Введение к работе
Актуальность проблемы
Туберкулёз является главным фактором инвалидизации и смертности, имеющим бактериальную природу [Кононец A.C. и др., 2010; Золотарёва Л.В. и др., 2010]. Эпидемия ВИЧ инфекции привела к значительному увеличению заболеваемости туберкулёзом [Корнилова З.Х. и др., 2010], а распространение штаммов Mycobacterium tuberculosis, устойчивых к лекарственным препаратам, создало дополнительные сложности при лечении туберкулёза [Крапина Н.Л. и др., 2010; Drobniewski F. et al., 2005].
Существует множество работ, иллюстрирующих особенности циркуляции штаммов возбудителя туберкулёза в различных регионах мира [Кисличкина A.A., 2009; Lazzarini L. et al., 2008]. Показано, что популяция микобактерий является клональной [Земскова З.С. и др., 2010; Sreevatsan S. et al., 1997]. Для анализа микобактерий используется несколько методов генотипирования, но получаемые результаты часто противоречат друг другу [Supply P. et al., 2006; Gagneux S. et al., 2007; Kremer K. et al., 2005].
Наиболее полная информация о структуре популяции возбудителя туберкулёза, получена, вероятно, в результате анализа 89 генов [Comas Т. et al., 2009]. Необходимость изучения большого количества генов для филогенетического анализа штаммов M. tuberculosis методом мультилокусного секвенирования связана с низким полиморфизмом генома. Это обстоятельство значительно усложняет анализ штаммов и ограничивает применение мультилокусного секвенирования для генотипирования M. tuberculosis.
Другим подходом является анализ полиморфных нуклеотидов, обнаруженных в разных участках хромосомы штаммов M. tuberculosis с полностью идентифицированными геномами [Filliol I. et al., 2006; Gutacker M. et al., 2006]. В результате сравнения последовательностей нуклеотидов в геномах штаммов M. tuberculosis – H37Rv, 1551, 210 и штамме M. bovis AF2122/97 и последующего анализа бактериальных культур, выделенных от пациентов, разработана классификация, позволяющая определить принадлежность штамма к одной из семи групп SCG. Определение точечных мутаций в данном случае проводится с применением аллель-специфичной ПЦР. Этот метод сравнительно прост в использовании, но имеет низкую разрешающую способность и не позволяет эффективно дифференцировать клинические изоляты микобактерий.
Традиционные методы генетического анализа M. tuberculosis также по ряду причин не являются совершенными. При использовании метода RFLP-IS6110 данные, полученные в разных лабораториях, трудно сравнивать между собой. Сполиготипирование основано на анализе только одного участка хромосомы, который к тому же подвержен конвергентной эволюции, а для метода MIRU-VNTR окончательно не определён набор анализируемых локусов.
Для практического здравоохранения важной задачей является быстрое выявление штаммов M. tuberculosis, устойчивых к лекарственным препаратам, а также обнаружение источников и путей распространения таких штаммов. Наибольшим потенциалом для этих целей обладают молекулярно-генетические методы, основанные на ПЦР, так как они позволяют быстро проводить анализ с использованием небольшого количества бактериальной культуры.
Эффективный мониторинг штаммов M. tuberculosis и оперативный обмен информацией между разными лабораториями невозможен без наличия единой системы идентификации. Так как в настоящее время все используемые методы генотипирования штаммов M. tuberculosis имеют недостатки, то возникает необходимость разработки комплексного подхода, основанного на использовании оптимальной комбинации методов.
Актуальность. Актуальность работы определяется тем, что в настоящее время отсутствует единый алгоритм генетической идентификации штаммов M. tuberculosis. Такой алгоритм должен базироваться на методах, требующих для анализа небольшое количество тестируемого материала, обладающих высокой разрешающей способностью, чувствительностью, специфичностью, воспроизводимостью, и, кроме того, должен позволять легко сравнивать данные, полученные в разных лабораториях.
Цель данной работы – комплексное исследование клинических изолятов M. tuberculosis молекулярно-биологическими методами, широко использующимися в настоящее время для генетической идентификации возбудителя туберкулёза, и выявление закономерностей между данными, полученными при использовании этих методов.
Задачи исследования.
-
Изучение клинических изолятов M. tuberculosis методом сполиготипирования.
-
Изучение клинических изолятов M. tuberculosis методом RFLP-IS6110.
-
Изучение клинических изолятов M. tuberculosis методом MIRU-VNTR.
-
Определение принадлежности клинических изолятов M. tuberculosis к филогенетическим линиям на основании анализа точечных мутаций.
-
Изучение лекарственной устойчивости и мутаций, детерминирующих лекарственную устойчивость клинических изолятов M. tuberculosis, относящихся к разным геногруппам.
-
Анализ информативности разных методов генотипирования M. tuberculosis и выявление взаимосвязей между данными, полученными в результате их использования.
Научная новизна работы. Впервые проведён анализ клинических изолятов M. tuberculosis с помощью метода MIRU-VNTR, основанного на анализе 35 локусов. Впервые проведён анализ большой выборки клинических изолятов M. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ с использованием четырёх методов генотипирования – RFLP-IS6110, SNP, сполиготипирования и MIRU-VNTR. Впервые показано полное соответствие между геногруппами, выявленными на основании данных, полученных с помощью методов MIRU-VNTR и SNP-типирования.
Практическая значимость работы. Полученные данные о генотипических особенностях клинических изолятов M. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ, необходимы для разработки эффективной системы мониторинга возбудителя туберкулёза. Разработан алгоритм генотипирования штаммов M. tuberculosis, основанный на анализе точечных мутаций и результатов MIRU-VNTR, позволяющий выявлять источник и отслеживать пути распространения конкретных штаммов среди пациентов лечебных учреждений, в том числе штаммов, обладающих лекарственной устойчивостью. Кроме того, использование данного подхода делает возможным установление принадлежности штамма к индивидуальным филогенетическим группам, что позволяет отслеживать интродукцию штаммов из других регионов. Особенностью данного подхода является возможность быстрого сравнения и обработки данных, полученных в разных лабораториях.
Положения, выносимые на защиту.
1) Разработан вариант метода MIRU-VNTR, основанный на анализе 35 локусов в геноме туберкулезного микроба.
2) Разработан алгоритм генотипирования клинических изолятов M. tuberculosis, включающий анализ 35 локусов MIRU-VNTR и SNP-типирование, позволяющий проводить эффективную межштаммовую дифференциацию и определять принадлежность клинических изолятов к отдельным филогенетическим линиям.
3) Использование разработанного алгоритма позволяет выявлять филогенетические связи между штаммами, обладающими лекарственной устойчивостью.
Апробация работы. Результаты работы доложены на Научно-практической конференции молодых учёных и специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации «Биологическая безопасность в современном мире» (п. Оболенск 2009).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе три печатных работы в изданиях, рекомендованных ВАК Российской Федерации.
Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 179 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов, обсуждения, выводов, списка литературы и 9 приложений.
