Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Характеристика бактерий рода Klebsiella 10
1.2. Патогенность 17
1.3. Резервуар и распространение инфекции 21
1.4. Устойчивость к физико-химическим факторам 24
1.5. Лабораторная идентификация клебсиелл 26
1.6. Бактериофаги и их применение в лабораторной практике 29
1.6.1. Взаимодействие бактериофагов с клеткой-хозяином 29
1.6.2. Фагоидентификация бактерий и фаготипирование 32
1.6.3. Реакция нарастания титра фага (РНФ) 40
2. Собственные исследования 46
2.1. Материалы и методы исследований 46
2.1.1. Материалы 46
2.1.2. Методы 55
2.2. Результаты исследований 56
2.2.1. Выделение бактерий рода Klebsiella из объектов ветеринарного надзора и патологического материала 56
2.2.2. Поиск бактериофагов клебсиелл и селекция клонов фагов 59
2.2.3. Характеристика фагов бактерий рода Klebsiella 65
2.3. Разработка технологических параметров изготовления и контроля индикаторных фагов клебсиелл 89
2.4. Разработка схемы ускоренной идентификации бактерий уош Klebsiella 98
2.5. Разработка оптимальных условий постановки реакции нарастания титра фага 103
2.5.1. Определение количественного показателя РНФ, имеющего диагностическое значение 103
2.5.2. Установление оптимального времени, обеспечивающего наиболее полноценное взаимодействие фага с бактериями 106
2.5.3. Разработка схемы постановки РНФ для индикации бактерий
рода Klebsiella в объектах ветеринарного надзора 109
2.5.3.1. Исследование водопроводной воды, контаминированной бактериями рода Klebsiella с помощью РНФ ПО
2.5.3.2. Исследование комбикорма, контаминированного бактериями рода Klebsiella с помощью РНФ 111
2.5.3.3. Исследование проб фекалий, контаминированных бактериями рода Klebsiella с помощью РНФ 113
2.5.3.4. Исследование мяса, контаминированного бактериями рода Klebsiella с помощью РНФ 114
2.5.3.5. Исследование фекалий больных диареей телят на присутствие бактерий Klebsiella spp. с использованием РНФ 116
2.6. Изучение эффективности сконструированного фагового биопрепарата 118
Заключение 120
Выводы 127
Практические предложения 129
Список использованных литературных источников 130
Приложения 150
- Характеристика бактерий рода Klebsiella
- Резервуар и распространение инфекции
- Выделение бактерий рода Klebsiella из объектов ветеринарного надзора и патологического материала
- Установление оптимального времени, обеспечивающего наиболее полноценное взаимодействие фага с бактериями
Введение к работе
Актуальность работы. В настоящее время особое внимание уделяют диагностике мало изученных инфекционных заболеваний, характеризующихся тяжелым течением, а нередко и летальным исходом. К их числу относятся клебсиеллезные инфекции. Представители рода Klebsiella широко распространены в природе, а подвид pneumoniae является нормальной микрофлорой респираторного тракта животных и человека. Однако среди этих микроорганизмов имеются патогенные варианты, способные вызывать у животных и людей самостоятельные заболевания. Клебсиеллы известны как возбудители пневмонии, заболеваний мочеполовой системы, острых кишечных инфекции, различных гнойно-септических осложнений, а также внутрибольничных инфекций, менингитов. Заболевания, вызываемые клебсиеллами, протекающие по типу острого сепсиса, предложено рассматривать как самостоятельную нозологическую единицу - клебсиеллез (Ковалева, Рейзис, 1993; Киселева, Красноголовец, 1996; Покровский, 1985; 1999). Известно так же, что К. pneumoniae играет этиологическую роль при маститах, пневмониях, сеп-тицемиях коров, свиней, лошадей, обезьян, инфекционной диареи молодняка животных (Воронин, Дервишов, Ставцева, 1989; Каврук, 1994; Кукава с соавт., 1998; Шахов, 2003; Золотухин, 2004; 2005).
