламидий.
Разработан способ проведения полимеразной цепной реакции, являющийся действенной альтернативой разновидностям «точной» ПЦР, таким как «touch-up PCR» и «touch-down PCR». Предложенная методика высокоточной ПЦР позволяет значительно повысить специфичность амплификации интересуемых участков геномов исследуемых биологических объектов.
Разработан способ ферментативной деконтаминации амплификационных реакций на основе разрушающего действия урацил-ДНК-гликозилазы (из Е. coli). Предложенный подход является действенным инструментом защиты ОТ-ПЦР в варианте «1 пробирка, 2 этапа» от загрязнения продуктами амплификации.
Установлена хламидийная природа различных патологий у клеточных и домашних плотоядных животных, птиц, рептилий и амфибий; выделенные при этом изоляты микроорганизмов идентифицированы как хламидий.
Подобраны условия проведения ПЦР-индикации и идентификации хламидий методом ПЦР-ПДРФ в исследуемом биоматериале, обеспечивающие высокую чувствительность и специфичность тестов.
Подготовленные на основе научно-практической работы методические рекомендации используются в учебном процессе факультетов ветеринарной медицины сельскохозяйственных ВУЗов, для повышения квалификации специалистов ветеринарных лабораторий и при научных исследованиях.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:
ежегодных итоговых заседаниях ученых советов ФГОУ ВПО «Казанская государственная академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана (2002-2008 гг.);
ежегодных итоговых заседаниях ученых советов ГНУ «Татарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства» РАСХН (2004-2006 гг.);
Всероссийской научно-практической конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии (Казань 2002 г.);
научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии и ветеринарной медицины мелких домашних животных» (Киров, 2002 г.);
Х-ХП, XIV и XV Московских международных ветеринарных конгрессах (Москва, 2002-2004, 2006, 2007 гг.);
IV региональной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина. Современные проблемы и перспективы развития» (Саратов, 2004 г.);
научно-практической конференции «Ветеринарная медицина домашних животных» (Казань. 2005 и 2006 гг.);
научно-практической конференции молодых ученых ФГОУ ВПО «Казанская академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана» (Казань, 2006 г.).
Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 55 работ, в том числе 10 публикаций в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК, 4 методические рекомендации, 3 патента РФ на изобретения, 1 монография и 15 депонированных в глобальных базах данных генбанков NCBI, EMBL и DDBJ публикаций нуклеотидных последовательностей локусов ompl-, отр2-, 16S рРНК-, 23S рРНК-тенов и экстрахромосомной плазмиды хламидий штамма «Ростиново-70».
Основные положения, выносимые на защиту.
Штаммы хламидий «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93» рода Chlamydophila по генетическому (анализ ompl-, omp2-, 16S рРНК- и 23S pPHK-TGHOB хламидий и наличия экстрахромосомной плазмиды) и экологическому (изолированы от млекопитающих при абортах) критериям охарактеризованы как ранее не изученный генотип («генотип G») и предложены для выделения в новый вид - Chlamydophila parapsittaci sp. nov.
Фенольно-детергентный способ выделения ДНК хламидий позволяет получать чистые, нативные и концентрированные препараты нуклеиновых кислот возбудителя.
Методика высокоточной ПЦР обеспечивает эффективную наработку специфичных ампликонов с исключением амплификации неспецифичных продуктов реакции.
Способ защиты ОТ-ПЦР от контаминации продуктами амплификации на основе разрушающего действия урацил-ДНК-гликозилазы (из Е. coli) предотвращает возможность реамплификации урацил-содержащих ампликонов при использовании заявленного протокола ОТ-ПЦР в варианте «1 пробирка, 2 этапа».
Различные патологии у клеточных и домашних плотоядных животных, декоративных птиц, рептилий и амфибий имеют хламидийную природу, подтвержденную результатами комплексных исследований.
