Введение к работе
Актуальность проблемы. Внедрение патогенных и условно-патогенных микроорганизмов в организм хозяина распознается системой врожденного иммунитета посредством набора генетически детерминированных, так называемых паттернраспозпающих рецепторов (ПРР), которые имеют высокий аффинитет к консервативным микробным молекулярным фрагментам, характерным для широкого спектра микроорганизмов (пептидогликаиу, липополисахариду, липотейхоевым кислотам, липопротсипам, липопептидам, пептидогликанам, флагеллину, вирусной РНК, бактериальной ДНК, богатой CpolyG-послсдователыюстями, белкам теплового шока, порипам, |3-глюкапу, мапиаиу и др.) и получившим название патогеп-ассоциироваппые молекулярные компоненты (PAMPs - pathogen-associated molecular patterns) [Симбирцев A.C., 2005; Takeda К., Akira S, 2003; Uematsu S., Akira S, 2006].
ПРР представляют собой группу различных по строению и происхождению молекул, обладающих способностью взаимодействовать с PAMPs с целью их прямой нейтрализации или запуска каскада провоспалительпых реакций, направленных в конечном счете па блокирование жизнедеятельности, дезинтеграцию и удаление патогена из организма [Ehlers S.,Bulfone-PausS.,2004].
Показано, что ключевую роль в распознавании бактериальных и вирусных патогенов играют Toll-подобные рецепторы (Toll-like receptors, TLRs), локализующиеся на различных иммунокомпстеитных клетках и обеспечивающие проведение внутриклеточного активационпого сигнала. Эволюционная стабильность Toll-подобных рецепторов не уступает их микробным лигаидам [Байракова А.Л. и др., 2008; Halhnan М. et al., 2001].
В настоящее время идентифицировано 13 Toll-подобных рецепторов.
Каждый из TLRs имеет присущий ему сигнальный путь, активация которого
индуцирует созревание дендритных клеток, преобразование
рекогносцировочного сигнала в растворимые медиаторы (цитокины, хемокипы) и последующее взаимодействие их с цитокип/хемокиновыми рецепторами на Т-и В-лимфоидпых клетках, развитие адаптивного иммунитета [Хаитов P.M. и др., 2008; Alexopoulou L. et al., 2002; Homung V. et al., 2002; Netea M.G. et al., 2004; Tsan M.F., Gao В., 2004; Gorden K.B. et al., 2005; Herbst-Kralovetz M.M., Pyles R.B., 2006; Paul-Clark M.J et al., 2006].
Toll-подобные рецепторы экспрессированы конститутивно на моноцитах/макрофагах, пейтрофильных гранулоцитах, дендритных клетках, различных популяциях лимфоцитов, эндотелиальных клетках, клетках эпителия кишечника, респираторного и урогеииталыюго тракта [Becker M.N. et al., 2000; Wong X. et al, 2002; Guillot L. et al, 2004; Sha Q. et al, 2004; Xu D. et al, 2004].
В условиях введения синтетических лигапдов для конкретных TLRs показано их важное значение в формировании песпецифической резистентности к представителями рода Listeria, Francisella, М. tuberculosis, возбудителям лейшмаииоза и малярии, установлена ключевая роль TLR4 в развитии лептосиирозной инфекции и бруцеллеза [Campos М.С. et al., 2004; Katz J. et al., 2006; Viriyakosol S. et al., 2006].
Имеются единичные сообщения о важной роли TLR4 в патогенезе чумной инфекции и развитии резистентности к чуме [Montminy S.W. et al., 2006; Airhart C.L. et al., 2008], а также возможной роли TLR2 в опосредованной антигенами rLcrV и YopB Y. pestis ингибиции функции макрофагов [Sharma R.K. et al., 2004].
Мало изучено в условиях in vivo влияние клеток Y. pestis, F. tularensis и их антигенов на экспрессию иРНК TLR2 и TLR4 клетками врожденного и адаптивного иммунитета экспериментальных биомоделей и людей. Отсутствуют сведения о сравнительном анализе экспрессии иРНК TLR2, TLR4 и экспрессии генов цитокинов Thl(IFN-y) и Т1т2 (1Ь-4)-зависимого ответа у биомоделей в ответ на введение вакцинных штаммов Y. pestis, F. tularensis, антигенов чумного и туляремийного микробов. Отсутствуют также сведения о влиянии вакцинации коммерческими живыми чумной, туляремийной вакцинами на экспрессию TLR2 и TLR4 и продукцию цитокинов ТЫ (IFN-y) и Th2 (1Ь-4)-зависимого ответа клетками врожденного и адаптивного иммунитета у людей.
Цель исследования -изучить влияние чумного, туляремийного микробов и их антигенов на экспрессию иРНК TLR2, TLR4 клетками врожденного и адаптивного иммунитета экспериментальных биомоделей и людей.
Основные задачи исследования
1. Оценить иммунобиологическую активность (токсичность,
иммуногеиность, протективность) препаратов капсульного антигена чумного
микроба, выделенного из рекомбинантпого штамма Y. pestis КМ 277,
вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, протективного антигенного
комплекса (ПАК) туляремийного микроба различных подвидов.