Выделение и идентификация клебсиелл в основном проводится бактериологическим методом. Трудоемкость и длительность изучения биологических свойств бактерий не позволяет быстро идентифицировать бактерии рода Klebsiella. Существующие современные высокоспецифичные методы лабораторной диагностики (ИФА, РИА, ПЦР) из-за сложности методик, высокой стоимости оборудования и реактивов пока недоступны для большинства лабораторий. В связи с вышеизложенным возникает необходимость изыскания эффективных и доступных для ветеринарных лабораторий методов индикации и идентификации бактерий рода Klebsiella.
Ряд исследователей (Гольдфарб, 1961; Ганюшкин, 1988; Габрилович, 1981; 1983; Русалеев, 1990; Кольпикова, Бакулов, Котляров, 1990; 1992; Золотухин, 2005; Натидзе с соавт., 2005) приводят убедительные данные о положительных результатах индикации и идентификации возбудителей некоторых заболеваний с помощью бактериофагов. Метод фагодиагностики является специфичным, не требующий больших затрат времени, материалов и доступен лабораториям всех уровней.
Выделением и изучением бактериофагов рода Klebsiella занимались исследователи разных научных школ (Przondo-Hessek, 1966; Slopek et. al, 1967; 1978; Габрилович с соавт., 1970; 1973; 1981; 1983; Gaston et. al, 1987; Pieroni et. al., 1994; Джапаридзе с соавт., 2005). Однако в арсенале ветеринарных лабораторий отсутствуют клебсиеллезные бактериофаги. Поэтому получение специфических бактериофагов, активных в отношении бактерий рода Klebsiella, выделенных из объектов ветеринарного надзора, с целью диагностики, является актуальным.
Цель исследования. Разработка технологических параметров по индикации и идентификации бактерий рода Klebsiella с помощью специфических бактериофагов.
Задачи исследования:
Изучить распространение бактерий рода Klebsiella в хозяйствах неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям молодняка животных.
Выделить и селекционировать бактериофаги, активные в отношении штаммов бактерий Klebsiella.
Изучить основные биологические свойства (морфологию негативных колоний, литическую активность и ее спектр, специфичность, температурную устойчивость, устойчивость к хлороформу, морфологию фаговых корпускул) выделенных бактериофагов.
Сконструировать на основе индикаторных бактериофагов новый биопрепарат - диагностикум.
Разработать технологические параметры изготовления биопрепарата для фагоидентификации и фагоиндикации бактерий рода Klebsiella.
Разработать схему идентификации бактерий рода Klebsiella с помощью бактериофагов.
Разработать схему ускоренной индикации бактерий рода Klebsiella в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ.
Научная новизна:
Выделены новые штаммы бактериофагов, активные в отношении бактерий рода Klebsiella, изолированных из объектов ветеринарного надзора и патологического материала. Изучены основные биологические свойства выделенных бактериофагов.
Доказана эффективность использования селекционированных бактериофагов с диагностической целью. Впервые разработаны биотехнологические параметры для фагоидентификации и фагоиндикации клебсиелл в объектах ветеринарного надзора и патологическом материале.
Практическая значимость. Выделены и селекционированы специфичные бактериофаги, используемые для приготовления диагностического биопрепарата.
Два штамма бактериофагов депонированы во Всероссийском государственном центре качества и стандартизации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) и признаны перспективными для приготовления диагностического препарата.
Разработана «Временная инструкция по изготовлению и контролю индикаторных бактериофагов Klebsiella К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА», одобренная Ученым советом Ульяновской ГСХА и утвержденная ректором академии 17.01.2006 года.
По материалам диссертационных исследований разработаны «Методические рекомендации по ускоренной индикации и идентификации энтеробак-терий рода Klebsiella в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов», утвержденные Отделением ветеринарной медицины РАСХН 26.06.2006 года.
8 Основные положения, выносимые на защиту:
Технологические параметры выделения бактериофагов бактерий рода Klebsiella.
Выделенные фаги имели высокую литическую активность, два бактериофага К -10 УГСХА и К - 81 УГСХА обладали широким диапазоном литической активности, специфичностью к бактериям рода Klebsiella.
Доказана эффективность сконструированного фагового биопрепарата.
Разработаны биотехнологические параметры изготовления диагностического фагового препарата.
Схема идентификации бактерий рода Klebsiella с помощью специфических бактериофагов.