Подобранные условия индикации и идентификации хламидий в исследуемом биоматериале методами ПЦР и ПЦР-ПДРФ обеспечивают высокую чувствительность и специфичность анализа.
Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 290 страницах компьютерного текста (текстовый редактор «Microsoft Word 2003», стиль «Times New Roman», размер шрифта 14 пт, интервал полуторный) и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследования, выводы, практические предложения, список использованной литературы (всего 470 источников, в том числе 416 иностранных) и приложения. Диссертация иллюстрирована 21 таблицами, 30 рисунками и 8 схемами. Прилагаются документы, подтверждающие научно-практическую значимость работы.
Генотипирование с учетом полиморфизма единичных нуклеотидов (SNP-генотипирование)
Исторически первые широко использовавшиеся методы детекции полиморфных участков ДНК были основаны на применении ферментов рестрикции и ограничивались детекцией изменений в рестрикционных сайтах. Позже были разработаны другие ферментативные подходы. Несмотря на то, что в настоящее время не все они реализованы в высокопроизводительном варианте, многие данные свидетельствуют о возможности их расширения и автоматизации (Т. Бородина, 2005).
Полиморфизм длины рестрикционных фргаментов — ПДРФ (RFLP — Restriction fragment length polymorphism) и полиморфизм длины амплификационных фрагментов — ПДАФ (AFLP- Amplified fragmentlength polymorphism). Определение полиморфного сайта рестрикции методом ПДРФ заключается в ПЦР-амплификации интересующего фрагмента и его последующем расщеплении соответствующей рестриктазой (J.W. Schumm et al., 1988). Благодаря простоте и надежности метод получил широкое распространение и до сих пор популярен, хотя и имеет некоторые ограничения - во-первых, он позволяет детектировать только SNPs, расположенные в сайтах рестрикции, а во-вторых, годится лишь для детекции уже известных SNPs.
Последнее ограничение удалось обойти с помощью ПДАФ подхода, поменяв местами этапы- амплификации и рестрикции. Сначала геномная ДНК обрабатывается набором рестриктаз,, затем к полученным фрагментам лигируются адапторы. Для последующей амплификации используются праймеры, комплементарные адапторной последовательности и заходящие за сайт рестрикции на три произвольно выбранных нуклеотида. Триплеты обеспечивают амплификацию лишь некоторой части рестрикционных фрагментов. Метод позволяет анализировать большое количество SNPs без знания их нуклеотидной последовательности (P. Vos et al., 1995).
ПДРФ и ПДАФ подходы оказались полезным инструментом идентификации хламидий (В. Kaltenboeck et al., 1991; J. Lan et al., 1993; C. Sayada et al., 1995; A. Meijer et al., 1997; B. Kaltenbock et al., 1997; D. Vanrompay et al., 1997; K.D. Everett et al., 1999a, 1999b; Лопухов, Л.В с соавт., 2000; T.Y. Choi et al., 2001; J.C. Hartley et al., 2001; A. Meijer et al., 1999; A. Rekiki et al., 2002; Т. Бородина, 2005; Т. Geens et al., 2005a).
Расщепление ДНК струкпгуро-специфическими эндонуклеазами. Многие подходы основаны на зависимости вторичной структуры одноцепочечной ДНК от ее последовательности и от кинетики ренатурации. Гетеродуплексы, полученные после ренатурации ДНК могут быть расщеплены конформационно-специфическими эндонуклеазами. Это приводит к появлению набора, меченых фрагментов, которые разделяются в гель- или капиллярном электрофорезе (Т. Sander et al., 1999; Т. Бородина, 2005).
Выданных подходах для расщепления и детекции гетеродуплексов могут быть использованы такие ферменты, как Cleavase I, узнающий и расщепляющий несовершенные шпильки (Т. Sander et al., 1999); резольваза (эндонуклеза VII), используемая для энзиматической детекции мисматчей (B.JJr. Del Tito et al., 1998); SI нуклеаза (J.T. Howard et al., 1999) и др.
