Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 10
1.1. Характеристика бактерий рода Proteus 10
1.2. Резервуар и распространение инфекции 15
1.3. Патогенность протеев 21
1.4. Идентификация бактерий рода Proteus 27
1.5. Устойчивость 30
1.6. Бактериофаги и их применение в лабораторной практике 31
1.6.1 .Фагоидентификация бактерий и фаготипирование 31
1.6.2. Развитие фаговых корпускул в клетке хозяина 37
1.6.3. Реакция нарастания титра фага (РНФ) 40
II. Собственные исследования 47
2.1. Материалы и методы 47
2.2. Результаты собственных исследований 55
2.2.1. Выделение бактерий рощ Proteus из патологического материала и объектов окружающей среды 55
2.2.2. Изучение спектра литического действия коммерческого коли-протейного бактериофага 59
2.2.3. Поиск бактериофагов Proteus и селекция клонов фагов 63
2.2.4. Изучение биологических свойств фагов бактерий рода Proteus 69
2.2.5. Характеристика выделенных фагов бактерий ром Proteus, выбранных для конструирования диагностического препарата 78
2.3. Разработка технологических параметров изготовления биопрепарата для фагодиагностики бактерий рода Proteus 88
2.4. Разработка метода выделения и ускоренной идентификации бактерий рода Proteus с использованием фагов 96
2.5. Разработка оптимальных условий постановки РНФ 100
2.5.1.Определение количественного показателя РНФ, имеющего диагностическое значение 103
2.5.2. Установление оптимального времени, обеспечивающего наиболее полноценное взаимодействие фага с бактериями 106
2.5.3. Использование РНФ для обнаружения бактерий рода Proteus в объектах ветеринарного надзора 111
2.5.3.1. Исследование водопроводной воды, контаминированной бактериями рода Proteus, с помощью РНФ 112
2.5.3.2. Исследование комбикорма, контаминированного бактериями рода Proteus, с помощью РНФ 114
2.5.3.3. Исследование проб фекалий, контаминированных бактериями рода Proteus, с помощью РНФ 116
2.5.3.4. Исследование мяса, контаминированного бактериями рода Proteus, с помощью РНФ 117
2.5.3.5. Результаты исследований фекалий от больных диареей поросят с помощью РНФ 120
2.6. Изучение эффективности поливалентного фагового биопрепарат 123
Заключение 124
Выводы 131
Практические предложения 133
Список использованных литературных источников 134
Приложения 154
- Резервуар и распространение инфекции
- Выделение бактерий рощ Proteus из патологического материала и объектов окружающей среды
- Разработка технологических параметров изготовления биопрепарата для фагодиагностики бактерий рода Proteus
- Установление оптимального времени, обеспечивающего наиболее полноценное взаимодействие фага с бактериями
Введение к работе
Актуальность работы
В последние годы, благодаря работам отечественных и зарубежных исследователей, расширилось представление о роли энтеробактерий рода Proteus в патологии животных и человека (Papapetropoulou, Pagonopoulou, Kouskouni, 1997; Золотухин, 2004; 2005).
Представители данного рода широко распространены в природе, их выделяют из воды, почвы, фекалий животных и человека. Некоторые штаммы входят в состав нормальной микрофлоры кишечника (Lamikanra, Fayinka, Olusanya, 1989; Золотухин, 2002). В то же время представители этого рода являются возбудителями внутрибольничных инфекций, энтеритов у детей и взрослых людей, способны вызывать воспалительные процессы мочевыводящих путей, быть причиной послеоперационных и ожоговых осложнений, сепсиса, дисбактериоза, токсикоинфекций и др. (Бутакова, Илинская, Юрова, 1991; Зыкин, 2003; Заркуа, Мечурчлишвили, Гадуа, 2005; Чанишвили с соавт., 2005; Золотухин, Каврук, Васильев, 2005).
Также имеется множество экспериментальных данных о патогенности названных микроорганизмов для животных. Протеи выделяются при маститах, эндометритах, раневых инфекциях и других воспалительных процессах у различных видов животных. Особое внимание заслуживают работы по изучению этиологической роли протея в возникновении желудочно-кишечных заболеваний новорожденных животных (Каврук, Бритова, Гиряева, 1983; Каврук, 1986; 1994; Парайко, Парайко, 1990; Мищенко с соавт., 1999; Золотухин, 2004, Золотухин, Каврук, Васильев, 2005).
В настоящее время лабораторная диагностика заболеваний, вызываемых протеем, основана на выделении чистой культуры микроорганизмов и их идентификации по общепринятым тестам. Этот метод трудоемок и требует затрат времени, питательных сред и реактивов. Поэтому перед исследователями стоит задача изыскания более простого и доступного для лабораторий любого уровня метода индикации и идентификации названных микроорганизмов.
В ветеринарной практике для ускоренного обнаружения некоторых родов микроорганизмов в патологическом материале и объектах внешней среды предложены индикаторные бактериофаги с использованием реакции нарастания титра фага РНФ (Гольдфарб, 1961; Капырина, Бакулов, 1972; Ганюшкин, 1988; Русалеев, 1990; Кольпикова, Бакулов, Котляров, 1990; 1992; Натидзе с соавт., 2005). Методы индикации и идентификации микроорганизмов с помощью бактериофагов специфичны, не требуют больших затрат времени, материалов и общедоступны.
