Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 9
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 16
ТУБЕРКУЛЕЗНЫЕ ВАКЦИНЫ - 16 ПРИОРИТЕТНОЕ НАПРАВЛЕНИЕ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
ОСОБЕННОСТИ ИММУНИТЕТА ПРИ 20 ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ
ХАРАКТЕРИСТИКА БЕЛКОВ - КАНДИДАТОВ 31 ДЛЯ РАЗРАБОТКИ НОВЫХ ВАКЦИН
БЕЛКИ КОМПЛЕКСА AG8 5 31
БЕЛКИ СЕМЕЙСТВА ESAT-6 33
SOD И ДРУГИЕ БЕЛКИ 36
1.4. ОСНОВНЫЕ ФОРМЫ РАЗРАБАТЫВАЕМЫХ 38
ВАКЦИН
1.4.1. АТТЕНУИРОВАННЫЕ И 40
РЕКОМБИНАНТНЫЕ ВАКЦИНЫ
1.4.2. СУБЪЕДИНИЧНЫЕ, 45
КОНЪЮГИРОВАННЫЕ, ДНК-ВАКЦИНЫ
1.5. ОСОБЕННОСТИ ИММУНИТЕТА ПРИ 53
ВАКЦИНАЦИИ ТУЛЯРЕМИЙНОЙ ВАКЦИНОЙ
1.6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ 59
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 63
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 63
2.1. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ЖИВОТНЫЕ 63
2.2. ШТАММЫ МИКРООРГАНИЗМОВ И 63
КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ
ПЛАЗМИДЫ И ПРАЙМЕРЫ 63
СРЕДЫ И УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ 64
ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЕ МАНИПУЛЯЦИИ. 65
2.6. МЕТОДЫ БИОХИМИЧЕСКИХ 66
ИССЛЕДОВАНИЙ
2.6.1. МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ 67
РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ
2.6.2. ВЫДЕЛЕНИЕ СЕКРЕТИРУЕМЫХ 69
БЕЛКОВ МИКОБАКТЕРИЙ
2.6.3. ПРИГОТОВЛЕНИЕ СУММАРНОГО 70
АНТИГЕНА ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА
2.7. МЕТОДЫ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ 71
ИССЛЕДОВАНИЙ
2.7.1. ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ 71
2.7.2. ПОЛУЧЕНИЕ МЫШИНЫХ 71
АНТИСЫВОРОТОК К РЕКОМБИНАНТНЫМ
БЕЛКАМ
2.8. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ 72
СВОЙСТВ ШТАММОВ
2.8.1. РАЗМНОЖЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ 72
ШТАММОВ В КУЛЬТУРАХ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК
2.8.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНОЙ 73
ВИРУЛЕНТНОСТИ РЕКОМБИНАНТНЫХ
ШТАММОВ F. TULARENSIS
2.8.3. ДИССЕМИНАЦИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ 73
ШТАММОВ F. TULARENSIS В ОРГАНИЗМЕ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ
2.8.4. ОЦЕНКА СТАБИЛЬНОСТИ 73
НАСЛЕДОВАНИЯ ПЛАЗМИД
РЕКОМБИНАНТНЫМИ ШТАММАМИ
F. TULARENSIS IN VIVO
2.8.5. ОЦЕНКА УРОВНЯ АНТИТЕЛ К 74
РЕКОМБИНАНТНЫМ БЕЛКАМ В СЫВОРОТКАХ
ИММУНИЗИРОВАННЫХ МЫШЕЙ
2.8.6. РЕАКЦИЯ БЛАСТТРАНСФОРМАДИИ 74
СПЛЕНОЦИТОВ ИММУНИЗИРОВАННЫХ
МЫШЕЙ
2.8.7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УРОВНЯ СИНТЕЗА IFN-y 75
СПЛЕНОЦИТАМИ ИММУНИЗИРОВАННЫХ
МЫШЕЙ
2.8.8. ОЦЕНКА ПРОТЕКТИВНОСТИ 76
РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ F. TULARENSIS
НА МЫШИНОЙ МОДЕЛИ АЭРОЗОЛЬНОГО
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ТУБЕРКУЛЕЗА
2.9. МЕТОДЫ СТАТИСТИЧЕСКОЙ ОБРАБОТКИ 77
РЕЗУЛЬТАТОВ
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 78
ГЛАВА 3. КОНСТРУИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ 78
ПЛАЗМИД ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКОВ AG85B И ESAT-6 В КЛЕТКАХ Е. COLI
СОЗДАНИЕ РЕКОМБИНАНТНОЙ 78 ПЛАЗМИДЫ рЕТ-85В И ЭКСПРЕССИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА Ag85B-(HIS)6
СОЗДАНИЕ РЕКОМБИНАНТНОЙ 79
ПЛАЗМИДЫ pET24-ES И ЭКСПРЕССИЯ
РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ESAT-6 (HIS)6
ГЛАВА 4. ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И ХАРАКТЕРИСТИКА 81
РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ Ag85B-(HIS)6 И ESAT-6-(HIS)6, ЭКСПРЕССИРУЕМЫХ КЛЕТКАМИ Е. COLI
ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И ХАРАКТЕРИСТИКА 81 РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА AG85B-(HIS)6
ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И ХАРАКТЕРИСТИКА 82 РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ESAT-6-(HIS)6
ПОЛУЧЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ К 84 РЕКОМБРШАНТНЫМ БЕЛКАМ AG85B-(HIS)6 И ESAT-6-(HIS)6 И ИХ ХАРАКТЕРИСТИКА
4.4. ОБСУЖДЕНИЕ 90
ГЛАВА 5. КОНСТРУИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ 93
ПЛАЗМИД И ЭКСПРЕСИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ FL-AG85B И FL-AG85B-ESAT-6 В КЛЕТКАХ F. TULARENSIS
5.1. КОНСТРУИРОВАНИЕ ПЛАЗМИДНОГО 93
ВЕКТОРА РРМС1
КОНСТРУИРОВАНИЕ ГЕНА СЛИТНОГО БЕЛКА 95 FL-AG85B
КОНСТРУИРОВАНИЕ ГЕНА СЛИТНОГО БЕЛКА 96 FL-85B-ESAT-6
5.4. ЭКСПРЕССИЯ СЛИТНЫХ БЕЛКОВ FL-85B И 97
FL-85B-ESAT-6 В КЛЕТКАХ F. TULARENSIS
ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКА FL-AG85B 97
ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКА FL-AG85B-ESAT-6 100
5.5. ОБСУЖДЕНИЕ 102
ГЛАВА 6. ХАРАКТЕРИСТИКА 105
ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ F. TULARENSIS RVP17 И RVP18, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ БЕЛКИ FL-AG85B И FL-AG85B-ESAT-6
6.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ 105
РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИГЕНОВ ШТАММАМИ
F. TULARENSIS RVP17 И RVP18
6.2. ОЦЕНКА СТАБИЛЬНОСТИ ЭКСПРЕССИИ 106
РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ ШТАММАМИ
F. TULARENSIS IN VIVO
6.3. ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ 108
СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ
РАЗМНОЖЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ 108 ШТАММОВ В КЛЕТКАХ ЛИНИИ J774.A1
РАЗМНОЖЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ 109 ШТАММОВ В ОРГАНИЗМЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ
6.4. ХАРАКТЕРИСТИКА ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ 111
СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ
6.4.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УРОВНЯ АКТИВАЦИИ 111
ГУМОРАЛЬНОГО ЗВЕНА ИММУНИТЕТА ПРИ
ИММУНИЗАЦИИ РЕКОМБИНАНТНЫМИ
ШТАММАМИ F. TULARENSIS
6.4.2.0ПРЕДЕЛЕНИЕ УРОВНЯ АКТИВАЦИИ 112
КЛЕТОЧНОГО ЗВЕНА ИММУНИТЕТА
6.5.ОБСУЖДЕНИЕ 117
ГЛАВА 7. ОЦЕНКА ПРОТЕКТИВНОСТИ 121
РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ F. TULARENSIS
7.1. ОЦЕНКА ПРОТЕКТИВНОСТИ 121
РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ
F. TULARENSIS RVP17 И RVP18 НА МЫШИНОЙ
МОДЕЛИ АЭРОЗОЛЬНОГО
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ТУБЕРКУЛЕЗА
7.2. ОБСУЖДЕНИЕ 124
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 125
ВЫВОДЫ 129
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 130
ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ,
ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ
БСА - бычий сывороточный альбумин
ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа
КОЕ - колониеобразующая единица (colony forming unit)
ПААГ - полиакриламидный гель
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат
CDC - Centers for Disease Control and Prevention, Центр контроля и
предотвращения заболеваний, США
DMEM - среда Игла в модификации Дульбекко
Ds-Na - до деци л сульфат натрия
НВНА - гепарин-связывающий гемагглютинин М. tuberculosis
IFN-y - интерферон-гамма ( interferon-y)
