Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 5
Глава I. Взаимоотношение актиномицетов с растениями 5
1.1. Актиномицеты ризосферы 6
1.2. Фитопатогенные актиномицеты 15
1.3. Актиномицеты симбионты 26
1.3.1. Природа эндофита клубеньков на корнях небобовых растений 27
1.3.2. Основные особенности симбиоза актиномицетов. с растениями. 28
1.3.3. Цикл развития актиномицетов-эндофитов 30
1.3.4. Выделение чистой культуры эндофита актино-ризных растений 36
II. Экспериментальная часть
Глава 2. Материалы и методы 43
2.1. Объекты 43
2.2. Методы стерилизации 43
2.3. Среды 47
2.4. Методы выращивания проростков 52
2.5. Методы выделения актиномицетов из клубеньков и ризосферы небобовых азотфиксирующих растений 56
2.6. Методы изучения чистых культур актиномицетов 63
2.7. Методы изучения взаимодействия чистых культур актиномицетов с корневой системой ольхи 67
2.8. Методы изучения взаимодействия актиномицетов почвы с корневой системой ольхи 69
Глава 3. Результаты выделения актиномицетов из клубеньков и ризосферы 72
Глава 4. Изучение чистых культур актиномицетов клубеньков и ризосферы
4.1. Актиномицеты рода Frankia 81
4.2. Изучение жизненного цикла стрептомицетов...
4.3. Изучение жизненного цикла выделенных культур рода Hocardia 107
4.4. Актиномицеты рода Micromonospora
Глава 5 . Взаимодействие растения с чистыми культурами нефранкиальных актиномицетов 128
5.1. Начальные этапы контакта актиномицетов с корневой системой 128
5.2. Определение способности к азотфиксации у не-франкиальных актиномицетов 139
5.3. Способность нефранкиальных актиномицетов образовывать корневые клубеньки 141
Глава б. Взаимодействие актиномицетов эвдофитов разных почв С Alnus glutinosa 145
6.1. Распространение актиномицетов эвдофитов серой ольхи в разных почвах 145
6.2. Морфология эвдофитов in viv0 в клубеньках, сформированных при инфицировании ольхи разными почвами 148
6.3. Специфическая реакция корневой системы ольхи на присутствие эндофита в ризосфере 153
Выводы 161
Список литературы 163
- Актиномицеты ризосферы
- Объекты
- Актиномицеты рода Frankia
- Начальные этапы контакта актиномицетов с корневой системой
Введение к работе
Актуальность проблемы.Симбиотическая фиксация атмосферного азота растениями является одним из основных процессов в природе, обеспечивающим почву связанным азотом, и следовательно, имеющим прямое отношение к повышению плодородия почв, увеличению продуктивности сельского и лесного хозяйства. Резкое удорожание азотных удобрений и растущая очевидность пагубных последствий их неорганизованного использования также служат существенными стимулами исследования этого процесса. В настоящее время становится все более очевидным, что еще длительное время изучение и оптимизация деятельности имеющихся в природе, а не создание новых типов симбиозов, будут основным путем развития исследований по биологической азотфиксации.
Из трех типов азотфиксирующих симбиозов - цианобактерий с голосеменными растениями, клубеньковых бактерий с бобовыми растениями и актиномицетов с покрытосеменными древесными и кустарниковыми растениями ("актинориза")-последний тип симбиоза наименее изучен. Между тем этот симбиоз занимает первое место среди других по таксономическому разнообразию растений -хозяев, отличается значительной эффективностью процесса азот-фиксации, играет особую роль в природных экосистемах умеренного климата. Особенно примечательна роль этих растений как пионеров растительности: в течение сотен тысяч лет они поселялись на бесплодных землях, делая их плодородными для других растений. Актиноризные растения используются для повышения плодородия лесных и болотистых почв, в борьбе с эрозией и при рекультивации нарушенных земель. Хотя первые эмпирические попытки практического использования этих растений в сельском, лесном и садовом хозяйствах относятся ко временам древнего мира, обсуждаемое ныне использование симбиоза в рамках современных биотехнологических программ связано с необходимостью устранения многих белых пятен в знаниях о его природе и принципах функционирования.