Схема ускоренной индикации бактерий рода Klebsiella в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на следующих конференциях: Всероссийской научно-практической конференции «Региональные проблемы народного хозяйства» (8-9 апреля 2004 года, Ульяновская ГСХА, Ульяновск); Межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых Приволжского федерального округа «Молодые ученые в решении региональных проблем АПК» (22 - 23 сентября 2004 года Самарская ГСХА, Самара); Всероссийской научно-практической конференции «Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы» (26 - 28 апреля 2005 года, Ульяновская ГСХА, Ульяновск); Международной научно-практической конференции «Молодежь и наука XXI века» (21-23 марта 2006 года, Ульяновская ГСХА, Ульяновск); Международной научной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (21 - 23 июня 2006 года, Ульяновск).
Основные материалы диссертации заслушаны и одобрены на заседании Отделения ветеринарной медицины РАСХН (26.06.2006 г.), на межкафед-
9 ральном совещании сотрудников кафедр факультета фетеринарной медицины (15.03.2006 г.).
Результаты изучения биологических свойств бактериофагов К - 10 УГС-ХА, К - 81 УГСХА и индикации бактерий рода Klebsiella в объектах ветеринарного надзора методом РНФ подтверждены актами комиссионных испытаний:
в Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии (от 30.01.2006 г.);
во Всероссийском государственном центре качества и стандартизации лекарственных препаратов для животных и кормов (от 21.02.2006 г.);
в условиях производства, проведенных на базе Чердаклинской районной лаборатории (10.12.2005 г.).
Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии в соответствии с комплексным планом научной работы «Разработка и усовершенствование методов диагностики, лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний молодняка животных» при творческом сотрудничестве с ВНИИВСГЭ.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований, заключения, выводов, практических предложений, списка использованных литературных источников (193 источника, в том числе 50 зарубежных авторов) и приложения. Работа изложена на 162 страницах, иллюстрирована 18 рисунками, 29 таблицами.
Характеристика бактерий рода Klebsiella
Род Klebsiella относится к числу старейших в семействе Enterobacteri-асеае. Клебсиеллы были обнаружены более чем 100 лет назад немецким исследователем Е. Клебсом в тканях, погибших от пневмонии людей. Патоген-ность бактерий для лабораторных животных доказал Фридлендер, ему удалось выделить чистую культуру бактерий (позднее их систематизировали как К. pneumoniae) и описать ее свойства. Поэтому до сих пор в литературе встречаются два названия этих бактерий клебсиеллы или палочки Фридлен-дера (Сидоров, Скородумов, 1995; Красноголовец, Киселева, 1996).
Клебсиеллы были объединены в род Klebsiella, относящиеся к трибе Klebsielleae по всем существующим классификациям энтеробактерий. Согласно классификации Берджи 1994 года, род Klebsiella представлен четырьмя видами: К oxytoca, К. terrigena, К. planticola, К. pneumoniae. Вид К. pneumoniae подразделяется на 3 подвида: pneumoniae, rhinoscleromatis, ozaenae. По данным последней классификации 2004 года, вид К. terrigena был переведен в род Raoultella вид Raoultella terrigena.
Морфология
Клебсиеллы - это прямые неподвижные, не образующие спор грамотри-цательные палочки с закругленными концами, длинной 0,6 - 6,0 мкм и диаметром 0,3 -1,5 мкм. В мазках располагаются единично, парами или короткими цепочками. Особенностью клебсиелл является способность образовывать капсулу. Клебсиеллы были первыми капсульными микроорганизмами, описанными среди энтеробактерий. Наличие капсулы наблюдается у штаммов, выделенных от людей и животных. Однако после культивирования на питательных средах некоторые штаммы теряют способность к капсулообра-зованию, другие, наоборот, сохраняют ее годами. Бескапсульные варианты могут восстанавливать капсулу после пассирования через организм животных (Weiss, 1981) или через углеводсодержащие среды. Б.С. Киселева (1982) рекомендует применять методику селекции капсулы с пассированием через углеродсодержащие среды (глюкоза, сахароза) при контроле за чистотой популяции и степенью диссоциации в косо проходящем свете. Ширина капсулы может достигать от 0,3 до 1,27 мкм, длина от 0,6 до 6 мкм. При размножении клебсиелл капсула не делится, поэтому несколько клеток могут иметь общую капсулу.
