Введение к работе
Актуальность темы. Бактериофаги почвенных микроорганизмов привлекают внимание исследователей из-за их повсеместного распространения, многообразия и важной экологической роли (Clokie and Kropinski, 2009; Dwivedi et al., 2012). При этом большинство исследований основано на выделении бактериофагов из различных объектов окружающей среды, в том числе из почвы (Ashelford et al, 2002; Williamson et al., 2003, 2005; Helton et al, 2006; Srinivasiah et al., 2008; Romero-Suarez et al., 2012), и лишь незначительная часть работ посвящена выделению и характеристике бактериофагов, выделенных из бактериальных клеток (Boyer et al., 2008). Поэтому перспективным направлением исследований является выделение и изучение бактериофагов почвенных микроорганизмов.
Бактериофаги находят широкое применение в медицине для лечения бактериальных заболеваний, в генной инженерии для векторного переноса генетических элементов, являются удобной моделью для расшифровки генетического кода и понимания структуры гена, процессов мутагенеза, влияния различных факторов на передачу наследственной информации в живых системах (Стейниер и др., 1979). В природе бактериофаги играют важную роль в качестве фактора, регулирующего численность микробных клеток и в переносе генетической информации посредством трансдукции (Шестаков, 2007). Прогресс в изучении и использовании бактериофагов во многом определяется разработкой и внедрением новых методов их диагностики. В настоящее время разработано много методов индикации и исследования вирусных частиц, но их использование затруднено из-за сложности и малого числа существующих измерительных приборов. Поэтому актуальной является разработка новых экспресс-методов детекции бактериофагов, позволяющих получать точные результаты за короткое время в автоматическом режиме.
В последнее время электрофизические методы, такие как электрооптического и электроакустического анализа, все чаще находят применение для решения ряда задач в микробиологии и биотехнологии. Достоинствами метода электрооптического (ЭО) анализа является возможность анализа нативных клеток без их повреждения, возможность полной автоматизации и стандартизации процесса анализа, быстрота проведения анализа (около 10 мин), высокая чувствительность и небольшая погрешность измерений (в пределах 5%), что позволит использовать данный метод анализа для индикации вирусных частиц, в том числе, в полевых условиях.
Электроакустические методы анализа привлекают все большее внимание
исследователей для анализа биоспецифических взаимодействий, поскольку
характеризуются высокой чувствительностью, точностью измерений (в пределах
2%) и минимальным временем для проведения анализа. Поэтому перспективным
направлением исследований является использование метода
электроакустического анализа для решения вопросов детекции бактериофагов.
Поскольку бактериофагам присущи резко выраженные паразитические свойства, обуславливающие возможность их существования и размножения только в культурах соответствующих видов микроорганизмов, размножение бактериофагов возможно только в живых клетках. Следовательно, изменения электрофизических параметров микробных клеток при их взаимодействии с бактериофагами являются тем маркером, который дополнительно позволяет судить о жизнеспособности клеток. В связи с этим при решении вопроса индикации бактериофагов дополнительно возникает задача детекции микробных клеток - хозяев бактериофагов. Поэтому актуальным направлением исследований является разработка новых методов детекции клеток - хозяев бактериофагов.
Цель работы - выделение и изучение бактериофагов из Azospirillum lipoferum штаммов Sp59b и SR65, и разработка новых методов детекции бактериофагов и клеток азоспирилл с помощью методов электрооптического и электроакустического анализа микробных суспензий.
Для достижения поставленной цели в работе были сформулированы следующие задачи:
-
Выделить бактериофаги из клеток Azospirillum lipoferum штаммов Sp59b и SR65 и изучить их биологические свойства.
-
Исследовать возможность использования метода электрооптического анализа микробных суспензий для детекции бактериофагов на примере бактериофагов, выделенных из A. lipoferum Sp59b и SR65.
-
Изучить возможность применения метода электроакустического анализа клеточных суспензий для детекции бактериофагов.
-
Показать возможность использования методов электрооптического и электроакустического анализа микробных суспензий для детекции бактериофагов в смеси бактериофагов и в присутствии посторонней микрофлоры.
-
Разработать методические подходы индикации бактерий Azospirillum при их взаимодействии со специфическими антителами с помощью метода электроакустического анализа.
Научная новизна работы.