Чистые культуры актиномицетов-эндосимбионтов p. Prankia удалось получить сравнительно недавно и выделение их продолжает оставаться одной из актуальных задач, решение которой необходимо как для представления об объеме рода, его экологическом разнообразии, так и с практической целью - для выявления наиболее эффективных форм, которые могут быть использованы как основа нового бактериального удобрения. Франкии представляют интерес не только как активные симбиотические азотфиксаторы. Принадлежность франкий, способных фиксировать азот атмосферы в значительных количествах и в чистой культуре, к группе прокариот, имеющих большое промышленное значение, позволяет надеяться, что их практическая роль может быть дополнена использованием как продуцентов антибиотиков и других ценных метаболитов; продуцентов, способных расти на простых селективных средах без азота, что не только удешевит производство, но и значительно упростит его.
Состояние вопроса, цели и задачи исследования. К моменту начала настоящей работы /1977г./ основной азотфиксирующий эндосимбионт актиноризных растений не был выделен и охарактеризован в чистой лабораторной культуре; о составе и свойствах других актиномицетов, способных вступать во взаимодействие с актиноризными растениями,было известно очень мало. Между тем представлялось, что изучение актиномицетных популяций, обитающих в своеобразной экологической нише - корневых клубеньках и ризосфере, характеристика представителей этих популяций в процессе перевода их в лабораторную культуру - могут послужить не только источником штаммов перспективных для искусственной инокуляции растений, но и знаний о таких свойствах актиномицетов, которые не выявляются /или слабо выявляются/ при исследовании культур, адаптировавшихся к условиям существования в коллекциях. В связи с изложенным, целью настоящей работы явилось выделение в чистую культуру возможно более широкого круга актиномицетов, обитающих в корневых клубеньках и ризосфере актино-ризных растений, изучение у свежевыделенных актиномицетов морфологических, культуральных, инфекционных свойств. В число задач входили следующие.
Совершенствование и апробация методов выделения актиномицетов из клубеньков и ризосферы актиноризных растений.
Ориентировочная идентификация изолятов.
Изучение жизненных циклов актиномицетов сразу после выделения в разных лабораторных условиях.
Оценка возможных путей взаимодействия выделенных штаммов с растением.
Выявление распространения и разнообразия эндофитов в разных почвах.
Уточнение характера специфической реакции растения на присутствие эндофита в ризосфере.
Научная новизна. Впервые в СССР выделены в чистую культуру актиномицеты-симбионты рода Frankia. У культур стрепто-мицетов и нокардий, выделенных из клубеньков и ризосферы актиноризных растений с помощью разработанных для этого методов, описаны неизвестные особенности развития и репродукции. Получены новые сведения о взаимодействии чистых культур нефранки-альных актиномицетов с растением, о распространении и разнообразии эндофита серой ольхи в разных почвах, о процессах, протекающих при его контакте с растением.
Практическая ценность. Получение чистых культур франкий и актиномицетов, способствующих инфекции,создает предпосылки для искусственной инокуляции актиноризных растений, а в перспективе - для создания новых форм бактериальных удобрений. Выделенные актиномицеты используются в генетических, физиологических и таксономических исследованиях, которые способствуют лучшему пониманию азотфиксирующего симбиоза и тем самым управлению его деятельностью. Эти культуры проверяются на способность к синтезу физиологически активных веществ и ферментов.
Актиномицеты ризосферы
Актиномицетам в исследовании ризосферной микрофлоры уделялось меньше внимания, чем бактериям и грибам. О связи этих организмов с ризосферным феноменом существуют неполные, а иногда и противоречивые сведения. В этой части обзора будет рассмотрен вопрос о влиянии корневых выделений растений на развитие актиномицетов почвы и наоборот, о воздействии актиномицетов ризосферы на рост растений.
Зона корневых выделений,или ризосфера, это зона почвы с градиентом численности микроорганизмов, идущим от поверхности корней, или ризопланы, где воздействие на микроорганизмы наиболее сильно, вплоть до одного или двух сантиметров от поверхности корней, где их воздействие минимально /Браун, 1979/. Понятие "ризосферний эффект" введено Кацнельсоном /Katznelson, 1946/, оно означает соотношение между микроорганизмами ризосферы и микрофлоры почвы, не содер-кащей корней растений.