Использование флуоресцентно-меченых праймеров при амплификации ДНК позволяет проводить анализ продуктов расщепления гетеродуплексов на автоматических секвенаторах. Это существенно повышает производительность метода и позволяет его автоматизировать (B.JJr. Del Tito et al., 1998). Эндонуклеазные методы позволяют детектировать нуклеотидные замены, инсерции и делеции, однако- очень, чувствительно -к качеству очистки ДНК (Т. Бородина, 2005).
Химические методы расщепления. Достоинством химического расщепления (R.G. Cotton, 1999) является практически 100% узнавание всех типов гетеродуплексов. В настоящее время на это не способен ни один ферментный метод. Кроме того, возможно локализация и идентификация мутаций. Недостаток — достаточно сложная процедура и токсичные реактивы. Один из способов химической детекции SNPs, зависящий от структуры дуплекса - гидролиз сильно флуоресцирующего acridinium ester в слабощелочных условиях (происходит эффективнее, если флуорофор находится в непосредственной близости от мисматча) (N.C. Nelson et al., 1996; Т. Бородина, 2005). Детектируется исчезновение флуоресценции после гидролиза.
Химическое расщепление неканонических пар оснований (п.о) и других нарушений комплементарности в контексте перспективности химического метода выявления точечных мутаций неизвестной локализации наглядно изучено группой российских ученых (А.А. Несчастнова с соавт., 2007). В представленной ими работе впервые получена модельная система для демонстрации специфичности этого метода, представляющая собой серию 50-звенных несовершенных дуплексов ДНК, содержащих все варианты неканонических пар и неспаренных внутренних оснований в инвариантном контексте либо в А-Т, либо в G-C окружении.
Также известен способ химического лигирования, способный эффективно различать как 51, так и 3 -концевые мисматчи (Y. Xu et al., 1999). Лигазная детекция (LDR - Ligase detection reaction). Метод основан на высокой чувствительности к субстрату лигаз из термофильных организмов: они не способны сшивать ник, если фланкирующие нуклеотиды некомплементарны матрице. Как правило, З -концевые мисматчи лучше дискриминируются, чем 5-концевые. В LDR используются три олигонуклеотида, два из которых флуоресцентно меченые аллель(генотип)-специфические (различаются только меткой и З -нуклеотидом,. соответствующим позиции SNP), а третий располагается с 5 -стороны от SNP и непосредственно примыкает к аллель(генотип)-специфическому праймеру. Использование термостабильных лигаз позволяет увеличить выход реакции за счет проведения циклов денатурации/лигирования (R. Favis et al., 2000). В других схемах амплификация лигазной реакции достигается за счет: - использования олигонуклеотидов, комплементарных обеим цепям, так что каждый цикл лигирования сопровождается двукратным увеличением количества матрицы (LCR); - сочетания методов LDR и ПЦР (F. Barany et al., 2001); - использования зонда, замыкающегося в кольцо при лигировании (padlock probe) и последующим синтезом ДІЖ на зонде по механизму катящегося колеса (P.M. Lizardi et al., 1998; Т. Бородина, 2005). Множество способов детекции и обнаружения SNP основаны на различных модификациях ПЦР.
Аллель(генотип)-специфичная ПЦР (SNP-специфичная ПЦР, mismatch ПЦР). Принцип подхода основан на том, что 3 -концевой нуклеотид одного из праймеров гибридизуется непосредственно с позицией SNP (S. Kwok et al., 1990; Y.Z. Qiang et al., 2002; J. Rupp et al., 2006). Известной разновидностью AS-PCR (allele specific PCR) является ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System-Polymerase Chain Reaction) для дискриминации SNP (N. Okayama et al., 2004). Принцип тетрапраймерной ARMS-PCR основан на применении 4 олигонуклеотидов, два из которых являются внешними (общие праймеры), инициирующее при совместном фланкировании амплификацию фрагмента ДНК гена любого из аллелей (генотипов) исследуемых биосистем, а остальные два - внутренними (аллель(генотип)-специфичные праймеры), каждый из которых при совместном фланкировании только с одним из внешних праймеров инициирует амплификацию аллель(генотип)-специфичного фрагмента ДНК (G. Rincon et аГ., 2003). Степень дискриминации мисматчей можно повысить, вводя дополнительный (неспаренный) нуклеотид во второй или третьей позиции с 3;-конца этого же праймера (G. Rincon et al., 2003).