Для определения капсулы существует много методов. Лучшим негативным методом обнаружения капсул является простой способ окрашивания препаратов тушью (Duguid, 1980).
Кулыпуральные свойства
Клебсиеллы - факультативные анаэробы. Все виды клебсиелл хорошо растут на простых мясных средах в широком диапазоне температур (от 4 до 43 С), оптимальная температура 35 - 37 С при рН - 7,2. Непременной особенностью клебсиелл считают пышный рост и образование на плотных питательных средах больших, выпуклых, частично сливающихся колоний слизистой консистенции. На агаре Эндо образуют часто красные и розовые колонии с металлическим блеском или без него, на агаре Плоскирева, в зависимости от степени ферментации лактозы, образуют красные, розовые или бесцветные колонии, на среде Левина - темно-синие с металлическим блеском колонии. Кроме слизистых колоний, некоторые авторы отмечают наличие у клебсиелл гладких колоний, состоящих из бескапсульных бактерий, рассматривая их как S-формы, и указывают на существования R-форм с маленькими конусообразными колониями и неравномерно складчатой поверхностью (Weiss, 1981). F. Kauffman (1949) описал следующие формы клебсиелл:
-гладкие формы (МКО - мукоидные, капсульные с О-антигеном; КО -немукоидные, капсульные с О-антигеном; МО - мукоидные бескапсульные с О-антигеном; О-немукоидные, бескапсульные с О-антигеном);
-шероховатые формы (MKR - мукоидныя, капсульныя, без О-антигена; KR - немукоидные, капсульная, без О-антигена; MR - мукоидная, бескап-сульная, без О-антигена; R - немукоидная, бескапсульная, без О-антигена).
Известны случаи образования L-форм клебсиелл под воздействием неблагоприятных факторов внешней среды, например, некоторых антибиотиков, блокирующих синтез клеточной стенки бактерий (Ullmann, 1986).
В жидких средах рост капсульных вариантов сопровождается равномерным помутнением, слизистым осадком и пленкой на поверхности бульона. Бескапсульные R-формы бактерий образуют гранулированный осадок с чистой и незамутненной надосадочнои жидкостью. Культивирование бактерий на МПБ приводит к образованию пристеночного кольца. У фимбриеобра-зующих штаммов в течение нескольких дней на поверхности МПБ образуется поверхностная пленка.
В опытах с культурами клебсиелл были испытаны синтетические питательные среды для культивирования и идентификации энтеробактерий. Отмечаются их преимущества перед традиционными средами, которые имеют простой химический состав, стабильны при длительном хранении, а также не требуется проводить пересева на другие среды для идентификации выделенных культур бактерий (Фафонова, 1992).
Резервуар и распространение инфекции
Многими исследователями отмечено повсеместное распространение клебсиелл. Их обнаруживают в организме животных и людей, а также во внешней среде: в пресной и морской воде, сточных водах, почве, на растениях в промышленных стоках, древесине (Brown, Seidler, 1973; Matsen, Spindler, Blosser, 1974; Seidler, Knittel, Brown, 1975; Bagley et. al, 1978; Edberg, Piscitelli, Carter, 1986; Трухина, 1985; Мамонтова, Савилов, Рахманин, 2005).
Клебсиеллы выделяют при разных патологических процессах: желудочно-кишечных заболеваниях, заболеваниях дыхательного тракта, заболеваниях ЦНС, мочеполовой системы, сепсисе; при различных нагноительных процессах; маститах, метроэндометритах. А также у 5 % практически здоровых людей К. pneumoniae выделяли из ротоглотки и ЖКТ (Покровский, Поздеев, 1999).
При обследовании больных и медперсонала крупного стационара больницы И.М. Габрилович с соавт. (1986) выделили 28 штаммов клебсиелл.
Аналогичные исследования проводили Л. Чанишвили с соавт. (2005) от больных клинических стационаров, а также из объектов внешней среды в период с 1982 - 2005 гг. ими было выделено доминирующее количество штаммов бактерий Klebsiella над стафилококками и кишечной палочкой.
М. Мшвилдадзе с соавт. (2005) изучая микрофлору из отделений для новорожденных высокого риска, обнаружили 60 штаммов (К. pneumoniae, Е. coli, P. aeruginosa и т.д.). Преимущество грамотрицательной флоры наблюдалось у беременных матерей и новорожденных в течение первых 24 часов.