В ранних работах было отмечено, что корневые выделения многих растений не оказывают существенного влияния на развитие в их ризосфере актиномицетов почвы / Starkey, 1929, Thorn, Heim-field, 1932; Clark, 1949/.
В современных исследованиях содержатся свидетельства как стимулирующего / Rangaswami, Vasantharajan, 1962; Abraham, Herr , 1964; ileal et al., 1964; Watson, Williams, 1974; Vollmer et al. , 1977; Кушнир, 1977/, так и ингибирующего /Самцевич, 1956; Самцевич, Уласевич, 1965; Bernhard , 1967 ; Егорова, Степанова, 1972; Новицкий, 1974; Пашко, 1978/действия разных растений на развитие этих организмов в ризосфере, причем количество актиномицетов в ризосфере превышает на порядок содержание их в окружающей почве, либо актиномицеты в зоне корней встречаются лишь спорадически.
Анализ данных разных авторов за последние 30 лет /Самцевич, 1978/ показывает, что в незначительном числе случаев происходит подавление развития актиномицетов в ризосфере растений, в то время как на поверхности корней подавление преобладает. Результаты ряда работ указывают на зависимость количества актиномицетов в зоне корней от возраста растения /Katznelson, 1946; Красильников, 1958; Мазунина, Амирханова, 1977; Юрчак с соавт., 1977, Sivasithamparan et al., 1979/. В модельных опытах показано, что заселение зоны корней молодых проростков актиномицеты ведут после бактерий и грибов / Watson, Williams, 1974/.
Предположительное объяснение этого факта таково. По-видимому, первыми ризосферу заселяют подвижные мелкие бактерии, характеризующиеся способностью к быстрому росту на разнообразных легкогидролизуемых субстратах /г -стратегия/, актиномицеты же -медленнорастущие формы, использующие трудногидролизуемые субстраты /К-стратегия/ /Головлев, 1983/,-позднее заселяют ризосферу и содержатся в ней в сравнительно малых количествах.
Противоречивы сведения о том, какую часть ризосферной микрофлоры составляют актиномицеты: одни авторы считают - не более 1% / butit et al., 1972; Красильников, 1958; Юрчак с соавт., 1977/, другие - от 1% до 50% / De Leval, Remade, 1969; Yollmer et al., 1977; Fernandez, Szabo, 1978; Горина с соавт., 1976/; следует отметить, что эти результаты могут очень сильно зависеть от способа подсчета актиномицетов. В тех работах, где проводилось определение видового состава актиномицетов ризосферы, было показано, что корневые выделения могут действовать избирательно по отношению к определенным видам стрептомицетов почвы /?/atson, Williams, 1974; Джамаспишвили, Джиджишвили, 1977/; более того, ряд исследователей отмечает, что отдельные виды стрептомицетов являются специфическими, то есть не встречаются вне ризосферы - таблица I /Rangaswami, Vasantharajan, 1962; Bernhard, 1967; Fernandez, Szabo, 1978/. В некоторых случаях показано, что актиномицеты ризосферы и ризопланы различаются по составу / Vruggink, 1976; Джамаспишвили, Джиджишвили, 1977; Кушнир, 1977/.
Известно, что микроорганизмы, активно размножающиеся в ризосфере, могут влиять на развитие растения различными путями. Один из основных - образование организмами ростовых веществ, которые всасываются корнями растений. О возможном участии актино-мицетов в этом процессе могут свидетельствовать следующие результаты лабораторных исследований. Показано стимулирование развития растений, корней, прорастания семян при обработке их суспензией культур актиномицетов, взятых из коллекции, свежевыделенных из ризосферы /Красильников, 1958; Мазунина, 1977; Мазунина, Исаба-ева, 1977/. Известно, что стимулирующее действие микроорганизмов на рост растений, как правило, обусловлено синтезом ауксинов. В данном случае эта способность связана с продуцированием гибе-реллинов и гибереллиноподобных веществ, которое обнаружено у некоторых культур лучистых грибков /Красильников, 1958; Казарьян, Агаджанян, 1971; Katznelson, Cole, 1965; Kaunat, 1969; Purashotaman et al., 1973/. В одной из работ найдено, что ризо-сферные актиномицеты синтезируют эти вещества из триптофана; синтез ингибируется добавлением других аминокислот /Kaunat,1969/.
