Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Иммобилизованные клетки микроорганизмов 9
1.1. Основные области применения иммобилизованных микробных систем 9
1.2. Методы тшобилизации микробных клеток 12
1.2.1. Адсорбция 13
1.2.2. Ковалентное связывание 15
1.2.3. Поперечное сшивание 16
1.2.4. Микроинкапсуляция 18
1.2.5. Включение в гели 19
1.3. Влияние факторов иммобилизации в ПААГ на жизнеспо собность и ферментативную активность микроорганизмов 30
1.3.1. Действие компонентов шлимеризационной смеси для образования ПААГ на микробные клетки 30
1.3.2. Действие акриламида на живые организмы 33
1.3.3. Влияние температурных условий иммобилизации в ШАГ на ферментативную активность и жизнеспособность микроорганизмов 35
1.4. "Постиммобилизационные" факторы, влияющие на сохранение жизнеспособности и ферментативной активности ИКМ 37
ГЛАВА 2 . Методы определения жизнеспособности мшсроорганизмов 44
2.1. Методы количественного определения жизнеспособности микробных клеток 44
2.2. Определение содержания живых клеток в иммобилизованных микробных популяциях
ГЛАВА 3. Материалы и методы 55
3.1. Микроорганизмы и условия их культивирования . 55
3.2. Иммобилизация клеток ; 56
3.3. Определение содержания живых клеток 57
3.4. Фотометрический анализ микробных суспензий . 60
3.5. Фотометрический анализ содержания нуклеиновых кислот и белка в бактериальных клетках 61
3.6. Электронномикроскопические методы исследования 62
ГЛАВА 4 . Влияние факторов иммобилизации в ПААГ на выжи ваемость ИКМ 65
4.1. Влияние повышенной температуры на выживаемость ИКМ. 65
4.2. Действие исходных компонентов ПААГ на жизнеспособность клеток E.coli 68
4.3. Влияние рН полимеризационной смеси на жизнеспособность клеток E.coli 73
4.4. Влияние деформационных изменений полимерной решетки при образовании геля на выживаемость клеток E.coli в процессе иммобилизации 74
4.5. Влияние частиц ПААГ на жизнеспособность клеток E.coli 76
ГЛАВА 5 , Цитофизиологическое изучение действия мономерного акриламида на клетки E.coli . 82
5.1. Влияние акриламида на рост бактерий 82
5.1.1. Светомикроскопическое исследование 82
5.1.2. Ультраструктурные изменения 85
5.1.3. Влияние акриламида на осмотическую стабильность бактериальных клеток 87
5,1.4, Влияние акриламида на синтез нуклеиновых кислот 90 5.2. Воздействие акриламида на бактерии E.coli в условиях, приближенных к условиям иммобилизации в ПААГ. 91
5.2.1, Электронномикроскопическое исследование 93
5.2.2. Влияние ионов Mg на выживаемость клеток E.coli после обработки акриламидом 94
5.2.3. Влияние акриламида на проницаемость оболочки клеток E.coli 102
ГЛАВА 6 . Пути повышения выживаемости ИКМ в процессе их иммобилизации в ПААГ 109
6.1. Оптимизация температурного режима процесса иммобилизации 109
6.2. Снижение концентрации мономерного акриламида как подход к повышению жизнеспособности ИКМ в ПААГ НО
6.3. Ослабление действия на клетки свободных радикалов, образующихся в процессе полимеризации акриламида III
6.4. Искусственное регулирование рН полимеризационной среды 121
ГЛАВА 7. Выделение клонов клеток E.coli и P.putida с повышенной устойчивостью к процессу иммобилизации в ПААГ 124
ГЛАВА 8. Влияние питательного субстрата и режима его введения в иммобилизованную микробную систему на жизне способность ИКМ 131
ГЛАВА 9 . Практическое црименение некоторых закономерностей действия акриламида и процесса иммобилизации в ПААГ на бактериальные клетки 143
9.1. Прогнозирование выживаемости бактерий, включаемых в ПААГ 143
9.2. "Акриламидный" тест для прямого микроскопического распознавания и количественного определения содержа ния жизнеспособных и мертвых клеток в популяциях грам-отрицательных бактерий 146
Заключение 150
Выводы 161
Цитированная литература 163
- Основные области применения иммобилизованных микробных систем
- Влияние факторов иммобилизации в ПААГ на жизнеспо собность и ферментативную активность микроорганизмов
- Методы количественного определения жизнеспособности микробных клеток
- Определение содержания живых клеток
Введение к работе