И.Б. Куваевой и К.С. Ладодо (1991) было отмечено выделение клебсиелл с патогенными свойствами у людей со сниженной резистентностью, что приводило к развитию диарейного и других синдромов.
Исследователи S.D. Donaldson, О. Azizi, R. Nogare Anthony (1991) выделяли у тяжело больных, подключенных к аппарату искусственной вентиля 22 ции легких, грамотрицательные бактерии, среди которых Klebsiella занимала второе место.
При пилонефрите у детей отмечается возрастающая этиологическая роль энтеробактерий (93,1 %), среди них Klebsiella spp. составили 8,1+1,5 % (Зыкова, 1998).
Проводившиеся исследования у пациентов с печеночным абсцессом исследователями установлено, что причиной способствующей возникновению заболевания была К pneumoniae (Lee et al., 2005).
З.П. Заркура, Н.М. Мечурчлишвили, И.М. Гадуа (2005) при изучении особенности микрофлоры у больных раком желудка с гнойно-восполительными осложнениями, показало разную обсемененность брюшной полости на определенных этапах оперативного вмешательства. К моменту ушивания полости обсемененность представителями семейства Enterobacte-riaceae оказалась доминирующей (Е. coli, Proteus, Serratia, Klebsiella, Citrobacter).
При исследовании внутрибольничных инфекций Московского родильного дома Н.С. Прямухина, О.Т. Морозова (1996) выделили у новорожденных 208 штаммов микроорганизмов: Enterobacter cloacae (35 %), Klebsiella pneumoniae (30,7 %), Staphylococcus epidermidis (20 %), Staphylococcus haemolyticus (14 %).
Как было отмечено в институте хирургии им. Вишневского РАМН в 15,7% случаев инфекционных осложнений приходилось на бактерии родов Enterobacter, Klebsiella, Serratia (Покровский, 1996).
Кроме того, клебсиеллы описаны как возбудители заболеваний и у животных. О выделении патогенных бактерий вида К. pneumoniae в отдельных хозяйствах при желудочно-кишечных заболеваниях телят и поросят сообщают Е.С. Воронин с соавт., (1989); Л.С. Каврук (1994); А.Г. Шахов (2003); С.Н. Золотухин с соавт. (2004; 2005).
По данным Г.Г Кукава с соавт. (1998) у здоровых и больных острыми кишечными заболеваниями обезьян, содержавшихся в питомниках, были вы 23 делены патогенные штаммы которые по морфологическим и ферментативным признакам относились к бактериям рода Klebsiella (виды pneumoniae, oxytoca, ozaenae).
А.Г. Шипицин, Н.Ю. Басова (2003) сообщают о выделении из патологического материала павших и вынужденно убитых телят с клинической бронхопневмонией в большей степени энтеробактерий, среди которых Klebsiella занимала 53 %.
Исследователи Ю.Е. Козловский с соавт. (2002) сообщают о выделении клебсиелл в 23 зверохозяйствах Европейской части России из кормов, патологического материала и объектов окружающей среды.
R. Seidler et al. (1975) делятся сведениями о выделение патогенных штаммов К. pneumoniae из почвы и растений.
Определяя колиформные бактерии в питьевой воде Южной Баварии, исследователи P.R.G. Schindler, Н. Metz (1990), выделяли из водопроводной воды штаммы, которые были идентифицированы как К. pneumoniae (17,4 %), из источников децентрализованного водоснабжения также выделяли штаммы К. pneumoniae (14,5 %) и К. oxytoca (6,5 %).
Л.М. Мамонтова, Е.Д. Савилов, Ю.А. Рахманин (2005) изучая структуру микробных сообществ в крупнейших водостоках Сибири (р. Селенга) обнаружили ведущую роль в видовом спектре микроорганизмов бактерий рода Klebsiella, Pseudomonas и Е. coli.
Г.М. Трухина (1985) сообщает о наличие клебсиелл на всех исследуемых пробах сточных жидкостей и речной воды, а также пробы воздуха и смывы с объектов окружающей среды в лечебных учреждениях, в том числе и в хирургических отделениях.