IL - интерлейкин
KatG - мультифункциональная каталаза пероксидаза М. tuberculosis
МНС - главный комплекс гистосовместимости
PMSF - ингибитор протеаз фенилметилсульфинилфторид
PPD - очищенный белковый дериват (p_urified protein derivative)
SPF - свободные от специфических патогенов (specific-pathogen-free)
TNF - фактор неркоза опухоли (tumor necrosis factor)
TLR - семейство толл-подобных рецепторов (toll-like receptor)
FL - лидерная последовательность FopA белка F. tularensis
ОП — оптическая плотность раствора
RPMI-1640 - Roswell Park Memorial Institute (среда для культивирования человеческих клеток и клеточных линий)
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ
Повышенное внимание к проблеме туберкулеза в последние годы обусловлено увеличением заболеваемости этой инфекцией не только в развивающихся странах, но и в благополучных государствах. При условии сохранения современных тенденций социально-экономических условий жизни и организации противотуберкулезной помощи населению в России прогнозируется продолжение ухудшения эпидемической обстановки и увеличение заболеваемости к 2010 г. более чем в 2 раза (Шилова, 2001).
Для специфической профилактики туберкулеза в России и за рубежом используются препараты единственной живой вакцины BCG, приготовленной на основе аттенуированного штамма Mycobacterium bovis (Митинская, 2001). Эффективность вакцинации препаратами BCG варьирует от 0 % до 80 % и в среднем составляет 50% (Colditz et al, 1994; Roche et al, 1995). Создание новой улучшенной туберкулезной вакцины становится приоритетом национальных исследований (Castro, 1998). Работы последних лет позволили определить последовательность генома Mycobacterium tuberculosis, а также определить детерминанты протективного иммунитета (Horwitz et al, 1995; Kariyone et ai, 1999). Использование технологии рекомбинантных ДНК, синтетических пептидов, антиген-специфических антител, Т-клеток и т.д. позволило идентифицировать несколько основных антигенов М. tuberculosis, таких, как белки теплового шока hsp 60 и hsp 70 (Huygen, 2003; Карягина и др., 2004), белки комплекса Ag85 (Wiker, Harboe, 1992), ESAT-6 (Sorensen et al, 1995), CFP-10 (Skjot et al, 2000) и др. Экспрессия этих белков в гетерологичных векторах и их иммунологическая оценка обеспечила бы возможность идентификации антигенов М. tuberculosis, наиболее важных для разработки новых вакцин и специфических диагностических препаратов.
Поскольку активация клеточного иммунитета является основой для формирования противотуберкулезного иммунитета (Cooper, Flynn, 1995; Воробьев, Медуницын, 1995; Ярилин, 1999; Lazarevic, Flynn, 2002; Flynn, 2004), соответствующим образом подобранные адьюванты и системы доставки антигенов способствовали бы решению проблем, связанных с недостатками, присущими вакцине BCG. Одним из наиболее перспективных подходов является генетическое конструирование вакцин для защиты от нескольких инфекций одновременно на основе штаммов, полученных путем встраивания в их геном чужеродных антигенов, важных для активации клеточного иммунитета. В качестве вакцинных векторов используют живые аттенуированные штаммы М. tuberculosis (Ellner, 1998; Senaratne etal, 2007; Henao-Tamayo etal., 2007) и сальмонелл (Mollenkopf etal, 2001), а также близкородственные микобактерии (Abou-Zeid et ah, 1997), ряд вирусов (Malin etal., 2000; McShane et ah, 2005; Fattorini, 2007) и некоторые другие микроорганизмы (Miki et al, 2004).