Цель исследования. Разработка технологических параметров по индикации и идентификации бактерий рода Proteus с помощью специфических бактериофагов.
Задачи исследования:
-
Изучить распространение бактерий рода Proteus в хозяйствах неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям молодняка сельскохозяйственых животных.
-
Выделить и селекционировать бактериофаги, активные в отношении бактерий рода Proteus.
-
Изучить основные биологические свойства (морфологию негативных колоний, литическую активность и ее спектр, специфичность, температурную устойчивость, устойчивость к хлороформу, морфологию фаговых корпускул, изменение литической активности при хранении) выделенных бактериофагов.
-
Подобрать оптимальный набор выделенных фагов и сконструировать на их основе новый биопрепарат-диагностикум.
-
Разработать технологические параметры изготовления биопрепарата для фагодиагностики бактерий рода Proteus.
-
Разработать схему ускоренной индикации бактерий рода Proteus в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ и использованием созданного биопрепарата.
-
Разработать схему идентификации протеев с помощью бактериофагов.
Научная новизна
Получены новые штаммы бактериофагов, активные в отношении штаммов бактерий рода Proteus, выделенных из объектов ветеринарного надзора. Изучены основные биологические свойства выделенных фагов.
Впервые разработаны биотехнологические параметры фагоиндикации и фагоидентификации бактерий рода Proteus в объектах ветеринарного надзора. Доказана эффективность использования селекционированных бактериофагов с диагностической целью.
Практическая значимость
Выделены и селекционированы специфичные бактериофаги, которые используются для изготовления диагностических препаратов. Разработаны технологические параметры по получению диагностического биопрепарата из выделенных фагов и схемы фагодиагностики.
Для конструирования биопрепарата были отобраны два фага, которые депонированы в государственной коллекции Всероссийского государственного центра качества и стандартизации лекарственных препаратов для животных и кормов ФГУ «ВГНКИ» (Справка о депонировании штамма бактериофага П-16 УГСХА от 21.02.2006 №263-3/19; Справка о депонировании штамма бактериофага П-261 УГСХА от 21.02.2006 №263-4/19) для получения патентов.
Разработана «Временная инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии индикаторных протейных бактериофагов П-16 УГСХА, П-261 УГСХА», одобренная Ученым Советом Ульяновской ГСХА и утвержденная ректором академии 17.01.2006.
Для врачей-бактериологов предложены «Методические рекомендации по ускоренной индикации и идентификации энтеробактерий рода Proteus в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов», утвержденные Отделением ветеринарной медицины Российской академии сельскохозяйственных наук (РАСХН) (26.06.2006).
Результаты изучения биологических свойств бактериофагов П-16 УГСХА и П-261 УГСХА и индикации бактерий рода Proteus в объектах ветеринарного надзора методом РНФ подтверждена актом производственных испытаний (от 10.01.2006), актами комиссионных испытаний в Ульяновской Государственной сельскохозяйственной академии (от 30.01.2006), актами комиссионных испытаний в Всероссийском государственном центре качества и стандартизации лекарственных препаратов для животных и кормов (ВГНКИ) (от 17.02.2006).
Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:
-
Усовершенствована схема выделения бактериофагов применительно к протеям, изучены биологические свойства выделенных и селекционированных фагов.
-
Сконструирован биопрепарат-диагностикум из селекционированных фагов и разработаны технологические параметры его изготовления для фагодиагностики бактерий рода Proteus.
-
Разработаны схемы ускоренной индикации бактерий Proteus в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ и идентификации протеев с использованием созданного биопрепарата.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях: на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Региональные проблемы народного хозяйства» (Ульяновск, 2004), на Научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов «Аграрная наука - развитию агропромышленного комплекса» (Ульяновск, 2004), на Всероссийской научно-практической конференции «Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы» (Ульяновск, 2005), на Международной научно-практической конференции «Молодежь и наука XXI» (Ульяновск, 2006), на Международной научной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Ульяновск, 2006).
Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия» в рамках научно - исследовательской темы кафедры «Разработка и усовершенствование методов диагностики, лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных» при творческом сотрудничестве с сотрудниками Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и эпидемиологии (ВНИИВСГиЭ).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, заключение, выводы, практические предложения, список литературных источников, 197 источников, в том числе 150 отечественных, и приложения. Работа изложена на 166 страницах и иллюстрирована 36 таблицами.
Резервуар и распространение инфекции
Протеи выделяют из воды, почвы, фекалий животных и человека. Некоторые виды, вероятно, входят в состав нормальной микрофлоры кишечника. Но штаммы патогенных серогрупп способны вызывать вспышки гастроэнтеритов у и токсикоинфекций у детей и взрослых людей.