Актуальность проблемы. За последние 10-15 лет резко повысился интерес исследователей к проблеме искусственной иммобилизации клеток. В настоящее время иммобилизованные клетки микроорганизмов (ИКМ) успешно используются для проведения самых разнообразных биотехнологических процессов. Все эти процессы можно разделить на две большие группы: I) простые одноферментные, в проведении которых участвует единственный фермент клетки и 2) полиферментные, или многостадийные, требующие функционирования клетки как полиферментной системы. В самые последние годы особенно интенсивно исследуются иммобилизованные микробные системы, осуществляющие процессы второй группы. Эффективность работы таких систем определяется прежде всего структурной и физиологической интактностью ИКМ, интегральной характеристикой которой является их жизнеспособность Поэтому без знания условий сохранения жизнеспособности ИКМ и без ее адекватного контроля нельзя в полной мере решить важную проблему создания высокоактивных и стабильных полиферментных систем пролонгированного действия.
Состояние вопроса, цель и задачи исследования. Еще в 1975 году Скрябин в одном из первых обзоров, посвященных иммобилизованным клеткам, отмечал: "Вопрос о жизнеспособности иммобилизованных клеток безусловно очень важен, так как от его решения в значительной мере будет зависеть и выбор способа иммобилизации, и ферментативная активность микроорганизмов" (skryabin, 1975) Однако до сих пор изучению жизнеспособности ИКМ как необходимого условия их функционирования в качестве биокатализаторов уделяется недостаточное внимание. В связи с этим основной целью нашего исследования было количественное изучение жизнеспособности ИКМ и их популяций и ее зависимости от различных факторов, действующих на микроорганизмы в процессе их иммобилизации и после его завер- шения,и разработка на этой основе рациональной системы протектив-ных мер, направленных на максимальное повышение выживаемости иммобилизуемых клеток.
В задачи данного исследования входило: I) изучение действия исходных индивидуальных компонентов полиакриламидного геля (ПААГ) и факторов, сопутствующих процессу полимеризации, на жизнеспособность бактерий; 2) исследование патофизиологических проявлений действия акриламида на бактерии в условиях, приближенных к процессу иммобилизации клеток в МАГ, ив условиях роста; 3) разработка подходов к рациональной оптимизации процесса иммобилизации клеток в ПААГ и режима их питания с целью получения популяций ИКМ с пролонгированным сроком жизни; 4) разработка адекватных методов контроля и прогнозирования жизнеспособности ИКМ.
Научная новизна работы. Проведено комплексное исследование действия факторов иммобилизации в ПААГ на жизнеспособность бактерий, показана существенная роль акриламида и свободных радикалов в снижении их жизнеспособности, изучены патофизиологические особенности действия акриламида на бактериальную клетку, выявлены подходы к оптимизации условий иммобилизации клеток в ПААГ, ориентированные на повышение выживаемости клеток в процессе их иммобилизации, выделены клоны с повышенной устойчивостью к влиянию процесса иммобилизации в ПААГ; определена сравнительная эффективность различных режимов поступления питательного субстрата в иммобилизованные системы.
Практическая ценность. Полученные в работе результаты могут служить методологической и практической основой для разработки рациональных схем иммобилизации различных микроорганизмов, обеспечивающих высокую выживаемость ИКМ. Установленная в работе принципиальная возможность выделения клонов с повышенной устойчивостью к процессу иммобилизации в ПААГ открывает новый перспективный путь для создания стабильных иммобилизованных систем пролонгиро^ ванного действия с высоким содержанием жизнеспособных микроорганизмов. Разработаны метод прогнозирования устойчивости клеток различных культур к факторам иммобилизации в ПААГ и "акриламид-ныи" тест для прямой микроскопической дифференциации живых и мертвых клеток и их количественного определения в популяциях грам-отрщательных бактерий.