Известно, что живая туляремийная вакцина, созданная на основе
штамма Francisella hilar-ensis 15/10, способна вызывать интенсивную
перестройку гуморального и клеточного звеньев иммунной системы,
обеспечивая создание длительного напряженного иммунитета при умеренной
реактогенности вакцины (Олсуфьев и др., 1975). Кроме специфического
иммунитета, этот штамм индуцирует кратковременную неспецифическую
защиту против других внутриклеточных патогенов, таких как листерии и
легионеллы (Belyi etal, 1996). Важно отметить, что клетки вакцинного
штамма туляремийного микроба способны размножаться в организме
экспериментального животного, иммунизированного живой вакциной BCG,
что дает принципиальную возможность повысить иммунный ответ на
экспрессируемые протективные антигены М. tuberculosis.
Вышеперечисленные характеристики штамма F. tularensis 15/10 позволяют
считать оптимальным использование его в качестве бактериального вектора для конструирования живых противотуберкулезных вакцин.
Вопрос о выборе антигенов для конструирования противотуберкулезной вакцины достаточно сложен. Уже изучены иммунологические свойства широкого спектра белков М. tuberculosis. Одним из наиболее иммуногенных белков является секретируемый активно размножающимися микобактериями белок Ag85B - белок трехкомпонентного комплекса Ag85 (Kariyone et ah, 1999). Белки этого комплекса являются ферментами миколил-трансферазами, играющими существенную роль в процессе синтеза клеточной стенки бактерии, однако функция комплекса и его роль в патогенезе туберкулеза до конца не выяснены. Другой белок - ESAT-6, секретируемый М. tuberculosis на ранней стадии роста (Sorensen et ah, 1995), представляет собой важный Т-клеточный антиген, распознаваемый протективными Т-клетками на моделях экспериментального туберкулеза. Данные антигены были выбраны в качестве модельных антигенов для изучения возможности их экспрессии в клетках F. tularensis 15/10 и изучения перспектив использования туляремийной вакцины в качестве бактериального вектора для создания вакцинных штаммов для профилактики туберкулеза.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ:
Конструирование вакцинных штаммов Francisella tularensis с
экспрессией протективных антигенов Ag85B и ESAT-6
Mycobacterium tuberculosis и изучение их иммунобиологических свойств.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:
Создание штаммов Е. coli, экспрессирующих рекомбинантные белки Ag85B-(His)6 и ESAT-6-(His)6.
Выделение и очистка антигенов Ag85B-(His)6 и ESAT-6-(His)6 из рекомбинантных штаммов Е. coli, получение антисывороток к рекомбинантным белкам и оценка их иммунологической специфичности.
Создание на основе вакцинного штамма F. tularensis 15/10 рекомбинантных штаммов RVpl7 и RVpl8, кодирующих гены слитных белков FL-Ag85B и FL -Ag85B-ESAT-6, и определение уровня их экспрессии.
Оценка стабильности рекомбинантных штаммов F. tularensis RVгр17 и RVp 18 in vivo.
Оценка уровня активации гуморального и клеточного звеньев иммунитета мышей, иммунизированных штаммами F, tularensis RVp 17 и RVp 18.
Изучение протективности полученных штаммов F. tularensis RVp 17 и RVp 18 на модели легочной формы экспериментальной туберкулезной инфекции мышей.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА
Получены впервые вакцинные штаммы F tularensis 15/10, экспрессирующие протективные микобактериальные антигены Ag85B и ESAT-6.
Впервые охарактеризован иммунный ответ у мышей, иммунизированных вакцинными штаммами F. tularensis 15/10, экспрессирующими антигены Ag85B и Ag85B-ESAT-6.
Впервые показана протективность сконструированных
рекомбинантных штаммов F. tularensis 15/10, экспрессирующих антигены микобактерий Ag85B и Ag85B-ESAT-6, на модели легочной формы экспериментальной туберкулезной инфекции мышей.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
Создана модельная система для изучения вакцинных свойств протективных антигенов с использованием в качестве живого бактериального вектора вакцинного штамма F. tularensis 15/10,
Созданные рекомбинантные штаммы на основе вакцинного штамма F. tularensis 15/10, экспрессирующие протективные антигены микобактерий,
дают возможность получить новую информацию, необходимую для создания живых противотуберкулезных рекомбинантных вакцин.