А.В. Алешукина, Л.Д. Мартыненко, Р.Г. Ловердо (1991) обследовали 380 детей в возрасте от 20 дней до 5 лет (310 - больные острыми кишечными инфекциями (ОКИ), находящихся на стационарном лечении, 70 - здоровые дети) и установили, что 23 % случаев заболеваний ОКИ обусловлены бактериямт рода Proteus. Проводя расшифровку этиологии заболевания у 2870 лиц с острыми кишечными инфекциями М.Ш. Садыкова, М.Я. Якубова, А.Х. Рахимова (1991) установили, что в 22,7 % случаев ОКИ были обусловлены бактериями семейства энтеробактерий. Чаще всего высевались бактерии рода Proteus, что составило 35% случаев. Высеваемость бактерий в течение года была равномерной с некоторым увеличением в мае-июне.
Г.П. Давиденко, Н.Р. Назарметова, Н.Ш. Хусаинова (1991) исследовали гнойное отделяемое с поверхности ожоговых ран второй и третьей степеней тяжести. В 31 % случаев золотистый стафиллококк выделялся в ассоциации с гра-мотрицательными бактериями (клебсиеллами и протеем).
Ю.Б. Белоусов, В.П. Комарова, О.В. Ефременкова (1998) сообщают, что при амбулаторном обследовании 60 пожилых больных с инфекцией нижних дыхательных путей в 10 % случаев выделяли Citrobacter, Acinetobacter, Enterobacter, Proteus и P. aeruginosa.
J. Martinez-Beltran., E. Loza, M.J. Bautista et al. (1991) в период 1988-1990 гг. наблюдали 1012 эпизодов бактериемии, вызванных грам отрицательными микроорганизмами, среди которых 5 % приходилось на P. mirabilis.
При исследовании мочи больных хроническим пиелонефритом было доказано наличие бактериоурий. В 24,2 % случаев выделялись протеи (Мерджа-нов, Велев, Петков, 1991).
Э.В. Жукова, А.А. Ризаева, Л.К. Чарыева (1992) изучали частоту и этиологическую структуру ВБКИ на примере 177 детей до 3 лет поступивших в стационар с диагнозом гастроэнтерит и установили, что частота ВБКИ составляет 11,85 %, причиной в 1,1 % случаев был P. mirabilis.
Л.А. Литяева, Е.С. Закопаева (1992) провели клинико-микробиологический мониторинг за новорожденными детьми группы риска по кишечным инфекциям. Наблюдали 200 новорожденных, родившихся у матерей с урогенитальной патологией или недостаточно обследованных. Установлено, что у 89 % детей наблюдался дисбактериоз (уменьшение уровня бифидобакте-рий и увеличение концентраций условно-патогенных бактерий). Протеи преобладали у 35 детей. Н. Игути (1991) изучал спектр микроорганизмов в моче и мокроте у людей пожилого возраста. Средний возраст мужчин сотавлял 77,9 лет, женщин -74,4 года. При исследованиях мочи бактерии рода Proteus выделяли в 27,9 %, при исследованиях мокроты бактерии рода Proteus выделяли в 27,9 %. Результаты исследований, полученные Н. Игути (1991), подтверждаются данными испанских ученых J. Marti Masias, M.D. Conesa, M. Cervantes (1992), которые изучали инфекции мочевых путей у людей в преклонном возрасте. Протеи высевались в 23,6 % случаев.
Достаточно часто бактерии рода Proteus выделяются из образцов мочи при урологических, гинекологических и гериатрических заболеваниях (Avril et al., 1993; Kosmidou et al., 1993; Ishii et al., 1996; Papapetropoulou, Pagonopoulou, Kouskouni, 1997).
Guibert Jacqueline (1991) проводил исследования больных, пользующихся постоянными зондами, при повышении у них температуры без видимых причин и при возникновении эпидидимита или орхиэпидимита. Было установлено, что бактерии родов Staphylococcus, Pseudomonas и Proteus могут быть контамини-рующими агентами, но бактерии рода Proteus могут быть и возбудителем, способствующим образованию в течение нескольких недель камней в почках.
R. Quentin et al. (1990) выделил P. mirabilis из аспиратов при абсцессах и кистах бартолиниевых желез.
Занимаясь исследованием эпидемиологии госпитальной инфекции в травматологическом стационаре Л.Ю Бутакова, Б.В. Илинская, В.А Юрова (1991) обследовали 167 больных гнойно-септической инфекцией, а также объекты внешней среды (147 исследований) и персонал (133 исследования). Определяли принадлежность выделенных микроорганизмов к госпитальным штаммам. Дальнейшее колицинотипирование, пиоцинотипирование и фаготипирование определило выявление 11 колицинотипов Е. coli и 9 - Proteus. Обнаружены одинаковые колицинотипы у персонала и больных. Аналогичные данные отмечены и среди штаммов Proteus . Бактерии вида P. penneri были выделены из подкожного абсцесса у больного острым лимфоцитарным лейкозом с выраженной нейтропенией (Engler, Troy, Bottone,l 990).
З.П. Заркуа, Н.М. Мечурчлишвили, И.М. Гадуа (2005) изучали интра-операционную микрофлору у 48 радикально оперированных больных раком желудка на различных этапах хирургического вмешательства. Бактериологические исследования мазков, взятых из брюшной полости в момент вскрытия, показали наличие Proteus в 7,1 %. Количественное соотношение протеев, высеянных из брюшной полости перед ее ушиванием и из пунктатов брюшной полости, при развившихся в ней послеоперационных гнойно-воспалительных осложнениях, составило 1:3.