В лабораторных условиях показано также, что актиномицеты могут подавлять рост изолированных корней, вызывают хлороз, некроз тканей отдельных растительных органов /Красильников, 1958; Кушнир, 1977; Патыка с соавт , 1981/. Такие актиномицеты выделяются в значительных количествах при возделывании растительных монокультур /Пашко, 1978; Мазунина, Амирханова, 1977/. Фитотоксические вещества по природе могут быть антибиотиками -стрептомицином, актидионом, антимицином /Красильников, 1958; Шемякин с соавт., I96J/; в одной из работ показано, что фито-токсин сильного действия, синтезируемый культурой streptomyces massasporeus Д-4 (при концентрации 250 мкг/мл полностью инги - II бирует прорастание семян) является специфическим веществом -олигосахаридом Сзі%5 25 (Патыка с соавт., 1981). В литературе была отмечена закономерность в распространении актиномицетов, продуцирующих физиологически активные вещества: в почве вне ризосферы преобладают индифферентные актиномицеты, в ризосфере более Ш/о актиномицетов - ингибиторы роста растений, актиномицеты - стимуляторы доминируют на поверхности корней /Кушнир, 1977/.
Объекты
Стерилизация семян: Семена ольхи стерилизовали посредством метода, разработанного нами /в табл.7 - вариант I/; свежесобранные семена стерилизовали без сулемы. Использованный метод, включал процедуру, приводящую к кратковременному прогреванию семян - 44 Таблица б. Дочвы различных природно-климатических зон. пп Почва Растительный покров Район взятия Природно образца климатическая зона I. Аллювиальная дерновая ольшаник пойма реки Протвы таежно-лесная 2. Аллювиальная дерновая ольшаник пойма реки Оки таежно-лесная 3. Серая лесная лесная Тульские лесо полоса засеки степная 4. Чернозем типичный целина Курская область лесостепная 5. Каштановая целина Ростовская область сухие степи 6. Серозем типичн. целина Ашхабадская область сухие субтропики 7. Желтозем лесная предгорье, влажн.суб полоса Ленкоранская низменность тропики 8. Аллювиальная ольшаник пойма р.Мзымты, горные дерновая Кавказский области субтропическая заповедник 9. Бурая лесная лесная Тебердинский горные полоса заповедник области 10. Субальпийская целина Кавказский горные луговая заповедник области II. Альпийская луговая целина Кавказский заповедник горные области 12 н2о 2 - 46 до 100 С /выделение тепла при реакции HpOg + КШ)4/ которая, как мы полагали, могла способствовать их лучшему прорастанию. В некоторых случаях использовали неоднократное прогревание семян во время стерилизации /табл.7 - вариант 2/. Стерилизация почвы. Для получения стерильной почвы использовали 2 метода. Первый метод - стерилизация У-лучами на установке МРХ-ЮО /Институт нефти и газа им.И.М.Губкина, г.Москва/, общая доза - 5 Мрад. Второй метод - пятикратное автоклавированне при I атмосфере в течение I часа. Почву стерилизовали в объеме не более I кг; стерильность проверяли, помещая комочки и суспензию почвы в пробирки с мясопептонным бульоном. Стерилизация клубеньков. Разработанный нами метод стерилизации клубеньков ольхи предусматривал сжигание их поверхностных тканей для удаления микроорганизмов - почвенных контаминантов. Отдельные клубеньки или их друзы, собранные у природных или оранжерейных