Выделение бактерий рода Klebsiella из объектов ветеринарного надзора и патологического материала
Первоочередной задачей наших исследований стало выделение бактерий рода Klebsiella из объектов ветеринарного надзора и патологического материала.
Посевы исследуемого материала и выделение чистых культур микроорганизмов проводили в соответствии с правилами, представленные в «Методических указаниях по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями», также использовали схему В.И. Покровского, O.K. Поздеева (1999).
Исследуемый материал высевали на дифференциально-диагностические среды (ДДС): Эндо, Плоскирева, Левина и инкубировали при температуре 37 С в течение 18-24 часов. На среде Эндо отбирали пышные лактозоположитель-ные, частично сливающиеся слизистые колонии малинового цвета с металлическим блеском, в диаметре 2-4 мм, или бледно-розовые, мелкие 1-1,5 мм в диаметре, на агаре Плоскирева розовые или бледно-желтые, бежевые колонии, на среде Левина- сине-фиолетовые колонии. Для дальнейшей идентификации пересевали с чашек в МПБ, МПА по 4 - 6 колоний. Культуры микроорганизмов инкубировали при 37 С 6 - 18 часов, до появления выраженного помутнения среды.
Бульонные культуры, полученные после пересева колоний с ДДС, микро-скопировали (окраска по Граму). В случаи обнаружения в мазках однородных, мелких, грамотрицательных палочек с закругленными концами, располагающихся единично, парами или короткими цепочками, идентифицировали культуру по ферментативным свойствам.
Видовую принадлежность культур устанавливали на основе определения культурально-морфологических и биохимических свойств.
Используя выше перечисленные схемы бактериологического выделения представителей бактерий рода Klebsiella отмечали некоторые недостатки. Схема В.И. Покровского, O.K. Поздеева (1999) из-за трудоемкости и необходимости использования большого набора тестов, усложняла идентификацию. Недостаток использования методических рекомендаций по диагностике смешанной кишечной инфекции для выделения бактерий рода Klebsiella заключался в представленном наборе тестов, который не позволяет дифференцировать выделенные культуры до вида.
Для снижения трудоемкости бактериологического метода идентификацию бактерий проводили по следующим тестам: образование сероводорода (-), расщепление мочевины (+/-), определение подвижности (-), усвоение цитрата Симонса (+), реакция с метиленовым красным (-/+), Фогеса-Проскауэра (+/-). Указанные тесты позволяли нам дифференцировать клеб-сиеллы от других родов семейства Enterobacteriaceae. При получении соответствующих результатов продолжали изучение ферментативных свойств на средах с углеводами: глюкозой (+), лактозой (+), мальтозой (-), малонатом (+/-), ставили тесты на образование индола (-/+), утилизации ацетата (+/-) и ферментации сорбита (+). Результаты изучения биохимических свойств выделенных штаммов клебсиелл представлены в таблице 4.
Патогенные свойства у выделенных штаммов бактерий рода Klebsiella определяли в биопробе на белых мышах методом внутрибрюшинного введения 0,5 млрд. микробных клеток. Для этого использовали агаровые культуры бактерий, полученные из двух органов и тканей погибших или фекалий больных животных. Взвесями каждого вида бактерий заражали по три белых мыши. Культуру считали патогенной в случае гибели двух или более мышей в течение трех суток после заражения и относили ее к возбудителям болезни.
Бактерий рода Klebsiella были обнаружены в 8 из 18 хозяйств, неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям молодняка животных Ульяновской, Самарской областей и республики Татарстан.
В результате проведенных исследований, из объектов ветеринарного надзора и патологического материала, были выделены и идентифицированы 12 штаммов клебсиелл, из них 10 штаммов К. pneumoniae и 2 штамма К. охуoca (табл. 5).
Установление оптимального времени, обеспечивающего наиболее полноценное взаимодействие фага с бактериями
Для решения поставленной задачи необходимо было провести эксперименты на тест-объекте по выявлению наиболее эффективного временного показателя взаимодействия фага и индикаторной культуры при сохранении остальных параметров (температурный режим, концентрация бактериальной культуры и фаговых корпускул в 1 мл) постановки РНФ. В качестве тест-объекта использовали МПБ, контаминированный бактериями рода Klebsiella, оптимальное время экспозиции выбирали из следующих параметров: - в предварительном подращивание исследуемого материала в течение 5, 16, 24 часов при температуре 37 С, после добавления фагов смесь выдерживали в течение 5 часов при температуре 37 С; - в увеличении времени контакта исследуемого материала с фагом до 6,10,16 и 24 часов при температуре 37 С.
Для этого МПБ в объеме 5 мл контаминировали бактериями рода Klebsiella в концентрации от 101 до 1 х 105 м.к./мл и заливали МПБ в соотношении 1:10, смесь в течение 10 минут встряхивали и ставили в термостат при температуре 37 С на 5,16,24 часа, а затем разливали по пробиркам. На каждую исследуемую пробу брали 3 пробирки: № 1 предназначена для опытной пробы; № 2 для контроля на свободный фаг; № 3 для контроля титра индикаторного фага (контроль титра индикаторного фага ставили один на группу анализов, проводимых одновременно). Исследуемый материал разливали по 9 мл в пробирки № 1 и № 2. Пробирка № 3 содержала 9 мл МПБ. В пробирки № 1 и № 3 добавляли по 1 мл индикаторного фага К - 10 УГСХА, К - 81 УГСХА в рабочем разведении, содержащем 105 фаговых частиц в 1 мл. В пробирку № 2 вносили 1 мл МПБ. Все эти пробирки снова ставили в термостат при температуре 37 С на 5 часов. По оконча нии инкубации из каждой пробирки брали по 0,25 мл материала и вносили в пробирки с 4,5 мл МПБ (для получения в контроле на индикаторный фаг сосчитываемое количество негативных колоний). Все пробирки прогревали при 58 -60 С в течение 30 минут и подвергали дальнейшему исследованию методом агаровых слоев. Учет результатов проводили через 12-16 часов инкубирования в термостате при 37 С. Результаты исследований приведены в таблице 21.
Установлено, что с помощью исследуемых бактериофагов в РНФ при подращивании материала в течение 5 часов позволяет обнаружить клебсиеллы в концен-трации 10 м.кУмл. С увеличение времени подращивания материала до 16 часов чувствительность реакции повышается и позволяет обнаружить бактерии в коли-честве 10 м.к./мл. На проведение исследования затрачивается 33 часа. При под-ращивании материала в течение 24 часов обнаруживается 10 м.кУмл. На проведение этого варианта реакции необходимо 41 час.
Бактериологическим методом обнаруживались бактерии рода Klebsiella в концентрации 10 м.к./мл, при этом на исследование затрачивалось 96 часов: выделение возбудителя (48 часов), изучение биохимических свойств (48 часов).
Во втором варианте опыта МПБ, контаминированный бактериями рода Klebsiella от 10і до 1 х 105 м.кУмл не подращивали, а сразу же вносили в пробирки. Для каждого опыта использовали 3 пробирки. В пробирки № 1 и № 2 вносили 9 мл исследуемого материала из колб. Затем в пробирки № 1 и № 3 - по 1 мл индикаторного фага К -10 УГСХА, К-81 УГСХА в концентрации 105 фаго вых корпускул в миллилитре, в пробирку № 2 вносили 1 мл стерильного МПБ и помещали в термостат при 37 С увеличивая время экспозиции с 5 ч до 6,10, 16 и 24 часа. По окончанию инкубации из каждой пробирки брали по 0,25 мл материала и вносили в пробирку с 4,5 мл МПБ (для получения в контроле на индикаторный фаг сосчитываемое количество негативных колоний). Все пробирки прогревали при 58 - 60 С в течение 30 минут и подвергали дальнейшему исследованию методом агаровых слоев. Результаты учитывали через 12-16 часов инкубирования (табл. 22).
В результате 5 часовой экспозиции материала с фагом К - 81 УГСХА были обнаружены бактерии К. pneumoniae № 8172 в концентрации 104 м.к./мл, при увеличение времени культивирования до 6 часов повышает чувствительность ре-акции с указанным фагом до 10 м.кУмл, а 10 часовая инкубация - до 10 м.к./мл, Бактерии К. pneumoniae № 1017 в концентрации 10 м.к./мл обнаруживаются с помощью фага К - 10 УГСХА, при инкубировании смеси в течение 5 часов, увеличение времени до 10 часов повышает чувствительность реакции нарас-тания титра фага до 10 м.к./мл.