-
Изучить влияние вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, рекомбинантпого штамма Y. pestis КМ 277, химической чумной вакцины, препаратов капсульного антигена чумного микроба, выделенных из указанных штаммов, на экспрессию паттерираспозиающих Toll-подобных рецепторов 2 и 4 типов клетками врожденного и адаптивного иммунитета биомоделей.
-
Провести исследование экспрессии генов цитокинов ТЫ (IFN-y) и Th2 (1Ь-4)-зависимого ответа у биомоделей при введении вакцинного штамма Y.
pestis EV НИИЭГ, рскомбшіаптпого штамма Y. pestis KM 277, химической чумной вакцины, препаратов капсульного антигена чумного микроба, выделенных изданных штаммов.
-
Исследовать индуцированную вакцинным штаммом F. tularensis 15 НИИЭГ экспрессию генов паттсрираспозпающих Toll-подобных рецепторов 2 и 4 типов, цитокипов (IFN-y, IL-4) у экспериментальных биомоделей.
-
Сравнить уровень экспрессии иРНК TLR2 и TLR4, цитокипов (IFN-y, IL-4) у биомодслей, индуцируемой протсктивпым антигенным комплексом (ПАК)туляремийного микроба различных подвидов.
6. Изучить влияние вакцинации против чумы и туляремии на экспрессию
иРНК TLR2, TLR4 и продукцию цитокипов клетками врожденного и
адаптивного иммунитета у людей. Оцепить возможность применения
полученных результатов в качестве показателя эффективности вакцинации
против чумы и туляремии.
Научная новизна. Получены новые сведения о характере влияния рекомбинаптпого штамма Y. pestis КМ 277 - продуцента капсульного антигена чумного микроба Ф1, выделенного из него препарата капсульного антигена ФІ, экспериментальной химической чумной вакцины, препаратов протективпого антигенного комплекса туляремийного микроба различных подвидов па экспрессию in vivo и PI IК Toll-подобных рецепторов 2 и 4 типов. Показано, что рекомбинаптпый штамм Y. pestis КМ 277, выделенный из него препарат капсульного антигена Ф1, химическая чумная вакцина индуцируют повышение экспрессии иРНК TLR2 уже в первые часы после введения в организм экспериментальных животных с последующим усилением пролиферативпой активности в центральном (тимусе) и периферическом (селезенке) органах иммунной системы и формированием напряженного протективпого иммунитета.
Установлено, что введение препарата протективпого антигенного комплекса из вакцинного штамма F.tularensis 15 НИИЭГ голарктического подвида уже через 4 ч вызывает повышение экспрессии спленоцитами как TLR2, так и TLR4. Препараты протективпого антигенного комплекса, полученные из вирулентного штамма голарктического {F.tularensis 503/840) и среднеазиатского (F. tularensis А179) подвидов, индуцируют усиление экспрессии только TLR2. Препарат протективпого антигенного комплекса из штамма F.tularensis В399 A'Colc неарктического подвида, не вызывает изменений экспрессии исследуемых типов Toll-подобных рецепторов.
Впервые проведен сравнительный анализ экспрессии TLR2, TLR4 и экспрессии генов цитокипов Thl(IFN-y) и Th2 (1Ь-4)-зависимого ответа у биомодслей, индуцируемой вакцинным штаммом Y. pestis EV НИИЭГ,
рекомбинаитным штаммом Y. pestis KM 277, химической чумной вакциной, капсульиым антигеном чумного микроба, выделенным из Y. pestis КМ 277 и Y. pestis EV НИИЭГ, вакцинным штаммом F. tularensis 15 НИИЭГ, протективным антигенным комплексом туляремийного микроба различных подвидов. Получены новые данные, свидетельствующие о преимущественной экспрессии клетками врожденного и адаптивного иммунитета иРНК TLR2 и IFN-y в условиях in vivo.
Впервые проведено сравнительное изучение влияния вакцинации против чумы и туляремии на экспрессию иРНК TLR2, TLR4 и продукцию цитокииов клетками врожденного и адаптивного иммунитета у людей, оценена возможность применения полученных данных для разработки критериев оценки уровня противочумного иммунитета у людей.
Установлено, что вакцинация людей против чумы и туляремии отечественными живыми вакцинами вызывает различные изменения уровня экспрессии и РНК TLR2 и TLR4 в лейкоцитах периферической крови. Если в гранулоцитах через 3 месяца после вакцинации против чумы и туляремии транскрипционная активность генов TLR2 и TLR4 не была существенно изменена, то в моионуклеарных клетках введение живой чумной вакцины в противоположность живой туляремийпой вакцине приводило к исчезновению детектируемого уровня экспрессии иРНК TLR4, не влияя на уровень синтезируемой иРНК TLR2. Сочетанная вакцинация против чумы и туляремии индуцировала экспрессию иРНК TLR2 и TLR4 как гранулоцитами, так и мононуклеарными клетками вакцинированных доноров.