растений тщательно отмывали с детергентом /мыльный раствор, твин 20/, удаляли неинфицированные ткани, оставляя для дальнейшего использования терминальные доли клубеньков размером 5-7 мм. Еще раз отмывали, затем опускали дольки в конц. H2so4 на 5 минут /внешние ткани клубеньков при этом обугливались/. После тщательного отмывания стерильной водой до полного удаления обуглившихся тканей клубеньки выдерживали 30 минут в 0,1% растворе сулемы и вновь тщательно отмывали. Клубеньки лоха и облепихи стерилизовали Zfo раствором OsO, по методу Лалонде /Lalonde, et al. 1981/. среда с цитруллином и гуматом натрия: соли и сахара среды № 3.3, микроэлементы и витамины среды № 3.1, гумат натрия - 50 мг/л и цитруллина - 50 мг/л. № 3.7 - среда с листовым экстрактом : 20 г свежесобранных листьев ольхи растирали тщательно в ступке с небольшим количеством воды, суспензию фильтровали через несколько слоев марли, фильтрат стерилизовали через мембранный фильтр (диаметр пор 0,22 мкм), полученную порцию стерильного листового экстракта добавляли кіл солевой и сахарной основы среды $ 3.3, микроэлементы и витамины среды № 3.1. № 3.8 - стерильная увлажненная почва ольшаника, в которую вносили глюкозу (из расчета % веса почвы). 2.4. Методы выращивания проростков ольхи Ниже мы приводим подробное описание методов предложенных или модифицированных нами. Проращивание семян. Семена проращивали в чашке Петри на фильтровальной бумаге, в качестве питательного раствора использовали среду № 1.2. В этих условиях проростки находились до двухнедельного возраста. Затем их переносили в различные, описанные ниже системы для выращивания растений. А. Метод агаровой культуры. Готовили пробирки (25x200 мм) с 10 мл скошенной агаризованной среды № 1.3. При посеве корешки проростков мягко вдавливали стерильной петлей в агар. Засевали по 2 растения в пробирку (рис.1). Б. Метод Фереуса, (Fahraeus, 1957). Система была предложена для изучения процесса инфицирования корней бобовых - 53 растение агаризованная среда Рис.1. Метод агаровой культуры. растение в пленке агара между двумя стеклами Рис.2. Метод Фереуса. - 54 растений клубеньковыми бактериями. Проросток закрепляется между предметным и покровным стеклами в пленке агара, затем опускается в стаканчик с жидкой средой №1.3 (рис.2). В. Метод водной культуры. На небольших кристаллизаторах, заполненных азотсодержащей средой №1.1 (где вместо KCI - 0,01 г кж 3 ), закрепляли марлю, вымоченную в жидком парафине. В марле проделывали прожженным крючком отверстия, куда опускали корешки проростков (более 20 штук на I кристаллизатор), после чего пространство между корнем и марлей либо заполняли ватой, либо заплавляли парафином. Оставляли 2 отверстия, в которые раз в неделю погружали пипетку и трубочку для продувания воздуха и замены среды (рис.За);остальное время отверстия были закрыты ватой. Проростки в этих условиях находились месяц, после чего их пересаживали в подобную систему, где в качестве сосуда использовали стакан (объемом не менее 0,5 л), а в качестве питательного раствора - безазотистую среду № 1.3. В одном стакане выращивали 5-7 растений (рис.36).На всех этапах выращивания этим способом старались сохранить стерильность растений.