Экстракция нуклеиновых кислот исследованного материала
Для быстрой лабораторной диагностики заболевания у рептилий и амфибий, а также у декоративных птиц использовали люминесцентную микроскопию. В качестве диагностического теста при исследовании мазков-отпечатков от рептилий и амфибий использовали «Набор- флуоресцирующих иммуноглобулинов-и, контрольных.сывороток для- диагностики хламидиозов», производства ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань) при исследовании мазков-отпечатков: от декоративных птиц - тест-систему "ХЛАМИ-ОРН" (ВЕНКИ). РИФ выполняли по непрямому методу. Метод позволяет обнаруживать в патматериале цитоплазматические включения хламидий с содержащимися них антигенами. Для достоверности результата все поле мазка просматривали не менее 5 мин.
Диагноз на хламидиоз считали положительным, если в препарате обнаруживали элементарные тельца хламидий округлой или овальной формы с ровными краями, расположенные внеклеточно и представляющие собой ярко-зеленые образования, размером около 300 мкм (приблизительно 1/100 от окружающих эпителиальных клеток). Внутриклеточные включения, представляли собой полиморфные одиночные и множественные образования ярко-зеленого цвета. Диагноз на хламидиоз считали отрицательным, если в препарате отсутствовало специфическое ярко-зеленое свечение при наличии красных эпителиальных клеток.
У рептилий мазки брали со слизистых оболочек глаз, ротовой полости, клоаки. Исследованию было подвергнуто 20 рептилий разных видов из коллекции Казанского зооботсада. У лягушек мазки брали со слизистой оболочки клоаки. Исследованию было подвергнуто 300 свободноживущих прудовых лягушек. Амфибии были отловлены в пруду п. Столбищи Лаишевского района Республики Татарстан, в пруду с. Тат. Саралы Лаишевского района РТ, в озере на территории Раифского монастыря в Зеленодольском районе РТ и в озере недалеко от химкомбината ЗАО "Оргсинтез" в Московском районе г. Казани.
При очистке и концентрировании хламидий использовали схему, включающую: инактивацию возбудителя, разрушение клеточных элементов КЭ для освобождения элементарных телец хламидий, дифференциальное и на градиенте сахарозы центрифугирование суспензии биомассы.