Л.С.Кавруком (1994) при изучении видового состава условно-патогенной микрофлоры помещений свинарников - маточников в период массовых желудочно-кишечных заболеваний новорожденных животных было установлено, что из 32 обследованных свиноводческих хозяйств во всех циркулировали бактерии рода Proteus (виды P. vulgaris и P. mirabilis), на некоторых еще и Р. тухо-faciens; при бактериологическом исследовании трупов 22 поросят - сосунов, погибших от диареи на фермах 11 хозяйств, автором были выделены бактерии рода Proteus (виды P. vulgaris и P. mirabilis) в 14 случаях. При исследовании со-скобов с полов профилакториев, родильных отделений и фекальных масс больных диареей телят протей обнаруживали также во всех хозяйствах. Частота выделения вышеуказанных бактерий была в 42-100 % случаев. При исследовании патологического материала от 28 трупов телят, павших в первые дни жизни, Р. vulgaris и P. mirabilis были обнаружены автором в 16 случаях. Из числа изученных культур вышеназванных видов протей составил 80 %, выделеных от больных и павших поросят и 7 % - от телят, были патогенными для белых мышей.
При проведении исследований микрофлоры матки, шейки и влагалища сук на всех стадиях репродуктивного цикла было установлено, что бактерии стабильно выявлялись на стадиях эструса и проэструса и очень редко - на других стадиях. Наиболее часто выделяли Escherichia coli, Haemophilus, Corynebacterium, S. canes, Alcaligenes faecalis, Bacteroides, Pasteurella, Proteus mirabilis (Watts, Wright, Whithear, 1996).
Л. Чанишвили с соавт. (2005) проводил исследования патогенов мастита крупного рогатого скота и установили, что основными патогенами являются бактерии S. agalacticae, S. aureus, S. disgalactiae, S. fecalis, E. coli, P. aeruginosa, P. vulgaris.
Из печени пресноводных рыб Labeo rohita были выделены 100 штаммов грамотрицательных бактерий 16 родов, среди которых 10 % составляли бактерии рощ Proteus (Hussain, Ansari, Khatoon, 1990).
W. Wawrzyniak, E. Grawis (1991) проводили диагностику этиологии и патогенеза язвенных и некротических поражений некоторых рыб (трески, камбалы, лосося, кумжи и форели) Балтийского моря. При микробиологическом исследовании обнаружили большое количество бактерий spp. Vibrio, Aeromonas, Rseudomanas, Proteus, Moraxella, E. coli.
I. Mazyrova, P. Vinter (1991) при изучении обсемененности и видового состава контаминантов в разведенной сперме боровов, хранящейся при 18 С, выделяли наиболее часто бактерии рода Proteus (63 % образцов). Также бактерии рода Proteus были выделены из свежей спермы кроликов трех пород (Mercier, Rideaud, 1990).
При проведении бактериологического анализа носовых выделений карликовых коз Западной Африки, пораженнных вирусом Kata, с клиническими симптомами заболевания Peste des petits ruminauts, E. I. Ugochukw, С. O. Agwu (1991) в 4,00 % случаев выделяли бактерии, принадлежащие к роду Proteus, из них 2,67 % идентифицировались как P. mirabilis, а 1,33 % - как P. vulgaris.
Т.И. Кебу с соавт. (1998), изучая видовой состав энтеробактерий у клинически здоровых и больных острыми кишечными инфекциями (ОКИ) неясной этиологии обезьян рода Масаса, установили значительное возрастание (в 2-7 раз) частоты обнаружения энтеробактерий, что указывает на развитие дисбиотических процессов. Патологический процесс чаще всего был ассоциирован с представителями гнилостной микрофлоры (P. vulgaris, P. mirabilis, К. pneumoniae, С. freundii), что может свидетельствовать об их этиологической связи с острыми кишечными заболеваниями обезьян.
Выделение бактерий рощ Proteus из патологического материала и объектов окружающей среды
Первоочередной задачей наших исследований стало выделение бактерий рода Proteus из объектов ветеринарного надзора. В период с 2003 по 2006 год было исследовано на наличие бактерий рода Proteus 64 пробы: фекалий, сточных вод, патологического материала от больных и павших животных, взятые в 10 хозяйствах Ульяновской и Самарской областей.
Посев материала производили на среды Эндо, Плоскирева и висмут-сульфит агар, инкубировали при температуре 36-37 С 18-20 часов.
Выросшие в чашках на среде Эндо: бесцветные или сероватые колонии с розовым оттенком, с характерным для протея ползущим ростом (рис. 1); на агаре Плоскирева - полупрозрачные колонии с перламутровым оттенком, в зоне роста колоний среда подщелачивалась и преобретала желтизну (рис. 2); на висмут-сульфит агаре (через 48 часов инкубации) - темно-коричневые колонии (рис. 3), пересевали в МПБ (по 4-6 колоний с чашки). Культуры микроорганизмов инкубировали при 37 С в течение 18 часов (до появления выраженного помутнения среды).
Первичные бульонные культуры, выделенные после пересева колоний с вышеперечисленных сред, микроскопировании (окраска по Граму) и при наличии в мазках грамотрицательных палочек с закругленными концами, не образующих спор и капсул, располагающихся одиночно и попарно, подвергали дальнейшему изучению с целью родовой и видовой идентификации, а также для определения их патогенности.