Основные области применения иммобилизованных микробных систем
Микроорганизмы, как известно, могут существовать как в свободном, так и в связанном состоянии. В последнем случае они либо прикреплены к какому-либо твердому или нерастворимому материалу, либо включены внутрь его, т.е. локализованы в определенной области пространства их индивидуальная подвижность частично или полностью ограничена. Подобные клетки обычно обозначают как иммобилизованные.
Иммобилизованные клетки микроорганизмов (ИКМ) широко распространены в природе и давно известны как активные компоненты различных экосистем. Они играют ведущую роль в осуществлении важнейших процессов, протекающих в почве, воде (Звягинцев, 1973,1977, 1978; Abbott, 1977; Mishustin, 1978; Poster, Rovira, 1978 и др.). Так, например, хемоавтотрофные бактерии, прикрепляющиеся к поверхности минералов, ответственны за выщелачивание руд путем окисления минеральных сульфидов (Abbott, 1977). ИКМ являются постоянным компонентом активированного ила (Долобовская, 1978; Долобовская, Стеценко, 1978). Кишечник, зубной налет, кожа животных, корни растений и многие другие биологические объекты можно рассматривать как примеры экосистем в которых ИКМ играют исключительно важную роль (Savage, 1978; Garland et al., 1978; Michitsh et al., 1978; Venkatasubramanian, Vieth, 1979).
Кроме того, широко известны примеры активного закрепления микроорганизмов на поверхностях из нержавеющей стали, что способствует интенсивной коррозии металла, обрастания подводных частей судов, трубопроводов, поверхностей оптических деталей, стенок ферментеров и т.п. (Розенберг и др., 1959; Горбенко, 1966; Larsen, Dimmik, 19б4; Characklis, 1973; Родионова, Березниковская, 1976; Molin et al., 1982). Эти явления необходимо учитывать при осуществлении соответствующих процессов и операций. Способность микроорганизмов адсорбироваться на твердых поверхностях положена в основу методов изучения почвенной микрофлоры (Звягинцев, 1959,1973; Звягинцев и др., 1977).
Приведенные выше примеры относятся к так называемой естественной иммобилизации микроорганизмов. Наряду с естественной возможна и искусственная иммобилизация микроорганизмов, т.е. искусственно осуществляемая человеком для решения тех или иных специальных задач, главным образом, биотехнологического назначения. Один из первых примеров такого биотехнологического использования ИКМ относится еще к 1823 году, когда Шуценбах начал применять древесные чаны с перфорированными днищами, упакованными древесными стружками, для производства уксуса (Abbott, 1977).
К настоящему времени ИКМ нашли широкое применение для проведения спиртового, ацетоно-бутилового, метанового и других брожений. Иммобилизованные дрожжи используются в виноделии и пивоварении для сбраживания сусла (Калюжный, 1957; Разуваев и др., 1975; Corrien et al., 1976; Колпакчи, 1978).