Все операции с исходной и концентрированной биомассами хламидий выполняли в стерильных условиях после инактивации возбудителя. Инактивацию проводили в водяной бане при 60С в течение 60 минут. СХЕМА очистки и концентрирования биомассы хламидий 1. Приготовление 10%-ной суспензии из инфицированных хламидиями ЖОКЭ на 0,2М фосфатном буфере (ФБ). рН 7,2. 2. 3-кратное замораживание и оттаивание суспензии. 3. 3-кратное дифференциальное центрифугирование гомогената при lOOOg в течение 15 минут при 4С и осаждение полученного супернатанта при 15000g в течение 1 часа при 4С. 4. Ресуспензирование полученного осадка в небольшом объеме 0,2М ФБ и «продавливание» через 30%-ный раствор сахарозы, приготовленный на 0,01М ФБ (рН 7,2) при 60000g в течение 1 часа при 4С. 5. Ресуспензирование полученного осадка в небольшом объеме 0,2М ФБ и нанесение материала на линейный градиент сахарозы 30%-60%, приготовленый на 0,01М ФБ с последующим центрифугирование при 60000g в течение 2 часов при 4С. 6. Отбор хламидиосодержащей фракции путем прокола: стенки центифужной пробирки, 10-кратное: разбавление взвеси 0,2М ФБ; и осаждение хламидий при 60000g в течение 1 часа при 4С. 7. Ресуспензирование осадка в небольшом объеме 0,2М ФБ, содержащем 0,01 М MgCb и 10мкг/мл ДНКазы с последующей инкубацией суспензии при 37С в течение 30 минут. 8. Нанесение проинкубированной суспензии на линейный градиент сахарозы 30%-60%, приготовленный на 0,01М ФБ (рН 7,2) с последующим центрифугированием при 60000g в течение 2 часов при 4G. 9. тбор хламидиосодержащей; фракции путем прокола стенки центрифужной пробирки и 10-крактное:разбавление взвеси О МФБ. . Экстракция нуклеиновых кислот исследованного материала Экстракцию ДНК хламидий проводили по предложенному нами фенольно-детергентному способу. Схема выделения ДНК хламидии фенольно-детергентным способом 1. 1 мг очищенной и сконцентрированной культуры хламидии суспендировали в 200 мкл дистиллированной воды. К полученной суспензии бактерий добавляли равный объем лизирующего раствора с ДСН, тщательно пипетировали и выдерживали при температуре 37С в термостате в течение 1 часа, время от времени, перемешивая содержимое пробирки аккуратным покачиванием. [Способ приготовления лизирующего раствора с ДСН: (на 1 мл лизирующего раствора: 800 мг кристаллического фенола насыщают 188 мкл деионизированной воды, затем добавляют 12 мг NaOH). К полученному лизирующему раствору добавляют ДСН до конечной концентрации 1%]. 2. После экспозиции к лизату добавляли 200 мкл хлороформа, перемешивали содержимое пробирки, пока не образовывалась эмульсия. Затем смесь центрифугировали при 7000g в течение 5 мин. Отбирали образовавшуюся водную фазу и повторно проводили экстракцию хлороформом в соотношении 1:1. Вновь проводили центрифугирование экстракта. 3. К извлеченной после последнего центрифугирования водной фазе добавляли 2 объема 96% этанола. Полученную смесь тщательно перемешивали и 1 час экспонировали при -20С. 4. ДНК осаждали путем центрифугирования при 7000g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливали, осадок промывали 70% этанолом и подсушивали при комнатной температуре. 5. Осадок ДНК растворяли в 100 мкл ТЕ-буфера (10 мМ трис-НС1,1 мМ ЭДГА, рН-8,0): Дляшыделения ДНК хламидии также были испытаны следующие способы: - способчцелочного лизиса по.Н. Birnboim etal: (1979):, 1. 1 мг хламидии суспендировали в 100 мкл раствора I (50 мМ глюкоза, 25 мМ трис-НС1, 10 мМ ЭДТА, рН 8,0), содержащего лизоцим в концентрации 5 мг/мл. Инкубировали 5 минут при комнатной температуре. 2. Добавляли 200 мкл свежеприготовленного раствора II (0,2 Н NaOH, 1% ДСН). Перемешивали содержимое пробирки и инкубировали при 4"С в течение 10 минут. 3. Добавляли 150 мкл охлажденного во льду 5 М ацетата калия (рН 4,8). Перемешивали содержимое пробирки и инкубировали при 4С в течение 10 минут. 4. Проводили две экстракции надосадочной жидкости смесью фенол/хлороформ и одну экстракцию хлороформом. После каждой экстракции переносили водную фазу в чистую пробирку. 5. К извлеченной после последнего центрифугирования водной фазе добавляли 2 объема 96% этанола. Полученную смесь тщательно перемешивали и 1 час экспонировали при -20С. 6. ДНК осаждали путем центрифугирования при 7000g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливали, осадок промывали 70% этанолом и подсушивали при комнатной температуре.