Видовую принадлежность культур устанавливали на основе определения морфологических и культурально-биохимических свойств. Ферментативные свойства изучали у агаровых культур бактерий, выделенных из одного патологического материала, на наборе полужидких сред с углеводами и индикатором ВР, куда входят среды с глюкозой, лактозой, сахарозой, маннитом, мальтозой, а также на среде с мочевиной, среде Клиглера, агаре Симонса, МПЖ, среде с фе-нилаланином, использовали реактив Эрлиха (для обнаружения индола). В качестве дополнительных тестов ставили реакции с метилротом и Фогес-Проскауэра, а также определяли подвижность микроорганизмов. Посевы инкубировали при температуре 37-38 С в течение 24-48 часов. Результаты исследований представлены в таблице 2.
Таким образом, в результате проведенных исследований нами было выделено объектов внешней среды и патологического материала 12 культур бактерий, которые мы классифицировали по ферментативным свойствам («Методических указания по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемых патогенными энтеробактериями», 1999) и отнесли к роду Proteus (видам P. vulgaris, P. mirabilis). Результаты представлены в таблице 3.
Из данных таблицы 3 видно, что источники выделения бактерий рода Proteus различны: это сточные воды из животноводческих хозяйств и патологический материал, что говорит о широком распространении данных бактерий и устойчивочти к условиям окружающей среды.
Патогенные свойства выделенных культур бактерий рода Proteus определяли в биопробе на белых мышах методом внутрибрюшинного введения 0,5 млрд. микробных клеток. Для этого использовали суточные бульонные культуры бактерий, выделенные из двух органов и тканей погибших или фекалий больных животных. Взвесями каждого вида бактерий заражали по три белых мыши. Культуру признавали патогенной в случае гибели двух или более мышей в течение трех суток после заражения и относили ее к возбудителям болезни. Результаты исследований представлены в таблице 4.
Анализируя данные таблицы 4, можно утверждать, что выделенные из объектов внешней среды 12 культур бактерий рода Proteus обладают патогенными свойствами.
В результате бактериологических исследований 64 проб объектов ветеринарного надзора 10 хозяйств Ульяновской и Самарской областей нами было выделено 12 культур бактерий рода Proteus из проб, взятых в 7 хозяйствах, что составило 70 %. Этот показатель свидетельствует о широком распространении бактерий рода Proteus в объктах ветеринарного надзора на территории Ульяновской и Самарской областей.
Разработка технологических параметров изготовления биопрепарата для фагодиагностики бактерий рода Proteus
Производственные штаммы и порядок работы с ними
Для изготовления индикаторных протейных бактериофагов использовали штаммы фагов П-16 УГСХА и П-261 УГСХА и культуры: P. vulgaris 261 и Р. vulgaris 3. Протейные индикаторные бактериофаги изготавливали путем культивирования в питательном бульоне (рН 7,4-7,6) с индикаторными культурами для фага П-16 УГСХА - P. vulgaris 3 и для фага П-261 УГСХА - P. vulgaris 261. Индикаторные культуры хранили на полужидком МПА (рН 7,2-7,4) с содержанием 0,2-0,3 % МПА при температуре 2-4 С. Культуры, поддерживаемые на полужидком МПА, пересевали каждые 2-3 месяца.
Морфологические, культуральные, ферментативные свойства производственных штаммов культур P. vulgaris 261 и P. vulgaris 3 проверяли перед использованием их в производстве не реже одного раза в 6 месяцев.
Биологические свойства производственных культур Морфологические свойства. Культуры P. vulgaris 261 и P. vulgaris 3, которые используются в производстве бактериофагов П-16 и П-261 серии УГСХА, представляли собой грамотрицательные палочки, не образующие спор и капсул. Морфология микроорганизмов изучали на мазках, окрашенных по Граму. Подвижность определяли в висячей или раздавленной капле, а также путем посева в полужидкий агар.
Кулътуралъные свойства. Для определения культуральных свойств культуры P. vulgaris 261 и P. vulgaris 3 высевали на среду Эндо в чашках Петри и в МПБ, выращивали при температуре 37 С в течение 18 часов в условиях термостата. На среде Эндо характерной особенностью для вышеуказанных штаммов протея являлась способность к «роению» (ползущий рост), выражающаяся образованием на поверхности среды вуалевого налета. В МПБ рост вышеуказанных штаммов протея проявлялся в виде равномерного интенсивного помутнения среды с наличием осадка, который при встряхивании пробирки легко разбивается. На среде Плоскирева штаммы P. vulgaris 261 и P. vulgaris 3 образовывали крупные (4-8 мм) полупрозрачные колонии с перламутровым оттенком, среда в зоне роста колоний подщелачивалась и преобретала желтизну. На висмут-сульфит агаре через 24-48 часов культивирования колонии вышеуказанных штаммов протея имели темно-коричневый цвет.
Ферментативные свойства. Характерной биохимической особенностью бактерий P. vulgaris 261 и P. vulgaris 3 являлась способность образовывать индол, расщеплять мочевину, разжижать желатину, дезаминировать фенилаланин, ферментировать мальтозу, сахарозу, глюкозу; давать отрицательный результат в реакции Фогеса-Проскауэра, не декарбоксилировать орнитин.