В 70-х годах начался новый этап в развитии биотехнологических аспектов применения иммобилизованных микроорганизмов. К настоящему времени на основе ИКМ в промышленном масштабе разработан и успешно используется ряд перспективных технологий по производству ь-аспарагиновой, ь-малеиновой, урокановой кислот, фруктозы, сахарозы, галактозы, цитруллина. Ведутся широкие исследования по разработке технологии получения с помощью ИКМ таких органических соединений, как углеводы, аминокислоты и другие органические кислоты, спирты, антибиотики, витамины, ферменты, стероиды (chibata et al., 1974,1979; Chibata, Tosa, 1977;1980; Chibata, 1980;
Abbott, 1977,1978; Скрябин и др., І974а,б;І979; Klein,Wagner,1978; Cheetham, 1980; Кощеенко, 1981,1983; Kosheenko et al.,1983; Яковлева, Щербакова, 1982; Зуева и др., 1983; Мартинес и др., 1983; Oda et al., 1983; Gantarella et al.,1983; и др.). Изучается ВОЗМОЖНОСТЬ использования ИКМ для генерирования электрического тока (Weetall, Bennett, 1976; Karube et al., 1977). ИКМ ИСПОЛЬЗУЮТСЯ для образования молекулярного водорода (Зацепин и др., 1977; Mat-sunaga et al., 1980; Karube et al., 1982; Muallem et al., 1983; Зацепин и Нетрусов, 1983). Большой интерес вызывает способность ИКМ деградировать некоторые вещества. Например, иммобилизованные клетки Lactobacillus casei могут быть использованы для удаления малеиновой кислоты из вина, клетки Candida tropicalis - для деградации фенола, Pseudomonas aeruginosa - для разложения и удаления ИЗ СТОЧНЫХ ВОД нитратов (Hackel et al,, 1975; Abbott, 1977,1978; Klein, Hackel, 1979). ИКМ также способны удалять из сточных вод некоторые тяжелые металлы, такие как плутоний, тритий, уран (Hollo, Toth, 1979; Venkatasubramanian, Vieth, 1979; Nakajima et al., 1982). в настоящее время бактерии используются для денитрифи-кации ВОДЫ (Mlsson et al., 1980; Nilsson, Ohlson, 1982), ДЛЯ очистки белков и некоторых других веществ (Mattiasson, Ramstorp, 1980).
На основе ИКМ создан целый ряд высокочувствительных электродов для количественного определения ь-треонина, L-серина (Watana-be et al., 1982), L- ргинина, Ь-аспартата, цистеина (Mattiasson, 1979; Rechnitz et al., 1977; Kobos, Rechnitz, 1977), глутамина (Rechnitz et al., 1978), глюкозы (Mattiasson et al., 1977), L-ac-корбиновой кислоты (Matsumoto et al., 1982), никотиновой кислоты (Matsunaga et al., 1978), антибиотиков (biungholm, Wadso, 1976. Tanaka et al., 1982), фенола (Neujanr, Klein, 1979), аммиака (Di Paolantonio et al., 1981; Karube et al., 1981; Okada et al., 1982), перекиси водорода (saga et al», 1981), катионов меди и цианистых солей (Mattiasson, 1979), а также для оценки общего оо держания органических веществ в сточных водах - так называемый BOD-ceHCop" (Karube et al., 1977а,Ъ; Mattiasson, 197 , ДЛЯ ИММу-ноизмерений (Brunda et al., 1977).
Столь широкое применение ИКМ в современной биотехнологии обусловлено их важными практическими преимуществами по сравнению со свободными клетками и иммобилизованными ферментами» При использовании ЙКМ обычно отпадает необходимость в дорогостоящих и трудоемких операциях выделения и очистки фермента, упрощается задача выделения целевого продукта, повышается активность и стабильность систем, удлиняется период их функционирования, что, в свою очередь, открывает возможность применения автоматизированных средств контроля и управления и, наконец, появляется реальная возможность осуществления сложных процессов, требующих функционирования целых метаболических путей клетки.
Влияние факторов иммобилизации в ПААГ на жизнеспо собность и ферментативную активность микроорганизмов
Из всех перечисленных факторов, сопровождающих иммобилизацию клеток в ПААГ, исследованию влияния на клетки компонентов по-лимеризационной смеси посвящено наибольшее число работ.