Разработка способа защиты ОТ-ПЦР от контаминации продуктами амплификации на основе разрушающего действия урацил-ДНК-гликозилазы
Изучение эпизоотического состояния зверохозяйства проводилось по доступным зооветеринарным документам: журналам учета щенения лисиц и регистрации молодняка, отчетов ветеринарной службы совхоза «Вятский» Кировской области РФ. Анализ проводился за 3 года (1999-2001 гг.).
По данным документов и информации главного ветеринарного врача зверосовхоза известно, что в хозяйстве у лисиц регистрировались: заболевания мочеполовой сферы у самцов и самок; аборты, мертворождения и рождения слабого нежизнеспособного молодняка, а также конъюнктивиты и атипичное течение заболеваний органов дыхания и пищеварения, поражения суставов невыясненной этиологии; высокий процент дорегистрационной и после регистрационной гибели щенков лисиц, что является характерным и для хламидийной инфекции. Областная ветеринарная лаборатория исключает бактериальные и вирусные инфекции (бруцеллез, лептоспироз, листериоз, сальмонеллез, стрептококкоз, вирусный гепатит плотоядных и т.п.). Токсикологические исследования кормов в областной лаборатории дали отрицательные результаты. Условия содержания и кормления лисиц в обследуемом хозяйстве, в основном, близки к зоотехническим нормативам. Следует отметить, что для кормления зверей используются боенские отходы и мясо, поставляемые из регионов, неблагополучных по хламидиозу сельскохозяйственных животных, корма не всегда проходят достаточную- ветеринарно-санитарную экспертизу в отношении возбудителя этой инфекции. Случка самок вольная. Ветеринарный и зоотехнический учет налажен удовлетворительно. В" целях профилактики инфекционных болезней зверей иммунизируют против чумы плотоядных, сальмонеллеза, колибактериоза, микроспории, трихофитии, ботулизма, болезни Ауески, инфекционного гепатита и других инфекционных болезней. Профилактические прививки проводят планово. Планы противоэпизоотических мероприятий составляют ежегодно с учетом складывающейся эпизоотической обстановкой в хозяйстве, районе, области.
Факторами, способствующими распространению заболевания могли быть: нарушение правил содержания и спаривания зверей, завоз нового поголовья, использование для кормления животных мяса и продуктов убоя без термической обработки, отсутствие средств диагностики и профилактики хламидиозов, отсутствие доступной информации о возможности заражения зверей хламидийными инфекциями.
Учитывая то, что основными клиническими проявлениями хламидийных инфекций у животных являются нарушения процессов плодоношения и гибель приплода в первые дни жизни, анализ эпизоотической ситуации проводился по количеству абортировавших и бесплодных самок, мертворожденных и павших до регистрации щенков. Определялась доля этих показателей по отношению к общему числу осемененных самок и родившихся щенков, соответственно.
В 1999 году процент абортировавших и бесплодных лисиц в зверохозяйстве составил соответственно 3 и 6 %. В 2000 г. наблюдался рост в стаде доли абортировавших (до 6%) и бесплодных (до 11%) самок. С этого же года произошло увеличение процента мертворожденных и павших до регистрации щенков до 8 и 15%, соответственно. В 2001 году произошло снижение анализируемых показателей, что, вероятно, связано с тем, что с декабря 2000 года по нашим рекомендациям с целью - профилактики хламидиозов- в, рацион зверям стали добавлять кормовые антибиотики тетрациклинового ряда («Биовит-80» и «Биовит 120»), перед гоном двукратно с интервалом. 1 месяц в дозах согласно инструкциям,по применению указанных препаратов.