Патогенностъ. Производственные культуры (P. vulgaris 261 и P. vulgaris 3) в дозе 0,5-1,0 млрд. микробных клеток вызывали гибель белых мышей при внутрибрюшинном заражении. Для проверки патогенности использовали 18-часовые бульонные культуры, в установленой концентрации в 1 млрд. микробных клеток в 1 мл, и вводили белым мышам массой 14-16 граммов по 0,5 мл внутрибрюшинно, используя трех белых мышей. Наблюдение за мышами проводили в течение трех дней. Две мыши из трех погибли в течение трех дней, таким образом, вышеуказанные культуры считали патогенными. Индикаторные культуры были чувствительны к фагам: P. vulgaris 261 к фагу П-261 УГСХА и P. vulgaris 3 к фагу П-16 УГСХА. Чувствительность проверяли на чашках Петри с 1,5 % МПА по нижеописанной методике.
Основание чашки Петри делили на три сектора. 18-часовую бульонную культуру индикаторного штамма P. vulgaris 261 наносили на чашку с агаром и распределяли шпателем по поверхности МПА для получения сплошного роста бактерий, посевы инкубировали в условиях термостата в течение 15-20 минут при температуре 37 С. После чего на поверхность среды, в зоне первого сектора, наносили каплю фага П-16 УГСХА возле края чашки и, наклоняя чашку, давали ему стечь в виде дорожки по агару. На второй сектор аналогичным образом наносили каплю фага П-261 УГСХА, на третий сектор - стерильный МПБ для контроля. Посевы в чашках инкубировали при 37 С. Учет проводили через 16-18 часов. Аналогичным образом исследовали чувствительность культуры Р. vulgaris 3 по отношению к фагам П-16 и П-261 серии УГСХА. В результате проведенных опытов на месте нанесения фагов П-16 и П-261 серии на газон культур P. vulgaris 261 и P. vulgaris 3 образовывались зоны лизиса.
Разработка оптимальных количественных параметров соотношения протейной культуры и гомологичного бактериофага для его селекции
При добавлении фаголизата к культуре бактерий соотношение между количеством корпускул фага и количеством бактериальных клеток выражают понятием множественности фаговой инфекции. При высокой множественности инфекции лизис культуры может наступить очень быстро, однако нарастание титра фага в таком лизате будет сравнительно небольшим (в десятки, сотни раз). Иногда в таком случае на одной бактериальной клетке может адсорбироваться сотни корпускул фага и вследствие их литического фермента на клеточную стенку может произойти лизис бактерии извне прежде, чем развернется в ней внутриклеточное размножение фага. При малой множественности инфекции, когда в молодой культуре первоначально поражаются не все бактериальные клетки, литический цикл развития фага с освобождением нового потомства проходит не один раз. В этом случае титр фага в лизате может возрасти в сотни тысяч раз (Хейс, 1965; Ревенко, 1978). Опытным путем мы проверяли, при каком варианте множественности инфекции происходит максимальное увеличение титра бактериофага в лизате (табл. 14).
Таким образом, оптимальная множественность инфекции фага П-16 УГСХА для установления высокого титра фага составляет 1 корпускула фага на 1 бактериальную клетку, фага П-261 УГСХА - также 1 к 1.У становив оптимальную множественность инфекции, разработали схему проведения пассажей бактериофагов П-16 УГСХА и П-261 УГСХА для получения фаголизатов с высокой активностью.
Исходные штаммы фагов Исходный штамм фага П-16 УГСХА поддерживали на культуре P. vulgaris 3 в питательном бульоне, исходный штамм фага П-261 УГСХА поддерживали на культуре P. vulgaris 261 в питательном бульоне. Пересев фагов нужно проводить через 3-4 месяца хранения в холодильнике при температуре 2-4 С. Перед пересевом фаги пассировали. Схема пассирования: к 4,5 мл питательного бульона добавляли 0,2 мл фага, оттитрованного предварительно по методу Грациа, и 0,2 мл 18-часовой бульонной индикаторной культуры. Контроль: к 4,5 мл питательного бульона добавляли 0,2 мл 18-часовой бульонной индикаторной культуры. Смеси инкубировали в течение 4-6 часов при температуре 37 С. После наступления лизиса бактерий и просветления среды пробирки с фагами прогревали на водяной бане при температуре 58-60 С в течение 30 минут, далее из них проводили пересев (второй пассаж) в пробирку, содержащую 4.5 мл питательного стерильного бульона в объеме 0,2 мл, куда вновь добавляли 0,2 мл 18-часовой бульонной культуры. Проводили 4 пассажа фага. Последующее поддержание фага в лаборатории проводили путем систематического пассирования на индикаторной культуре через каждые 3-4 месяца.