Скрябин с соавт. (1974а) и позже Вдовина с соавт. (1981) по казали, что из всех реагентов, используемых для образования ПААГ, наиболее токсичным по отношению к клеткам гриба Tieghemella orchidia является акриламид (АА), снижающий гидроксилирующую активность мицелия в большей мере, чем остальные компоненты полимери-зационной смеси. Морикава с соавт. (Moricawa et al., 1979а) показали, что АА и N» ,N ,к,її-тетраметилзтилендиамин (ТЕМЩ) являются наиболее сильно действующими реагентами, угнетающими способность клеток Penicillium chrysogenum синтезировать пенициллин G. Для клеток Clostridium эр., осуществляющих гидрогенирование -кетокислот и гидроксикислот, и Bacillus sp., синтезирующих пептидный антибиотик бацитрацин, показана наиболее выраженная токсичность АА и (JTH gSgOg по сравнению с остальными компонентами полимери-зационной смеси (Suzuki, Karube, 1979; Tisher et al., 1980). Обработка клеток Mycobacterium globiforme АА и смесью АА, МБА и KgSgOg приводила к снижению их дегидрогеназной активности (Скрябин, 1974а; Кощеенко и др., 1981). В клетках Bacillus megaterium наблюдалось снижение 20 оС- и 20 р -оксистероиддегидрогеназной активности и появление в реакционной среде неидентифицированного продукта после включения их в ПААГ и обработки АА и смесью реагентов, используемых для полимеризации последнего (Кощеенко и др., 1976). Фриман с соавт. (Freeman, Acharonovitz, 1981; Pines, Freeman, 1982) выявили инактивирующее воздействие мономерного АА, как и процесса образования ПААГ в целом, на клетки streptomyces ciavu ligerus - продуценты цефалоСПОрИНа - И Saccharomyces cerevisiae, осуществляющие конверсию глюкозы в этанол. Выдерживание в растворе АА при 37 С в течение 30 мин клеток s.cerevisiae приводило к полной потере их способности восстанавливать 3-метокси /\i»3»ou0;, 9(11) - 8,14-секоэстратетраендион - 14,17 (іулая и др., 1979). Атрат с соавт. (Atrat et al., 1980Ь) показали угнетающее влияние АА на способность клеток Nocardia erythropolis трансформировать стерины до Сг -отероидов. В работе приводятся данные об ингибиро-вании АА и акриловой кислотой полиферментной системы р -окисления, В работе Маттиассона с соавт. (Mattiasson et ai., 1977) показано, что 15-минутная обработка интактных свободных клеток s.cerevisiae 15 $-ным раствором АА и включение в 15 #-ный ПААГ приводит к снижению показателя жизнеспособности микробных популяций до 3 % и 6-8 %, соответственно.
Ряд работ посвящен исследованию влияния концентрации мономеров на ферментативную активность и жизнеспособность ИКМ. Сузуки С соавт. (Kokubu et al,, 1978; Suzuki, КагиЪе, 1979, Morikawa et al«» 1979a, Ь) наблюдали у ИКМ Penicillium chrysogenum, Bacillus sp. и B.subtiiis резкое снижение способности синтезировать антибиотики пенициллин G и бацитрацин и фермент оС -амилазу с увеличением содержания АА в ПААГ. Основную причину этого авторы видят в возрастании токсичности мономера с увеличением его концентрации. Использование 5 $-ного ПААГ позволило получить биокатализаторы с удовлетворительной активностью и стабильностью. Аналогичная зависимость активности ИКМ от содержания АА в ПААГ показана для клеток Corynebacterium dismutans, синтезирующих аланин из глюкозы и аммония (Sarkar, Mayaudon, 1983). Повышение концентрации АА с 5 до 30 % также приводило к резкому снижению 3-кетостероид- А -дегидрогеназной активности ИКМ Mycobacterium globiforme и способности трансформировать стерины у клеток M.phlei. Однако причину этого авторы видят не в усилении токсичности АА, происходящем при повышении его концентрации, а лишь в затруднении диффузии через мелкопористые 15-20 и 30 #-ные гели (Кощеенко и др., 1981; Борман, Туркина, 1983).
Увеличение силы повреждающего воздействия на клетки процесса полимеризации АА при повышении его концентрации показано в работах Мартина и Перлмана (1976а) и Чибата с соавт. (1974). Авторы высказывают предположение о том, что в процессе иммобилизации в ПААГ происходит нарушение проницаемости оболочек клеток E«coli и Gluconobacter melanogenus. Причем чем выше концентрация мономера, тем быстрее и интенсивнее происходит это нарушение. В ходе последующей инкубации ИКМ в реакционной среде такое нарушение целостности клеточной оболочки сопровождается лизисом клеток. Поскольку исследованные микроорганизмы использовались в однофермент-ных реакциях, описанные нарушения целостности клеток приводили к облегчению контакта интересующего фермента с субстратом и вследствие этого к повышению активности биокатализатора.