В апреле 2000 года из зверосовхоза «Вятский» Кировской области РФ к нам поступил патологический материал: органы абортировавших и «неблагополучно» ощенившихся лисиц, абортированные плоды и щенки, павшие до регистрации, а также сыворотки крови абортировавших лисиц из зверосовхоза «Вятский» Кировской области РФ
Для подтверждения предположений о хламидийной природе вышеописанных патологических явлений у лисиц нами были проведены лабораторные (бактериологические, вирусологические, серологические и молекулярно-генетические) исследования.
Выделение и идентификация возбудителя заболевания - основной этап в доказательстве наличия инфекции. Нами были предприняты попытки выделить инфекционные агенты из патологического материала от лисиц зверосовхоза «Вятский» Кировской области РФ. Для выделения были использованы: матка, печень, легкие от двух абортировавших красных лисиц и двух «неблагополучно» ощенившихся. серебристо-черных лисиц; печень, почки, легкие абортированных плодов красных лисиц и щенков серебристо-черных лисиц, павших в первые дни жизни. Из патологического материала готовили 10% суспензию на 0,2 М фосфатном буфере (рН 7,2) с последующей обработкой стрептомицином (500 мкг/мл) и гентамицином (150 мкг/мл). Контакт с антибиотиками длился 2 часа при комнатной температуре. Инфекционным материалом заражали 6-7-дневные развивающиеся куриные эмбрионы в-желточный мешок. Хламидии были выделены в первом пассаже из тканей легких и матки. Специфическая, гибель в первом пассаже наступала на 8-12 сутки после заражения. При вскрытии павших эмбрионов отмечали множественные точечные кровоизлияния в области головы и конечностей, а также гиперемию и отек желточного мешка и хорионаллантоисной оболочки. В мазках-отпечатках, приготовленных из оболочек желточных мешков погибших куриных эмбрионов, обнаруживали характерные фиолетово-красные элементарные тельца хламидий на зеленовато-синем фоне препарата. Окрашивание проводили по модифицированному методу Стемпа. В дальнейшем нам не удалось адаптировать выделенный штамм к размножению в желточных оболочках куриных эмбрионов и изучить его биологические свойства, т.к. все материалы исследований были потеряны по независящим от нас причинам.
Результаты лабораторных исследований рептилий, амфибий и декоративных птиц на хламидиоз
В результате проведенных исследований методом РИФ специфическое свечение хламидийного антигена обнаружили у 7 (35%) из 20 исследованных рептилий. Хламидии были обнаружены: у среднеземноморской черепахи (самец, 15 лет, клинически здоров); среднеазиатской черепахи (самка, 7 лет, периодическая диарея и конъюнктивит); еще одной среднеазиатской черепахи (самка, 5 лет, диарея и конъюнктивит); европейской болотной черепахи (самец, 10 лет, влажный некроз хвоста); красноухой черепахи (самка, 7 лет, конъюнктивит и влажный некроз пальцев); еще одной красноухой черепахи (самка, 10 лет, клинически здорова); синеязычного сцинка (самец, 4 года, клинически здоров).
При исследовании в РИФ земноводных, обитающих в некоторых естественных водоемах РТ, специфическое свечение хламидийного антигена было обнаружено в клиническом материале, полученном от 54 лягушек, в т.ч. от особей, отловленных в прудах п. Столбищи и с. Тат. Саралы, а также озере на территории Раифского монастыря. У лягушек, отловленных в озере недалеко от химкомбината ЗАО «Оргсинтез», хламидийный антиген не был выявлен.
Световой микроскопией мазков-отпечатков, морфологические структуры хламидии были обнаружены только в 18 случаях; все они были получены от животных, которые входили в число тех 61 рептилий и амфибий, у которых в РИФ был обнаружен антиген хламидии. Полученные данные подтверждают мнение исследователей о низком проценте выявления хламидии при световой микроскопии.