После пассирования фага его пересевали, для чего во флакон с содержанием 200 мл МПБ вносили 9 мл фага с титром 10 корпускул и 9 мл 18-часовой бульонной индикаторной культуры. Контроль: к 4,5 мл питательного бульона добавляли 0,2 мл индикаторной культуры. Смеси инкубировали при 37 С в течение 4-6 часов. Среда с добавленным фагом и культурой оставалась прозрачной, а в контрольной пробирке наблюдали рост культуры в виде интенсивного помутнения среды с образованием легко разбиваемого при встряхивании осадка. Полученные фаги прогревали на водяной бане при температуре 58-60 С в течение 30 минут, затем фаги разливали во флаконы по 2 мл. Разлитые во флаконы фаги контролировали на чистоту, стерильность и определяли его титр.
Исходные штаммы фагов имели следующую характеристику: титр фагов по Грациа был 109 корпускул в 1 мл, размер негативных колоний фага П-16 УГСХА равен 2,0-3,0 мм, фага П-261 УГСХА равен 3,0-4,0 мм с зоной неполного лизиса, при инкубации 16 часов. Исходные штаммы фагов лизировали индикаторные и свежевыделенные бактерии рода Proteus. Приготовление питательной среды
Питательной средой для приготовления индикаторных бактериофагов служит стандартный мясопептонный или питательный бульон для культивирования микроорганизмов.
Приготовление исходных фагов
Для приготовления маточных фагов П-16 УГСХА и П-261 УГСХА использовали исходные фаги 4-го пассажа на индикаторной культуре P. vulgaris 3 для фага П-16 УГСХА и P. vulgaris 261 для фага П-261 УГСХА. Их готовили на питательном бульоне (рН 7,4-7,6). Фаг с титром 10 корпускул в 1 мл в объеме 2 мл вносили в колбу с 45 мл питательного бульона (рН 7,4-7,6). В колбу добавляли 2 мл 18-часовой индикаторной культуры. Контроль: к 4.5 мл питательного бульона добавляли 0,2 мл 18-часовой индикаторной культуры. Смеси инкубировали при 37 С в течение 4-6 часов. Через 3 часа МПБ с добавленным фагом и культурой был прозрачным, а в контрольной пробирке наблюдали рост культуры в виде интенсивного помутнения среды с образованием легко разбиваемого при встряхивании осадка. Полученные по вышеописанной методике фаги П-16 УГСХА и П-261 УГСХА прогревали на водяной бане при температуре 58-60 С в течение 30 минут.
Затем исходные фаги с титром 109 корпускул в 1 мл, в объеме 20 мл добавляли в колбу с 450 мл питательного бульона. В эту же колбу добавляли 20 мл 18-часовой индикаторной культуры. Контроль: к 4,5 мл питательного бульона добавляли 0,2 мл 18-часовой индикаторной культуры. Смеси инкубировали при 37 С в течение 3 часов. Полученные фаги прогревали на водяной бане при температуре 58-60 С в течение 30 минут.
Установление оптимального времени, обеспечивающего наиболее полноценное взаимодействие фага с бактериями
Для установления оптимального времени, обеспечивающего наиболее полноценное взаимодействие фага с бактериями необходимо было провести эксперименты на тест-объекте по выявлению наиболее эффективного временного показателя взаимодействия фага и индикаторной культуры при сохранении остальных параметров (температурный режим, концентрация бактериальной культуры и фаговых корпускул в 1 мл) постановки РНФ. В качестве тест-объекта использовали МПБ, контаминированный бактериями рода Proteus. Оптимальное время экспозиции выбирали из шести следующих параметров:
- при предварительном подращивании исследуемого материала в течение 5 часов при температуре 37 С, после добавления фагов смесь выдерживали в течение 5 часов при температуре 37 С;
- при предварительном подращивании исследуемого материала в течение 16 часов при температуре 37 С, после добавления фагов смесь выдерживали в течение 5 часов при температуре 37 С;
- при предварительном подращивании исследуемого материала в течение 24 часов при температуре 37 С, после добавления фагов смесь выдерживали в течение 5 часов при температуре 37 С;
- при увеличении времени контакта исследуемого материала с фагом до 10 часов при температуре 37 С
- при увеличении времени контакта исследуемого материала с фагом до 16 часов при температуре 37 С;
- при увеличении времени контакта исследуемого материала с фагом до 24 часов при температуре 37 С.
Методика предварительного подращивания исследуемого материала: брали три комплекта колб с МПБ (по 50 мл) и контаминировали бактериями рода Proteus (P. vulgaris 261 для П-261 УГСХА и P. vulgaris 3 для фага П-16 УГСХА) в концентрации от 101 до 105 м.к./мл. Смеси в течение 10 минут встряхивали в шуттель-аппарате и ставили в термостат при температуре 37 С: первый комплект на 5 часов, второй комплект на 16 часов, третий комплект на 24 часа. После культивирования в термостате содержимое колб разливали по пробиркам следующим образом. На каждую исследуемую пробу брали 3 пробирки: № 1 была предназначена для опытной пробы; № 2 была предназначена для контроля на свободный фаг; № 3 была предназначена для контроля титра индикаторного фага. Контроль титра индикаторного фага ставили один на группу анализов, проводимых одновременно. Исследуемый материал разливали по 9 мл в пробирки № 1 и № 2. Пробирка № 3 содержала 9 мл МПБ. В пробирки № 1 и № 3 добавляли по 1 мл индикаторного фага в рабочем разведении, содержащем 104 фаговых частиц в 1 мл. В пробирку № 2 вносили 1 мл МПБ. Пробирки встряхивали и ставили в термостат при температуре 37 С на 5 часов.