Выявленные отличия в экспрессии иРНК TLR4 мононуклеарными клетками, активация которого важна для формирования полноценного адаптивного иммунитета, могут быть одной из причин формирования различного по продолжительности поствакципалыюго иммунитета при чуме и туляремии.
На основании полученных новых данных об однотипности митоген- и антигениндуцированпой продукции IFN-y как в смешанной популяции лимфоцитов, так и в культуре клеток крови у вакцинированных против чумы людей, предложено использование параметров индуцированной Т-клеточным митогеном копканавалином А (лигандом TLR2) продукции маркерного цитокина IFN-y в качестве критерия оценки уровня противочумного иммунитета у людей.
Практическая значимость. Результаты исследований были использованы при разработке методических рекомендаций «Определение экспрессии генов Толл-подобных рецепторов 2 и 4 клетками врожденного и адаптивного иммунитета у людей и экспериментальных животных», которые
одобрены Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол №7 от 16.12.2010г), утверждены директором института и используются в практической деятельности отдела иммунологии, лаборатории прикладной генетики РосНИПЧИ «Микроб». Материалы исследования используются при чтении лекций на курсах первичной специализации по специальностям «Бактериология» и «Эпидемиология» с основами безопасной работы с патогенными биологическими агентами 1 - II групп при ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб».
Основные положения, выносимые па защиту
-
Рскомбипаптиый штамм Y. pestis КМ 277 - продуцент капсульного антигена чумного микроба Ф1, выделенный из него капсульный антиген Ф1, а также химическая чумная вакцина индуцируют повышение экспрессии иРНК TLR2 в первые часы после введения в организм экспериментальных животных с последующим усилением пролиферативиой активности в центральном (тимусе) и периферическом (селезенке) органах иммунной системы и формированием напряженного протективного иммунитета.
-
Протсктивный антигенный комплекс, полученный из вакцинного штамма голарктического подвида F. tularensis 15 НИИЭГ, вызывает повышение экспрессии клетками адаптивного (спленоцитами) иммунитета как TLR2, так и TLR4, в отличие от препаратов протективного антигенного комплекса, полученных из вирулентного штамма F.tularensis 503/840 голарктического подвида и штамма F. tularensis А179 среднеазиатского подвида, которые индуцируют повышение экспрессии только TLR2. Препарат протективного антигенного комплекса, полученный из штамма F.tularensis В399 A'Colc псарктического подвида, не вызывает изменений экспрессии исследуемых типов Toll-подобных рецепторов.
3. Препараты капсульного антигена, выделенного из рекомбинантного
штамма Y. pestis КМ 277, вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, препараты
протективного антигенного комплекса туляремийиого микроба различных
подвидов защищают экспериментальных животных (аутбредных мышей) от
гибели в условиях моделирования чумной и туляремийпой инфекции, в дозе
100 мкг не оказывают токсического действия и не вызывают по данным
проточно-цитофлуориметрического мониторинга повреждения
иммупокомпетептпых клеток по типу апоптоза.
Протективная активность капсульного антигена, выделенного из рекомбинантного штамма Y. pestis КМ 277, в 3 раза выше по сравнению с препаратами капсульного антигена, выделенного из вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ.
4. Вакцинация людей против чумы и туляремии живыми вакцинами
вызывает различные изменения уровня экспрессии иРНК TLR2 и TLR4 в
лейкоцитах периферической крови. Введение живой чумной вакцины в
противоположность живой туляремийной вакцине приводит к исчезновению в
мононуклеарных клетках привитых детектируемого уровня экспрессии иРНК
TLR4, не влияя на уровень синтезируемой иРНК TLR2. Сочетапная вакцинация
против чумы и туляремии индуцирует экспрессию иРНК TLR2 и TLR4.
5. Сравнительная оценка спонтанной, митоген- и аитиген-
индуцировапной продукции IFN-y и IL-4 в культуре клеток крови людей,
вакцинированных живой чумной вакциной, живой туляремийной вакциной
указывает на преимущественное развитие Thl-зависимого иммунного ответа.
Параметры индуцированной лигапдом TLR2 Т-клеточным митогеном
конкаиавалином А продукции маркерного цитокина IFN-y предложены в
качестве критерия оценки уровня противочумного иммунитета у людей.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены и представлены на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2008); IX Межгосударственной научно-практическая конференции государств -участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями па территории государств - участников содружества независимых государств» (Волгоград, 2008); Международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями» (Санкт-Петербург, 2010); научно-практических конференциях РосНИПЧИ «Микроб» «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов, 2009-2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, из них статей в рекомендованных ВАК изданиях -4.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 85 отечественных и 195 зарубежных источников. Объем диссертации составляет 177 страниц машинописного текста. Работа иллюстрирована 25 рисунками и 18 таблицами.
![Влияние способа введения холерного вибриона и его токсина на формирование и цитокиновую регуляцию местного иммунитета [Электронный ресурс]](/i/i/4438/203060.png "Влияние способа введения холерного вибриона и его токсина на формирование и цитокиновую регуляцию местного иммунитета [Электронный ресурс] Омельченко Наталья Дмитриевна")