Актиномицеты рода Frankia
Актиномицеты Ш морфологической группы выделены из клубеньков лоха (штаммы 27LS-38LS) и облепихи (штаммы 39LS-43LS) -- см. табл. 8 и 9. По характерным морфологическим свойствам -хорошо развитому нефрагментирующему мицелию с интеркалярными и терминальными спорангиями различной формы - эти культуры были 1979). отнесены К актиномицетам рода Prankia, (Lechevalier,Leclievalier, Через 8-Ю недель после засева пробирок с жидкой средой №2.10 кусочками клубеньков, проводили отбор пробирок, где рост посторонних бактерий и грибов отсутствовал. В таких пробирках дольки клубеньков обрастали актиномицетным мицелием. Опушенные кусочки рассевали на чашки вглубь полутвердой среды №2.10 (0,8% агара Difco ). Чашки заклеивали и инкубировали при 28С 2-4 недели. Затем проводили микроскопический контроль колоний, появившихся в толще агара и вокруг кусочков. Из тех клубеньков, которые изначально обильно обрастали мицелием, развивались актиномицеты подобные организмам I морфологической группы (табл.8,9) или имеющие распадающиеся вегетативные и воздушные гифы. Из клубеньков со слабым опушением вырастали колонии небольших размеров (1-2 мм в диаметре, рис.9), имеющие нераспадающийся хорошо развитый мицелий со спорангиями и везикулами; их отсевали на чашки с полутвердой средой №2.10 ив пробирки с жидкой средой того же состава. Не все выделяемые таким образом актиномицеты поддавались субкультивированию. ристого и облепихи крушиновидной. При субкультивировании актино-мицеты росли медленно (видимый рост появлялся через 4 недели); развивались они, как правило, внутри полутвердой среды, реже -на поверхности. Колонии разных штаммов различались по плотности: одни формировались короткими, сильно ветвящимися гифами, другие - более диффузные - длинными и слабоветвящимися. Все ак-тиномицеты обладали однотипной морфологией: на гифах образовывали как терминально, так и интеркалярно спорангии (рис.10) различной формы (круглой, продолговатой, бобо- и грушевидной, сильно суженные на одном конце), разных размеров (от 10 до 30 мкм). На отдельных гифах имелись везикулы 5-7 мкм в диаметре (рис.II). Отметим, что при развитии на жидкой среде №2.10 актиномицеты сильно автолизировались, при этом лизировались не только гифы, но и спорангии со спорами. Такое же явление, как характерное, отмечалось ранее в литературе для актиномицетов, выделенных из клеток животных и человека (Красильников, Гаркина, 1965).
Неудачные попытки выделения актиномицетов из азотфиксиру-ющих клубеньков на корнях небобовых растений предпринимались на протяжении более 100 лет. Впервые зндофит актиноризных растений был выделен из comptonia peregrina - "сладкого папоротника", хорошо развивающегося и образующего множество клубеньков В УСЛОВИЯХ ГИДРОПОННОЙ культуры ( Callaham et al., 1978). Получение чистых культур - эндофитов и анализ их свойств дали возможность сделать заключение о таксономическом положении представителей этой группы. Лешевалье предложили включать в род Frankia, введенный ранее на основании изучения структурных особенностей in vivo Бекингом (Becking, 1970), актиномицеты CO следующими свойствами (Lechevalier, Lechevalier, 1979); 1) азотфиксирующие, образующие клубеньки, растущие в чистой культуре in vitro и способные а) образовывать эффективные и неэффективные клубеньки на корнях растения-хозяина и быть вновь выделенными из этих клубеньков, б) в погруженной жидкой культуре формировать спорангии с неподвижными спорами; 2) свободноживущие, не проявляющие способности образовывать клубеньки или фиксировать азот, но формирующие спорангии в жидкой культуре. На сегодняшний день выявлено, что актиномицеты рода Frankia могзгг образовывать спорангии также на поверхности твердых сред. В литературе описана также способность франкий ко "вторичному росту", который происходит после двухнедельной задержки роста характерных для этих культур колоний. Он представляет собой развитие слабоветвящихся гиф по периферии "первичной колонии", которые не формируют типичные для франкий спорангии ( Quispei, Burggraaf, 1981). Лалонде выявил также, что среди 200 свежевы-деленных чистых культур Prankia spp., способных формировать клубеньки у растений-хозяев,выделяются 3 группы по морфологии, одна из них не образует характерные для этого рода актиномице 198.2). TOB СПОраНГИИ (Hormand, Lalonde, В СВЯЗИ С ЭТИМ авторы ВЫ сказали предположение, что выделяемые из клубеньков ранее не-франкиальные актиномицеты (см. Baker, Torrey, 1979) 1 быть неспорангиальными представителями рода Prankia. На сегодняшний день подбор специфичных стерилизующих агентов и сред для культивирования позволили выделить несколько десятков культур (Baker,1982). Несмотря на достигнутые успехи, для половины известных сегодня актиноризных растений не получены чистые культуры микросимбионтов, остаются открытыми вопросы - 85 об экологическом разнообразии, объеме, структуре рода, о критериях, по которым можно определить инфекционность и эффективность
Начальные этапы контакта актиномицетов с корневой системой
Один из вопросов, касающихся взаимодействия растения с чистыми культурами нефранкиальных актиномицетов, который мы выбрали, был следующий: что происходит сразу после контакта корневой системы с суспензиями клеток актиномицетов, выделенных из клубеньков.