По окончании инкубации из каждой пробирки брали по 0,25 мл материала и вносили в пробирки с 4,5 мл МПБ (для получения в контроле на индикаторный фаг сосчитываемого количества негативных колоний). Все пробирки прогревали при 58-60 С в течение 30 минут и подвергали дальнейшему исследованию методом агаровых слоев по Грациа (п. 2.2.3.). Результаты учитывали через 12 часов.
Параллельно исследовали изучаемый материал бактериологическим методом (методика получения субстратов изложена в п. 2.4., часы культивирования в термостате аналогичны с методикой установления оптимального времени, обеспечивающего наиболее полноценное взаимодействие фага с бактериями) для сравнения с РНФ и получили следующие результаты: бактерии рода Proteus обнаруживались в концентрации 104 м.к./мл, при этом затрачивалось 96 часов. Результаты этих исследований приведены в таблицах 22-23.
Опытным путем было установлено, что подращивание материала в тече-ниє 5 часов позволяет обнаружить протей с помощью РНФ в концентрации 10" м.к./мл для фага П-261 УГСХА и 102 м.к./мл для фага П-16 УГСХА. При подращивании исследуемого материала в течение 16 часов чувствительность реакции не повышается и также позволяет обнаружить бактерии рода Proteus в количестве 102 м.к./мл для фага П-16 УГСХА и для фага П-261 УГСХА. На проведение исследования затрачивается 33 часа. Бактериологическим методом это же коли-чество протеев обнаружить удалось обнаружить через 16 часов подращивания материала, но на постановку реакции было затрачено 88 часов. При подращивании исследуемого материала в течение 24 часов чувствительность реакции не увеличивалась и также позволяла обнаружить бактерии рода Proteus в количестве 102 м.к./мл для фага П-261 УГСХА и для фага П-16 УГСХА. На проведение этого варианта реакции было затрачено 41 час.
При подращивании материала в течение 24 часов, исследуя его бактериологическим методом, нам удалось обнаружить протей в количестве 102, на проведение опыта было затрачено 96 часов.
Во втором варианте опыта МПБ, контаминированный бактериями рода Proteus (P. vulgaris 261 для П-261 УГСХА и P. vulgaris 3 для фага П-16 УГСХА) от 101 до 105 м.к./мл не подращивали, а сразу же после встряхивания колб в шуттель-аппарате вносили в пробирки. Для каждого опыта использовали по три комплекта из 3 пробирок. В пробирки № 1 и № 2 вносили исследуемый материал из колб в количестве 9 мл. В пробирку № 3 вносили 9 мл стерильного МПБ. Затем в пробирки № 1 и № 3 добавляли по 1 мл индикаторного фага в концентрации 10 фаговых корпускул в миллилитре, в пробирку № 2 вносили 1 мл стерильного МПБ и помещали в термостат при температуре 37 С: первый комплект на 10 часов, второй на 16 часов и третий на 24 часа. По окончании инкубации из каждой пробирки брали по 0,25 мл материала и вносили в пробирку с 4,5 мл МПБ (для получения в контроле на индикаторный фаг сосчитываемого количества негативных колоний). Все пробирки прогревали при 58-60 С в течение 30 минут и подвергали дальнейшему исследованию методом агаровых слоев по Грациа (п. 2.2.3). Через 12 часов учитывали результаты, которые отражены в таблицах 24-25.
По результатам изучения чувствительности РНФ в зависимости от време ни инкубирования исследуемого материала с фагом установлено, что культивирование исследуемого материала в течение 5 и 10 часов позволяет обнаружить протеев с помощью РНФ в концентрации 102 м.к./мл для фага П-16 УГСХА и 10 м.к./мл для фага П-261 УГСХА. При инкубировании исследуемого материала с фагом в течение 16 часов чувствительность реакции не повышается, что позволяет обнаружить бактерии в количестве 102 м.к./мл для фага П-16 УГСХА. На проведение исследования затрачивается 29 часов. Бактериологическим методом это же количество протеев обнаружить удалось при инкубировании исследуемого материала в течение 16 часов, но на проведение опыта было затрачено 88 часов. При инкубировании с фагом исследуемого материала в течение 24 часов чувствительность реакции не увеличивалась и позволяла обнаруживать бактерии в количестве 10 м.к./мл для фагов П-16 УГСХА и П-216 УГСХА. На проведение этого варианта реакции был затрачен 41 час. Протеи в количестве 10 м.к./мл были обнаружены в исследуемом материале также и бактериологическим методом, но на проведение опыта было затрачено 96 часов.
На основании полученных данных, считаем, что наиболее эффективными являются режимы РНФ при 5 часовой экспозиции исследуемого материала с фагом, когда удается провести индикацию бактерий рода Proteus в количестве 10 в миллилитре исследуемого субстрата, на исследование которого затрачивается 18 часов, поэтому данный режим используем в дальнейших исследованиях. По результатам исследования метод подращивания не уступает по чувствительности методу экспозиции исследуемого материала с фагом в течение 10, 16, 24 часов, но недостаток в том, что при этом затрачивается больше времени.