У клеток Azospirillum lipoferum штаммов Sp59b и SR65 обнаружено явление лизогении. Впервые из клеток A. lipoferum штаммов Sp59b и SR65 выделены бактериофаги
Впервые на примере бактериофагов Впервые использованы антитела, специфичные к микробным клеткам A. lipoferum Sp59b и A. brasilense Sp7, для детекции клеток азоспирилл с помощью метода электроакустического анализа клеточных суспензий. Показана возможность использования метода электроакустического анализа суспензий клеток для детекции азоспирилл при их взаимодействии со специфическими антителами в присутствии посторонней микрофлоры. Практическая значимость работы. Выделение и изучение бактериофагов из клеток A. lipoferum штаммов Sp59b и SR65 показало перспективы для их использования при разработке чувствительных методов детекции бактериофагов. Разработана методология детекции бактериофагов электрооптическим анализом клеточных суспензий. Изучение бактерофагов, выделенных из бактерий рода Azospirillum, позволяет проводить фаготипирование почвенных бактерий. Предложен новый способ индикации бактериофагов с помощью метода электроакустического анализа клеточных суспензий. Использование антител, специфичных к микробным клеткам A. lipoferum Sp59b и A. brasilense Sp7, показало возможности их применения для детекции клеток азоспирилл с помощью метода электроакустического анализа. Предложен новый подход для детекции микробных клеток с помощью электроакустического метода анализа. Детекция клеток методом электроакустического анализа позволит проводить контроль численности клеток Azospirillum при их использовании в качестве бактериальных удобрений. Метод электроакустического анализа был использован при выполнении работы по Госконтракту с Саратовским филиалом Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институтом радиотехники и электроники (СФИРЭ) им. В.А. Котельникова, г. Саратов от 29 июня 2010 г. (в рамках гранта РФФИ № 09-02-12442-офим «Исследование физических основ работы нового поколения многопараметрических акустоэлектронных датчиков для изучения и мониторинга биологических реакций в клеточных суспензиях», 2009-2010 гг.) Метод электрооптического анализа был использован при выполнении работы «Разработка методологии и приборного обеспечения электрооптического анализа вирусов микроорганизмов» при поддержке Министерства образования Российской Федерации, соглашение № 8852 (2012-2013 гг.). По результатам диссертации были изданы методические рекомендации по определению литической активности бактериофагов с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий для студентов старших курсов и аспирантов, специализирующихся в области микробиологии, рекомендованные ученым советом ИБФРМ РАН (протокол № 9 от 25.09.2012 г.). Материалы, представленные в диссертации, включены в программы лекций по биотехнологии и микробиологии, для студентов и аспирантов в ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» и ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского». Основные положения, выносимые на защиту: У микробных клеток A. lipoferum штаммов Sp59b и SR65 обнаружено явление лизогении. Использование индуцирующего фактора - низкой температуры позволяет выделять бактериофаги из A. lipoferum штаммов Sp59b и SR65. Изменения электрооптических и электроакустических параметров микробных суспензий при их инфицировании специфическими бактериофагами применимы для детекции бактериофагов. Метод электроакустического анализа микробных суспензий позволяет проводить детекцию бактерий азоспирилл с применением антител. Апробация работы. Основные положения работы были представлены на: 16-ой и 17-ой Международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2012; 2013); 5-ой Всероссийской конференции молодых ученных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2012); Международной научно-практической конференции «Биотехнология: реальность и перспективы в сельском хозяйстве» (Саратов, 2013); Международной научно-практической конференции «Бактериофаги: Теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности» (Ульяновск, 2013). Работа выполнена в лаборатории физиологии микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН) в соответствии с плановыми темами НИР «Исследование электрофизических свойств микробных клеток при их инфицировании бактериофагами» 2009-2012 гг. (№ гос. регистрации 01200904393, научный руководитель зав. лаб. д.б.н., профессор Игнатов О.В.). Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей объекты, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов и списка использованных литературных источников, включающего 151 наименование, в том числе 88 зарубежных. Диссертация изложена на 160 страницах компьютерного текста, включающего 39 рисунков и 10 таблиц.
Похожие диссертации на Выделение бактериофагов из бактерий Azospirillum lipoferum Sp59b и SR65 и их детекция методами электрофизического анализа