Микобактериальные рекомбинантные антигены Ag85B-(His)6 и ESAT6-(His)6, экспрессируемые бактериальными клетками Е. coli, и полученные к ним специфические антитела могут быть использованы для совершенствования систем диагностики туберкулеза.
ВНЕДРЕНИЕ
В коллекции живых культур ФГУН "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии" депонированы два авторских штамма Е. coli, использованные для получения рекомбинантных микобактериальных белков Ag85B-(His)6 и ESAT6-(His)6, и два авторских штамма F. tularensis RVpl7 и F. hilarensis RVpl8, использованные для изучения перспективности использования туляремийной вакцины в качестве бактериального вектора при создании живых противотуберкулезных вакцин (федеральный уровень внедрения).
Материалы диссертации используются в лекциях для магистрантов факультета биологической и экологической безопасности Путинского государственного университета.
Депонированы в GenBank нуклеотидные последовательности двух генов, кодирующих слитные белки FL-Ag85B и FL-Ag85B-ESAT6, которые экспрессируются вакцинными штаммами F. tularensis RVp 17 и F. tularensis RVp 18 [].
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
Антитела к рекомбинантным белкам Ag85B-(His)6 и ESAT-6-(His)6 распознают иммунологические эпитопы в природных микобактериальных белках Ag85B и ESAT-6.
Созданы рекомбинантные готазмиды для эффективной экспрессии микобактериальных протективных антигенов Ag85B и ESAT-6 в клетках туляремийного микроба.
Иммунизация мышей вакцинными штаммами F. tularensis RVpl7 и RVpl8, экспрессирующими микобактериальные белки Ag85B и ESAT-6, приводит к индукции специфического клеточного иммунного ответа как к туляремийным, так и к микобактериальным антигенам. Штаммы F. tularensis RVpl7 и RVpl8 защищают мышей от легочной формы экспериментальной туберкулезной инфекции с эффективностью, сопоставимой с эффективностью вакцины BCG.
Вакцинные штаммы F. tularensis RVpl7 и RVpl8 можно рассматривать в качестве прототипов для создания живой противотуберкулезной вакцины РАБОТА ВЫПОЛНЕНА в отделе ООН ГНЦ ПМБ по планам НИР в рамках следующих бюджетных тем: "Изучение молекулярных основ патогенности возбудителей особо опасных и социально значимых инфекций" (2003 г.)(руководитель темы д.м.н. Анисимов А.П); "Разработка новых бактериальных векторов на основе вакцинных или аттенуированных штаммов F. tularensis для конструирования живых вакцин» (2004 г.)(руководитель темы к.ф.-.м.н. Павлов В.М.) Данная работа получила финансовую поддержку Международного научно-технического центра (проект МНТЦ #2237(2002-2005г.г., научный руководитель проекта к.ф-.м.н. Павлов В.М.), а также проекта ВТЕР#7. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.
Апробация диссертации состоялась на заседании межлабораторного семинара ФГУН ГНЦ ПМБ 2 апреля 2008 г. Материалы диссертации доложены и представлены на 6 научных конференциях: 4 Intern Conference onTularemia, City of Bath,UK, 2003; 1st Internatiomal Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology (BioMicroWorld-2005), Badajoz (Spain), March 15-18, 2005; 3-й Московский международный конгресс
«Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2005 г.; VII-й Межгосударственная научно-практическая конференция государств-участников СНГ (3-5 октября 2006 г., Оболенск, Московская обл.; NIAID Research Conference (Opatia, Croatia, June 24-30, 2006); 5th International Conference on Tularemia Marine Biological Labs, Woods Hole, MA, USA, November 1-4, 2006.
ПУБЛИКАЦИИ. Материалы диссертации опубликованы в 7 научных работах
СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований, обсуждение результатов, выводы и указатель литературы, включающий 29 работ отечественных и 248 - зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 21 рисунком и 4 таблицами.
Похожие диссертации на Конструирование вакцинных штаммов Francisella tularensis, экспрессирующих протективные антигены Ag85B и ESAT-6 Mycobacterium tuberculosis, и изучение их иммунобиологических свойств