Таким образом, приведенные выше данные свидетельствуют о том, что в процессе включения в МАГ клетки подвергаются токсическому воздействию со стороны компонентов полимеризационной смеси - мономеров и катализаторов. Наиболее выраженное токсическое влияние оказывает АА, действие которого усиливается с возрастанием концентрации.
Методы количественного определения жизнеспособности микробных клеток
Для определения жизнеспособности, т.е. содержания живых особей в популяции, у свободных клеток микроорганизмов существует немало методов. Они подразделяются на прямые и непрямые. Наиболее адекватными и универсальными представляются прямые методы. Это культуральные методы, основанные на принципе определения содержания в популяции клеток, способных к росту, делению и образованию колоний. Прямые методы определения жизнеспособности микроорганизмов включают макрокультуральный и микрокультуральный.
Макрокультуральный метод состоит в выявлении только жизнеспособных организмов. Благодаря простоте, макрокультуральный анализ в различных модификациях нашел чрезвычайно широкое применение в микробиологической практике. Однако методы макрокультурального анализа обладают и существенными недостатками. Во-первых, они недостаточно точны. На их точность влияют качество и состав пита тельных сред, условия культивирования, адсорбция микроорганизмов поверхностью стекла (в пипетках, пробирках), возможность образования колоний из скоплений клеток, невозможность выявления особей, обладающих ограниченной способностью к росту и т.п. (Мейсель, 1961; Фихман, 1967; Postgate, 1967,1969; Кожевин, Звягинцев, 1980). Методы макрокультурального анализа отличаются также известной трудоемкостью и длительностью. И, наконец, к их недостаткам следует отнести невозможность выявления мертвых клеток в микробной популяции. Поэтому для определения процентного содержания живых клеток необходимо дополнительное определение общего числа клеток, что связано с определенными трудностями, особенно в случае бактерий.
С целью устранения недостатков макрокультурального анализа были предприняты попытки соединения культурального принципа с прямым микроскопическим наблюдением. В 1915 г. Фрост предложил мик-рокультуральный метод определения жизнеспособности микроорганизмов. Чашки Петри были заменены предметными стеклами. Подсчет микроколоний проводился под микроскопом. Это позволило значительно сократить время исследования, облегчить и сделать менее трудоемкой методику и повысить точность определения. Кроме того, микро-культуральный анализ ценен тем, что он позволяет определять соотношение жизнеспособных и мертвых особей в микробной популяции (Postgate, 1967,1969; Фихман, 1967). При необходимости определения абсолютной концентрации клеток микрокультуральный анализ может быть модифицирован таким образом, чтобы одновременно определялось относительное и абсолютное содержание живых и мертвых клеток, а следовательно, и их общая концентрация в исследуемой суспензии. Для этого к ней добавляют известный объем стандартной суспензии, например, калиброванной взвеси частиц латекса, инактивированных микробных клеток, отличающихся по форме или размерам от исследуе мых (Дуста, 1978).
За время, прошедшее с 1915 г., многие исследователи усовершенствовали микрокультуральный анализ. Микрокультуры для подсчета предлагалось выращивать на поверхности питательного агара, на фильтровальной бумаге, покрывающей агар, на мембранных фильтрах, в агаровых пленках, натянутых на проволочной петле (Postgate et al., 1961; Jebb, Tomlinson, 1960; Jannasch, Jones, 1959; Ивашкевич и др., 1959; Мейсель и др., 1961; Bretz, 1962; Kunicka-Goldfin-ger, Stronkowska, 1977; Ery, Zia, 1982). Валентайн И Брэдфилд (Valentine, Bradfieid, 1954) предложили в состав питательного агара вводить мочевину, диазоурацил, а Когурэ с соавт. (Kogure et al., 1979) - налидиксовую кислоту, что позволило облегчить прямую микроскопическую дифференциацию жизнеспособных,приобретающих вытянутую форму, от неизменяющихся, мертвых клеток. Все эти модификации микрокультурального анализа с успехом применялись для определения жизнеспособности самых различных групп микроорганизмов.