При скрининговых исследованиях сывороток, крови, рептилий, амфибий и декоративных птиц в РСК комплементсвязывающие антитела1 были обнаружены соответственно в 15, 8 и 18% исследованных проб. Ни одна из сывороток крови от рептилий, амфибий и декоративных птиц в ИФА для выявления специфических хламидийных антител в постановке со стандартным конъюгатом не реагировала. Отрицательные результаты этих исследований свидетельствуют о том, что белок А, меченный пероксидазой хрена, который в иммуноферментной тест-системе используется в качестве конъюгата, не образует комплексы с IgG рептилий (черепах), амфибий (лягушек) и декоративных птиц (попугаев, канареек, голубей). В нашем распоряжении не было меченных ферментом пероксидазой антисывороток, полученных к глобулинам этих видов хладнокровных животных и птиц.
Таким образом, нами была установлена невозможность использования белка А, меченного пероксидазой хрена, в ИФА-тестах при исследовании сывороток крови некоторых рептилий, амфибий и декоративных птиц. При исследовании в ПЦР 20 проб клинического материала, полученного от животных позитивных по хламидиозу в РИФ, ДНК хламидий были обнаружены только в 12 случаях. Результатом ПЦР (тест-система «ХЛА-КОМ») клинического материала, полученного от рептилий и амфибий явилась амплификация фрагмента ДНК хламидий длиной 300 пар нуклеотидов (рис. 14). Проведенными исследованиями продемонстрирована возможность ПЦР-индикации возбудителей хламидиоза в клиническом материале, полученном от рептилий и амфибий с использованием тест-системы «ХЛА-КОМ». Отсутствие ДНК хламидий в 8 пробах, которые дали положительный результат при люминесцентной микроскопии, можно объяснить одной или несколькими следующими причинами: возможностью ложноположительных результатов РИФ; субъективностью оценки результатов РИФ; наличием у рептилий хламидий разных видов, которые не дают амплификацию специфичных фрагментов ДНК при использовании указанной выше тест-системы и другие. Лабораторными методами нами были выявлены несколько случаев хламидиоза у декоративных птиц. В первом случае поступил волнистый попугай, у него воспалились глаза, сначала один, затем другой. У попугая были взяты мазок-отпечаток с конъюнктивы глаза и кровь для получения сыворотки. Во втором случае обратился .владелец канарейки. За три месяца до визита к. нам у нее появился конъюнктивит. Характерным было то, что конъюнктивит был односторонний и очень вяло развивался. У канарейки также были взяты мазок-отпечаток с конъюнктивы глаза и кровь для получения сыворотки. Люминесцентным метод ом1 у обеих птиц в клиническом материале было выявлено специфическое свечениехламидийного антигена, в сыворотке крови попугая и канарейки были обнаружены специфические противохламидийные антитела в диагностических титрах. В другом случае, у декоративного голубя регистрировалось-заболевание, которое характеризовалось поражением1 верхних дыхательных, путей и конъюнктивитом: У голубя был взят мазоктотпечаток с конъюнктивы, глаза: Люминесцентным методом в клиническом материале было выявлено специфическое свечение хламидийного антигена. В следующем случае, у домашнего индюка за неделю до поступления появились признаки поражения органов дыхания. При клиническом осмотре было установлено, что индюк сильно истощен, у него регистрировались: односторонние катаральные синусит и ринит, а также односторонний же гнойный конъюнктивит. У индюка был взят мазок-отпечаток с конъюнктивы глаза. Люминесцентным методом в клиническом материале было выявлено специфическое свечение хламидийного антигена. Клинический материал от одного из попугаев был подвергнут молекулярно-генетическим исследованиям. Результатом ПЦР клинического материала со специфичными праймерами CPF и CPR явилась амплификация специфичного фрагмента ДНК хламидий длиной 264 пар нуклеотидов (рис. 15). Таким образом, подтверждена возможность ПЦР-индикации возбудителей хламидиоза в клиническом материале, полученном от декоративной птицы с применением искусственно синтезированных олигонуклеотидных праймеров CPF и CPR.