Для изучения использовали методы, описанные выше (см. 2.7.А). Прежде всего следует отметить, что за период проведения наблюдений (І-І4 сут.) не отмечено какое-либо заметное угнетение или стимулирование развития проростков в сравнении с неино-кулированными (контрольными). Микроскопирование корневой системы инокулированных проростков выявило следующее: ных гиф присутствовали шаровидные образования, оптически менее плотные, чем гифы?диаметром 2-3 мкм; они располагались поодиночке или в скоплениях, некоторые были сдвоенные, отдельные имели "отросток" (рис.50а,б,в). Большое количество таких образований было обнаружено в системе, инокулированной культурой стрептомицета 8LS, в которой за время наблюдения сформировался клубенек. Этот клубенек образовался на корешке, целостность которого была нарушена - отрезан кончик (рис.51). Подобные шаровидные образования актиномицетов были выявлены в ризосфере и муцигеле проростка, инокулированного культурой 8LS и методом электронной микроскопии. Следует отметить, что на срезах эти образования также отличались электроной плотностью от обычных гиф:менее плотные были наполнены мезосомными структурами, встречались сдвоенные и имеющие "отросток" (0,3x3 мкм - рис.52а, б,в). Учитывая форму, размеры, оптические и электроннооптиче-ские .свойства обнаруженных нами шаровидных форм, можно предположить, что они являются сферопластами инокулированных культур стрептомицетов, поскольку контроли: суспензия актиномицетов, инкубированная в системе Фереуса без растения и ризосфера не-инокулированного проростка не содержали подобных образований (отростки могут являться сохранившимися гифами). Наше предположение об образовании сферопластов стрептомицетами нуждается в тщательной проверке, так как оно может свидетельствовать в пользу новой, неизвестной еще формы существования актиномицетов в зоне корней. Приведем здесь вывод, к которому приходит Красиль ников на основании изучения поведения актиномицетов в почве прямыми методами: "...актиномицеты пребывают в почве в состоя Рис.50. Шаровидные образования вблизи корневых волосков при инокуляции проростков шт. 2LS (а, б) шт. 8LS в), х800. ниях, отличных от существующих на искусственных питательных средах,...гифы расчленяются на мелкие фрагменты, округляются и превращаются в овальные и шаровидные тельца" (Красильников, 1958). Заметим, что в современной литературе по патогенезу имеются сведения об особом пути инфекции растений и животных L -формами бактерий, актиномицетов (Тимаков,Каган , 1973; Beaman, 1981), а также о приобретении инфекционных свойств сапрофитными бактериями после перехода их в ъ -фазу (Aloysius, Paton, 1984). Со стороны корневой системы проростков в ответ на внесение в ризосферу клеток актиномицетов мы наблюдали реакцию в виде деформации корневых волосков. Известно, что первой видимой реакцией корней на присутствие инфекционного начала является деформация корневых волосков. Однако, до последнего времени оставалось неясным: является ли эта реакция специфической. В качестве инфекционных инокулюмов были взяты чистые культуры актиномицетов-симбионтов рода Pranicia, клубеньковый гомогенат и почва ольшаника; в качестве контролей - неинокулированные растения, а также инокулированные стерильными суспензиями клубеньков и почвы (подробнее о результатах см.6.3). В контрольных вариантах развивающаяся корневая система за время наблюдений /2-14 сут./ приобретает слабые деформации : 10-30$ от общего числа волосков становятся волнистыми, раздутыми, разветвленными. Контакт с инфекционными частицами во всех случаях вызывает "сильные деформации" корневой системы: волоски сильно разветвляются на кончике, после чего скручивается каждая ветка, образуя "кулачок" (рис.53а). По количеству деформированных таким образом волосков и скорости появления деформации инокулю - 133 РИс.52. Шаровидные образования в ризосфере проростка при инокуляции культурой 8LS, некоторые из них сдвоенные.