Определение содержания живых клеток
Суспензию исследуемых бактерий разбавляли D,0I М Иа-фосфат-ным буфером или физиологическим раствором до концентрации около I млрд клеток/мл. Каплю тщательно перемешанной суспензии клеток наносили на поверхность мясо-пептонного агара (МПА). Инкубацию образцов проводили в специальной микрокамере (Фихте и др., 1975). Для ее изготовления на поверхность стерильного предметного стекла наносили тонкий слой расплавленной агаризованной питательной среды - МПА. Из затвердевшего агара стерильным лезвием вырезали квадратную пластинку со стороной 0,5-0,7 см. На поверхность этой пластинки из МПА наносили каплю бактериальной суспензии, накрывали стерильным покровным стеклом со стороной 2,4 см. Зазоры между краями покровного стекла и поверхностью предметного стекла тщательно запаивали расплавленным парафином. Полученные микрокамеры помещали в термостат и выдерживали при оптимальной температуре роста бактерий до образования микроколоний. Для определения содержания живых клеток в иммобилизованных микробных популяциях клетки предварительно выделяли из геля. С этой целью гелевые гранулы стерильно растирали в фарфоровой ступ 58 ке в течение 10-20 секунд, затем суспендировали в 0,01 М На-фос-фатном буфере. После оседания частиц геля на дно ступки пипеткой отбирали надосадочную суспензию клеток, разбавляли до концентрации порядка Юмлн /мл, тщательно перемешивали и помещали на поверхность питательного агара в микрокамеру. После инкубации просмотр и микрофотосъемку препаратов проводили в микроскопе BU-2B (фирмы "Карл Цейсе", Йена) с фазовоконт-растным освещением. Определение относительной жизнеспособности (показателя жизнеспособности) микробных популяций. Показатель жизнеспособности (Пж) исследуемых популяций определяли из процентного соотношения содержания жизнеспособных клеток (Еж), т.е. клеток, давших начало микроколониям, к общему числу клеток (N) по следующей формуле (Postgate, 1969): Пж = -Ї2- 100 % На рис.3 представлена схема определения показателя жизнеспособности популяции ИКМ. Из каждого образца готовили от 5 до 15 препаратов, в каждом из которых просчитывали не менее 30 полей зрения. Результаты подсчетов подвергали статистической обработке (Терентьев, Ромтова, 1977). б) Макрокультуральный анализ В каждой из исследуемых бактериальных суспензий отдельно определяли концентрацию жизнеспособных клеток и общее содержание клеток - жизнеспособных и нежизнеспособных. Общую концентрацию клеток определяли с помощью "стандартной" суспензии дрожжей Schi-zosaccharomyces pombe, убитых нагреванием и окрашенных метиленовим синим. Для этого 0,5 мл бактериальной суспензии смешивали с 0,5 мл "стандартной" суспензии дрожжей, концентрация которых была
Схема определения показателя жизнеспособности популяции ИКМ. предварительно определена в камере Горяева и составляла 4,365х хЮ клеток/мл. Каплю тщательно перемешанной суспензии бактерий и дрожжей наносили на обезжиренное предметное стекло, высушивали, фиксировали над пламенем горелки, окрашивали метиленовим синим. Готовый препарат просматривали под микроскопом МБИ-3 в фазовом контрасте, подсчитывая в каждом поле зрения количество бактерий и количество дрожжей. Для вычисления концентрации бактерий (Сбакт.) в исследуемой суспензии отношение общего количества бактериальных клеток ( бакт.) в препарате к общему количеству клеток "стандартной" суспензии (Идрож.) умножали на титр "стандартной" суспензии: Сбакт. = акт.. 4,365х106 я дрож. Содержание жизнеспособных клеток в исследуемой бактериальной суспензии определяли методом последовательных разведений. Для этого готовили ряд десятикратных разведений и по 0,05 мл каждой суспензии распределяли по поверхности МПА в 4-6 чашках Петри. После 20-часовой инкубации при температуре роста культуры подсчитывали количество выросших колоний и определяли среднее значение (Кор.). Концентрацию жизнеспособных бактерий (Сж бакт.) определяли по следующей формуле:
