Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 9
1.1. Характеристика бактерий вида Y. enterocolitica 9
1.2. Распространение и резервуар кишечного иерсиниоза 18
1.3. Лабораторная идентификация видаТ. enterocolitica 28
1.4. Бактериофаги и их применение в лабораторной практике 35 1.4.1 .Фагоидентификация бактерий и фаготипирование 3 5
1.4.2. Выделение бактериофагов 42
1.4.3. Чувствительность бактерий вида Y. enterocolitica 45
1.4.4. Реакция нарастания титра фага (РНФ)
Собственные исследования 54
2.1. Материалы и методы 54
2.1.1. Материалы 54„
2. 1.2. Методы 57
2.2. Результаты собственных исследований 64
2.2.1. Поиск бактериофагов Y. enterocolitica и селекция клонов фагов 64
2.2.2. Характеристика выделенных фагов бактерий вида Y. enterocolitica 72
2.2.3. Определение температурных параметров
культивирования выделенных бактериофагов 81
2.3. Разработка метода выделения и ускоренной идентификации бактерий вида Y. enterocolitica спользованием фагов 83
2.4. Разработка оптимальных условий постановки РНФ бактерий вида У. enterocolitica с использованием фагов 88
2.4.1. Определение количественного показателя РНФ, имеющего диагностическое значение 8 8
2.4.2. Установление оптимального времени, обеспечивающего наиболее полноценное взаимодействие фага с бактериями 91
2.4.3. Использование РНФ для обнаружения бактерий вида Y. enterocolitica в объектах внешней среды 96
2.4.3.1. Исследование водопроводной воды, контаминированной бактериями вида Y enterocolitica с помощью РНФ 98
2.4.3.2. Исследование комбикорма, контаминированного бактериями вида Y. enterocolitica с помощью РНФ 100
2.4.3.3. Исследование проб фекалий, контаминированных бактериями вида Y. enterocolitica с помощью РНФ 102
2.4.3.4. Исследование мяса, контаминированного бактериями вида Y. enterocolitica с помощью РНФ 104
2.4.3.5. Результаты выделения бактерий вида К enterocolitica из сточных вод хозяйств Самарской области 107
2.5. Обсуждение 118
Выводы 126
Практические предложения 127
Список использованных литературных источников 128
Приложения 157
- Характеристика бактерий вида Y. enterocolitica
- Лабораторная идентификация видаТ. enterocolitica
- Поиск бактериофагов Y. enterocolitica и селекция клонов фагов
- Разработка метода выделения и ускоренной идентификации бактерий вида Y. enterocolitica спользованием фагов
Введение к работе
Актуальность работы. Заболевания, которые в настоящее время называют кишечными иерсиниозами, лет 30 - 40 назад считались редкими и не привлекали к себе внимания специалистов.
Исследователи стали уделять гораздо больше внимания возбудителю Yersinia enterocolitica после сообщений о том, что данный возбудитель стал причиной возникновения заболевания людей и животных США, Бразилии, Канаде, странах Европы, южной Африке, Японии, Иране и других странах (Mollaret, 1995).
В Нидерландах, Бельгии, Германии, Канаде, Австралии иерсиниоз занимает третье место среди пищевых зоонозов, после сальмонеллёза и кампилобактериоза (Bockemuhl, 1995).
По данным Российских исследователей, в нашей стране заболевания вызываемые бактериями вида Y. enterocolitica занимает второе место среди пищевых зоонозов, после сальмонеллёза (Черкасский, Подунова, Акулова, 1995).
Несмотря на большой интерес, проявляемый к данному возбудителю, в России до сих пор не ясна картина заболеваемости, структура и динамика (Смирнов, Ценева, 1992). Отдельные серо- и биовары Y. enterocolitica, являющимися документированными этиологическими агентами, по прежнему находятся в 4-й группе «условно» патогенных бактерий. Это является основной из причин унифицированного подхода к их индикации и идентификации в условиях клиники и эпидемиологической практики (Волкова и др., 2000).
Опасность иерсиниоза усугубляется чрезвычайной распространённостью возбудителя Y. enterocolitica в природе. Бактерии Y. enterocolitica выделены практически от всех видов млекопитающих, птиц, рыб, земноводных, моллюсков и насекомых. Кроме того, Y. enterocolitica обнаружены в воде, почве, сточных водах, продуктах животного происхождения (Ленченко,
Куликовский, Павлова, 1998; Собакин и др., 1998; Ющенко, 1984).
Широкое распространение иерсиниоза, многообразие клиники и трудоёмкость в постановке диагноза сделали актуальной проблему кишечного иерсиниоза в мировом масштабе. Различные методы индикации и идентификации Y. enterocolitica не идеальны и обладают некоторыми особенностями, поэтому разработка новых методов позволит исследователям более эффективно изучать данную проблему. Фагодиагностика, как один из методов индикации и идентификации, позволяет быстро и точно определить принадлежность исследуемой бактерии не только к определённому роду, но и к виду и даже фаговару.
Цель исследования - разработка параметров и технологических приёмов; по индикации и идентификации бактерий вида Y. enterocolitica- с помощью специфических бактериофагов.
Задачи исследования
Выделить и селекционировать бактериофаги, активные в отношении бактерий вида Y. enterocolitica.
Изучить основные биологические свойства (морфология негативных колоний, литическая активность и ее спектр, специфичность, температурная устойчивость, устойчивость к хлороформу) селекционированных изолятов.
Подобрать оптимальный набор выделенных фагов и сконструировать на их основе новый биопрепарат - диагностикум.
Разработать схему ускоренной индикации бактерий вида Y. enterocolitica в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ и использованием созданного биопрепарата.
Разработать схему идентификации Y. enterocolitica с помощью бактериофагов.
6. Разработать технологические параметры изготовления биопрепарата
для фагодиагностики.
7 Научная новизна
Впервые в ветеринарной практике были выделены бактериофаги, активные в отношении штаммов бактерий вида Y enterocolitica, выделенных от сельскохозяйственных животных.
Изучены основные биологические свойства выделенных фагов.
Доказана эффективность использования селекционированных бактериофагов с диагностической целью.
Разработаны технологические параметры по получению диагностического биопрепарата и схемы фагодиагностики.
Практическая значимость. Выделены и селекционированы специфичные бактериофаги, активные в отношении бактерий вида Y. enterocolitica. Выделенный и изученный штамм бактериофага депонирован в лаборатории бактериальных инфекций ВГНКИ, признан перспективным и рекомендован для изготовления диагностических препаратов. Разработана Временная инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии индикаторного бактериофага Г. enterocolitica Y/9 УГСХА.
Для врачей-: бактериологов предложены "Методические рекомендации по ускоренной индикации методом реакции нарастания титра фага (РНФ) бактерий вида Y enterocolitica в патологическом материале, пищевых продуктах, кормах и объектах внешней среды" и "Методические рекомендации по выделению и фагоидентификации бактерий вида Y. enterocolitica из патологического материала, кормов, пищевых продуктов и объектов внешней среды с применением диагностического бактериофага Y/9 УГСХА, которые были одобрены Ученым советом УГСХА и утверждены ректором академии. Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:
1. Схема выделения бактериофагов бактерий вида Y. enterocolitica.
Биологические свойства выделенных фагов бактерий вида Y. enterocolitica.
Конструирование из отобранного фага нового биопрепарата -
диагностикума.
Разработка схемы ускоренной индикации бактерий вида Y. enterocolitica в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ с использованием созданного биопрепарата.
Разработка схемы идентификации Y. enterocolitica с помощью специфического бактериофага.
6. Разработка технологических параметров изготовления биопрепарата
для фагодиагностики бактерий вида 7. enterocolitica.
Апробация работы
Результаты основных исследований подтверждны в ВГНКИ (от 23.04.04г.), УГСХА (от 21.09.04г.); актом производственных испытаний в Сергиевской районной лаборатории Самарской области (от 4.06.05г.). Материалы диссертации доложены и обсужденьь на научно-практических конференциях в городе Ульяновске (2000, 2003, 2004, 2005), Самаре (2005).
Работа выполнена в соответствии с комплексным; планом научной работы кафедры;микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 164 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор1 литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы (292 источника, в том числе 161 отечественных). Работа иллюстрирована 32 таблицами, 10 рисунками, 1 схемой и приложениями.
Характеристика бактерий вида Y. enterocolitica
J.I Scheleifstein, M.B.Coleman, (265) опубликовали работу о 5 штаммах "не идентифицированного" микроба, выделенных от больных людей. Данные микроорганизмы не рассматривались как причина заболевания. В дальнейшем, принимая во внимание картину заболевания, которую вызвала большая часть штаммов этого микроба, J.I. Scheleifstein и М.В. Coleman (264) назвали его Bacterium enterocoliticum.
Чуть позже микробы, тождественные по описанию J.I.Scheleifstein и M.B.Coleman, изолировали от животных и людей в Западной Европе -Франции, Бельгии, Голландии, Германии, Швейцарии .и описывались как: Pasteurella pseudotuberculesis тип В (Dikinson, Mocquot, 1961), микробы X (Mollaret, Chevalier, Deplanche, 1964), Y. enterocolitica (Fredricsen, 1964; Wauters, Mollaret, 1965). .
J.J. Daniels и С. Goudzwaard (190), а затем W. Knapp и E. Thai (230), установили, что штаммы микробов выделенные от людей и животных обладают одинаковыми свойствами и относятся к одному новому виду пастерелл, который пока предложили называть Pasteurella X:
Классификация бактерий - динамичный процесс, связанный с накоплением новой информации и изменением сложившихся воззрений. Так, еще в 1944, J.J. Van Loghem, предложил выделить данные микроорганизмы в самостоятельный род Yersinia, поскольку было установлено, что они отличались о других пастерелл и были похожи по ряду свойств на чумной микроб. Данный род назван в честь известного французского бактериолога А. Иерсена (A. Yersen). В 1954 году Н. Mollaret, Е. Thai предложили включить вид Yersinia в семейство Enterobacteriaceae, данное предложение было поддержено
Sneath & Cowan в 1958 году и Mollaret в 1965 году предлагали объединить в один род бактерии видов:Y enterocolitica, Y. pestis к Y. pseudotuberculesis - так как, судя по реакции на оксидазу и основному составу ДНК, они родственны (Bercowier and Mollaret, 1984). Но, тем не менее, решение о переименовании бактерий вида Pasterella Хв Y. enterocolitica было принято Международным подкомитетом по таксономии в 1967 г. (Ющенко, 1984).
В 1972 году Подкомитет по таксономии пастерелл и сходных с ними микроорганизмов Международного комитета по систематике бактерий, располагая данными о разных свойствах иерсиний, в том числе молекулярногенетических о биологических, принял решение о включении в семейство Enterobacteriacea нового рода - Yersinia, содержащего три вида бактерий: Y. enterocolitica, Y pestis u Y pseudotuberculesis.
При изучении состава жирных кислот иерсиний и других представителей семейства Enterobacteriaceae было установлено, что иерсиний представляют собой достаточно обособленную, но вместе с тем родственную другим энтеробактериям группу (Bercovier et al., 1979).
В 1980 году было выпущено восьмое издание определителя бактерий Bergey s, в котором род Yersinia был представлен тремя видами Ypestis, Y. psevdotuberculosis, Y enterocolitica. Возбудитель Y enterocolitica занимает следующее положение: Часть - 8. Грамотрицательные факультативно -анаеробные палочки. Семейство - 1. Enterobacteriaceae. Триба - 4 Yersinia. Род - 11 Yersinia. Вид - Y. enterocolitica (Хоулт, 1980)..
В девятом издании Определителя бактерий Bergey s (Bercowier and Mollaret, 1984) род Yersinia был представлен Y.pestis, Y. psevdotuberculosis, Y enterocolitica, Y. intermedia, Y frederiksenii, Y kristensenii, Y. ruckeri.
В 1988 году G. Wauters выделил два новых вида Y mollaretii, Y. bercovieri (Wauters, 1988b). В настоящее время по современной класификации (Хоулт и др., 1997) род Yersinia объединяет Y.pestis, Y. psevdotuberculosis, Y. enterocolitica, Y. intermedia, Y. frederiksenia, Y. kristensenia, Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. mollaretii, Y. rohdei, Y. ruckeri.
Роль видов Г. intermedia, Y. frederiksenia, Y. kristensenia, Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. mollaretii, Y. rohdei, Y. ruckeri в возникновении заболеваний окончательно не установлена. Данные представители рода Yersinia выделялись из почвы, из воды, от птиц, из продуктов питания, рыб креветок. При острых кишечных заболеваниях человека данные возбудители были обнаружены в единичных случаях, поэтому этиологическая роль данных видов не установлена и требует дальнейшего изучения. Y.pestis, Y. psevdotuberculosis, Y. enterocolitica вызывают развитие патологических процессов у человека и животных (Ющенко, 1985; Новослова, Каланадзе, Ющенко, 1989).
Лабораторная идентификация видаТ. enterocolitica
В зависимости от целей и задач, стоящих перед исследователями, ими определяются основные методы работы с исследуемым материалом.
Как правило, наибольший процент выделения возбудителя отмечается при работе о материалом, полученным от животного в период обострения симптоматики заболевания, в период бессимптомного носительства. Сложнее выделить возбудителя при исследовании сырья животного происхождения, так как в исследуемых образцах присутствует большое количество сопутствующей микрофлоры, а также выделить возбудителя из объектов внешней среды (Ahvonen, 1972а). В последнее время особое значение приобретает вопрос идентификации и дифференциации Y. enterocolitica, для установления объективной оценки роли данного возбудителя в заболевании человека и животных (Смирнов, Ценева, 1992).
Бактериологические методы
Бактериологическое исследование трудоемко и требует высокой квалификации от специалистов. Так как Y. enterocolitica психофильны, то широко используется холодовое обогащение в фосфатнобуферных растворах (Oosteron, 1979; Kontainen, Sivonenn and Renkonen 1994; Letellier, Messier and Quessy, 1999; Cateau, 1993). Для повышения чуствительности в ФБР добавили сорбитол (1%) и соли желчных кислот (0,15%) (Mehlman, Auliso and Sanders, 1978; Schiemann, 1980; Harmon, Yu, and Swaminathan, 1983; Logueetal., 1996), водный раствор генцианвиолета (1%) (Померанцев, Васильев, Золотухин, 2000).
Главный недостаток метода холодового обогащения, он требует длительных временных затрат (21 день), что недопустимо при исследовании пищевых продуктов.
М.Р. Doyl and М.В. Hugdahl (192) сообщают, что инкубация ФБР (фосфатно-буферный раствор) при 25С в течении 1-3 дней более эффективна, чем при 4С в течении нескольких недель.
Кроме того, для подавления роста других хладолюбивых культур в среду обогащения добавляют КОН, так как Y. enterocolitica устойчивы к действию щелочей, по сравнению с другими грамотрицательными бактериями (Aulisio, Mehlman and Sanders, 1980).
В.П. Беспалов и др. (15) предлагают часть первичного материала обрабатывать сразу низкой теипературой. Пробирки с исследуемым материалом помещают в холодильник при температуре минус 20 - 30С на 0,5 -1 час или в морозильную камеру бытового холодильника (температура имнус 10 - 15 С) на 18-24 часа. После этого пробирки переносят в холодильник при температуре плюс 6 — 12С на 4 часа, а затем в термостат при температуре 22 -24С на 18 - 24 часа. Также предлагается материал подращенный в холодильнике в течении 2-3 дней подвергнуть щелочной обработке. В полистероловые лунки вносят 0,5% раствор КОН по 0,2 мл, затем в лунки вносят 3 капли материала, аккуратно взятого пастеровской пипеткой из верхней трети. Содержимое лунок перемешивают и через 30 минут, весь материал переносят в пробирку с питательным бульоном и помещают в термостат при температуре 22 - 24С на 18 - 24 часов.
F.B. Ющенко (155) рекомендует использовать для выделения и идентификации чистой культуры Y. enterocolitica экспресс методы: «холдовой удар», «тепловой удар», «щелочная обработка».
Л.Ф. Зыкин, А.А. Щербаков, З.Ю. Хапцев (56) предлагают использовать следующие среды накопления: фосфатно-буферный раствор (ФБР), буферно-казеиново-дрожжевая среда (БКД), 1% забуференая пептонная вода (ЗПВ), таурохолат-сорбитол-фосфатная (ТСФС). В течении периода обогащения при температуре 4 - 8С, периодически делаются высевы на плотные селективные среды - на 3, 7, 12, и 15 сутки.
В иностранной литературе есть сведения о применении таких селективных сред как: модифицированный агар Раппапорта (Wauters, 1973),
Мак Конке и SS агар (Nilehn, 1969), модификация SS агара (Wauters, et al., 1988a), CIN агар (Chiemann, 1987), BABY 4 агар (Bercovier and Mollaret, 1984), VYE агар (Fukushima, 1987)- но в нашей стране эти среды широкого применения не нашли.
В нашей стране применяются следующие дифференциально-диагностические среды: Эндо, Серова, среда с бромтимоловым синим.. Селективные среды после высева материала темостатируют при 26-28С в течении 24 -48 часов. (Ющенко,, 1984; Дулатова, 1989; Ценева др., 1988; Смирнов, 1989; Зыкин, Щербаков, Хапцев, 2002).
Данный метод, малоэффективен при: поздних сроках исследования, на фоне антимикробной терапии, при внутриклеточной локализации возбудителя, при отрицательном влиянии конкурирующей микрофлоры, отсутствие сред накоплениями выделения чистых культур обеспечивающих максимальный эффект выделения. (Инструкция по организации и проведению противоэпидемических мероприятий и лабораторной диагностики псевботуберкулеза и иерсиниоза. МЗ СССЗ, № 15-6/42.)
Поиск бактериофагов Y. enterocolitica и селекция клонов фагов
Для выполнения цели диссертационных исследований необходимо было первоначально выделить и изучить искомый бактериофаг, поэтому первым этапом нашей работы была попытка выделить бактериофаги бактерий вида Y enterocolitica из имеющихся у нас штаммов бактерий вида Y. enterocolitica. Мы надеялись обнаружить лизогенные культуры, так как бактериофаги, выделенные из таких культур, обладают более выраженной специфичностью (Жугова, 1985).
Из имеющихся у нас культур Y enterocolitica мы пробовали выделить бактериофаги различными методами. Все штаммы, изученные нами, исследовались как индикаторные и как "лизогенные".
В первой серии опытов использовали методику, предложенную С. Лурия, Д. Дарнелл (95), для выделения бактериофагов энтеробактерий из бактерий вида Y. enterocolitica без воздействия на них индуцирующего фактора. Результаты, представленные в таблице 5.
Эти данные свидетельствуют, что из культур бактерий вида Y. enterocolitica в опытах по выделению бактериофагов без воздействия на них индуцирующего фактора не приводило к появлению свободного фага.
Во второй серии опытов на культуры, исследуемые как "лизогенные", воздействовали индуцирующим фактором, затем фильтровали через бактериальные свечи Шамберлана L-3 (Ревенко, 1978). Полученный фильтрат исследовали на наличие фага на имеющихся культурах Y. enterocolitica методом агаровых слоев предложенного А. Грациа (Гольдфарб, 1961). Результаты опыта представлены в таблице 6.
Дальнейшие исследования были посвящены выделению бактериофагов Y. enterocolitica из объектов внешней среды (Андельсон, 1958; Ганюшкин, 1988).
Для проведения: исследований, брали сточные воды из общественных туалетов, свиноводческих хозяйств и молочно-товарных ферм в различных хозяйствах Ульяновской и Самарской областей, а также на Ульяновском мясокомбинате. Наличие негативных колоний или зон лизиса на газоне роста индикаторной культуры свидетельствовало бы о присутствии в исследуемом материале бактериофага. В результате исследований проб сточных вод по указанной схеме удалось выявить 9 изолятов фагов.
Селекцию бактериофагов и повышение их литической активности проводили с помощью пассирования фага на индикаторной культуре с периодической отвивкой типичных негативных колоний по методике, описанной и использованной И.М. Габриловичем (22), С.Н. Золотухиным (48). В результате проведённых исследований из внешней среды выделено 9 изолятов бактериофагов, которые отличались между собой по морфологии негативных колоний. Результаты опыта представлены на рисунках 1-3 и в таблицах 7, 8.
В результате проведённых опытов, нами были выделены и изолированы 9 штаммов фагов бактерий вида Y. enterocolitica. Из выделенных фагов, мы отобрали 3 штамма фагов, обладавших стабильными биологическими. / Анализируя свойства данных бактерифагов, мы отобрали бактериофаг Y/9 УГСХА, который лизировал 78,6% бактерий вида Y. enterocolitica и был специфичен только в отношении данного вида бактерий.
Изучение биологических свойств фагов проводили по методам, предложенным М. Адаме (3), А.С. Тихоненко (136), Т.Г. Чинашвили (148), И.М. Габрилович (22).
Дальнейшей целью наших исследований было изучение следующих свойств фагов Y. enterocolitica: а) морфология негативных колоний; б) литическая активность; в) спектр литической активности; г) специфичность действия; д) температурная устойчивость; е) устойчивость к хлороформу; ж) морфология фаговых корпускул. а) Морфология негативных колоний
Морфологию негативных колоний фагов изучали, при посевах фагов методом агаровых слоев. В пробирку с расплавленным и остуженным до 46-48С 0,7% МПА вносили 1мл фага в разведении 10 9 (для получения изолированных негативных колоний) и 0,2 мл индикаторной суточной бульонной культуры. Содержимое пробирки тщательно перемешивали и выливали на поверхность 1,5% МПА. После застывания агара чашки помещали в термостат. Учет производился через 18-20 часов инкубации при температуре 37С. Негативные колонии, образуемые изучаемыми бактериофагами, разделены нами на два типа. К первому типу относятся фаги: Y/9 УГСХА, который образует округлые колонии с ровными краями, в диаметре 2-3 мм, прозрачные, без вторичного роста, и фаг Y/4 УГСХА, который образует колонии с ровными краями, прозрачные, без вторичного роста и без зоны неполного лизиса, в диаметре от 1 до 2 мм. Ко второму типу относится фаг Y/3 УГСХА, который образует колонии округлые, с ровными краями, в диаметре 20-30 мм, с зоной неполного лизиса, ширина зоны 0,5-1мм. Даные представлены в таблице 9.
Разработка метода выделения и ускоренной идентификации бактерий вида Y. enterocolitica спользованием фагов
Согласно данных бактериофаги вида Y. enterocolitica культивируются в температурном диапазоне от 25 С до 37С (Nicolle et al.,1967; Nilehn и Ericson, 1969; Nilehn,1973; Tsubocura et-al., 1982; Кысовски и соавт. 1983). Определение температурных условий культивирования фагов бактерий вида Y. enterocolitica: Y/3 УГСХА, Y/4 УГСХА, Y/9 УГСХА проводили по методикам, предложенным Д.М. Гольдфарбом (29); М. Адамсом (3); И.М. Габриловичем (22).
В опытные пробирки, содержащие стерильный 1,5% МПБ в объеме 4,5 мл (рН 7,4-7,6), вносили 0,2 мл культуры бактерий вида Y. enterocolitica штамм 08 147-035 (Y/3 УГСХА), штамм 09 168-035 и 0,2 мл фагов бактерий Y/3 УГСХА, Y/4 УГСХА, Y/9 УГСХА в отдельные соответствующие пробирки. Паралельно ставился контроль. Для чего, в пробирки, содержащие стерильный 1,5% МПБ в объеме 4,5 мл (рН 7,4-7,6), вносили 18 часовые культуры бактерий вида Y. enterocolitica штамм 08 147-035, штамм 09 168-035 в количестве 0,2 мл. Пробирки помещали в термостат и культвировали при температуре: 22 С, 25С, 28С, 31С, 34С, 37С. Результаты представлены в таблице 16.
Результаты исследований свидетельствуют о том, оптимальная температура культивирования фагов бактерий вида Y. enterocolitica: Y/3 УГСХА, Y/4 УГСХА, Y/9 УГСХА - 37С.
б) количественное соотношение фага и культуры при культивировании фагов бактерий вида Y. enterocolitica При исследовании условий культивирования выделенных фагов бактерий вида Y. enterocolitica: Y/3 УГСХА, Y/4 УГСХА, Y/9 УГСХА необходимо было выяснить оптимальное количественноесоотношение фага и индикаторных бактерий вида Y. enterocolitica, для производства диагностического препарата.
В опытные пробирки, содержащие стерильный 1,5% МПБ в объеме 4,5 мл (рН 7,4-7,6), вносили 0,2 мл фагов бактерий Y/3 УГСХА, Y/4 УГСХА, Y/9 УГСХА в отдельные, затем в даные пробирки вносили 18 часовые культуры бактерий вида Y. enterocolitica штамм 08 147-035 для фага Y/3 УГСХА, штамм 09 168 035 для фагов Y/4 УГСХА, Y/9 УГСХА в количествен сначало 0,2 мл, затем 0,4 мл и т.д. постепенно доводя объем культуры до 2,5 мл Паралельно ставился контроль, в пробирки, содержащие стерильный 1,5% МПБ в объеме 4,5 мл (рН 7,4-7,6), вносили культуры бактерий вида Y. enterocolitica штамм 08 147-035 (Y/3 УГСХА), штамм 09 168-035 (Y/4 УГСХА, Y/9 УГСХА) по 0,2 мл. Пробирки помещали в термостат и культвировали при температуре 37С.
В результате проведенных исследований было установлено, что для фагов Y. enterocolitica Y79 УГСХА (титр 1х1010 фаговых корпускул в 1 мл), Y/3 УГСХА (титр 2x109 фаговых корпускул в 1 мл) оптимальным соотношением бактериофага 0,2 мл фага х 1,0 мл (800000 м.кл./мл) индикаторной культуры, а для фага Z enterocolitica Y/4 УГСХА (титр 4 109 фаговых корпускул в 1 мл) 0,2 мл фага х 5,0 мл (800000 м.кл./мл) индикаторной культуры.
Используя строгую родовую специфичность селекционированного бактериофага, нами была разработана схема выделения и ускоренной идентификации вышеуказанных микроорганизмов. При выделении бактерий вида Y. enterocolitica из сточных вод первичные посевы и выделение чистых культур микроорганизмов проводили в соответствии с правилами, указанными в "Методических указаниях по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями", утверждёнными Департаментом ветеринарии МСХ и П И октября 1999 года.
Подготовку и посев проб кормов и пищевых продуктов, подлежащих исследованию, проводили в соответствии с ГОСТами "Методы бактериологического анализа" на каждый вид сырья и продукции животного и растительного происхождения (п.2.3;).
В исследованиях использовали воду, комбикорм, мясо и фекалии контаминированные бактериями вида Y. enterocolitica в концентрации 105, 104, 103, 102, іо м.к.вімл.
Посев материала производили на среды Эндо, Серова и иерсиниозно-псевдотуберкулезная среда с бром тимоловым синим, инкубировали при температуре Зб-37С 18-20 часов.
На агаре Эндо вырастают мелкие, круглые, росинчатые бесцветные колонии. На вторые сутки колонии увеличиваются в диаметре, и приобретают розовый оттенок иногда в центре колонии - розовая точка. На среде Серова вырастают колонии округлой формы с неровными краями, с чуть, сосцевидно-выпуклым центром, темно-красного цвета. Колонии матовые, суховатые, при снятии петлей легко сдвигаются по агару. На иерсиниозно-псевдотуберкулезная среда с бром тимоловым синим, вырастают круглые, гладкие колонии голубого цвета, в диаметре до 2 мм. Через 48 часов роста голубовато-зеленые колонии с фестончатым краем. В случае роста указанных колоний в посевах с нескольких образцов, их пересев делали не менее чем из двух образцов. Культуры микроорганизмов инкубировали при 37С 6-18 часов (до появления выраженного помутнения среды). Результаты исследований представлены в таблице 16.
