Введение к работе
Актуальность проблемы
Одним из приоритетных направлений современной микробиологии и биохимии является расшифровка путей индуцирования биохимических процессов онтогенетического развития грибов. Происходящие при росте и развитии грибного организма сложные физиологические и биохимические процессы, их интенсивность во многом определяются факторами внешней среды, которые требуют детального изучения.
Среди культивируемых базидиомицетов Lentinus edodes (шиитаке) безусловно относится к числу наиболее перспективных объектов. Этот гриб занимает второе место в мире по объему промышленного производства и обладает ценными питательными и целебными свойствами [Wasser and Weis, 1999; Zaidman et al., 2005; Hearst et al., 2009; De Roman, 2010; Shen et al., 2011]. Большое значение имеет вопрос о возможной оптимизации искусственного выращивания этой культуры. Внедрение биологических способов стимуляции роста мицелия и защиты его от посторонней микрофлоры позволило бы улучшить технологию выращивания, сократив время культивирования шиитаке и одновременно подавив рост контаминантов гриба. Повысить устойчивость гриба к негативным воздействиям окружающей среды можно, вероятно, за счет выращивания его совместно со стимулирующими рост микроорганизмами.
Бактерии рода Azospirillum, представители группы ризосферных бактерий, являются ассоциативными азотфиксаторами, стимулирующими рост и развитие растений посредством фиксации атмосферного азота и гормональной регуляции [Steenhoudt and Vanderleyden, 2000; Bashan and de-Bashan, 2010; Fibach-Paldi et al., 2011]. Отмечается бактерицидная и фунгицидная активность азоспирилл [Red'kina, 1990; Милькова и др., 2003] и их лектинов [Никитина, 2001] в отношении некоторых бактерий и микроскопических грибов. Сведения о совместном культивировании базидиомицетов с бактериями рода Azospirillum в искусственных условиях в литературе отсутствуют. Можно было надеяться, что в двойной культуре шиитаке с азоспириллами проявятся ростостимулирующие свойства этих бактерий, будет иметь место усиленная продукция соединений различной природы, способствующих росту мицелия. К числу таких ростостимулирующих веществ относятся фитогормоны.
Роль растительных гормонов в морфообразовании высших грибов-ксилотрофов практически не исследована, хотя в литературе встречаются предположения о том, что фитогормонам принадлежит важное место в дифференциации грибной культуры, и что процесс морфогенеза тесно связан с динамикой уровня эндогенных регуляторов роста, в том числе основного фитогормона класса ауксинов - индолилуксусной кислоты (ИУК). Согласно литературным данным, фитогормоны, в том числе ИУК, в определенных, значительно различающихся для разных видов концентрациях могут оказывать положительное влияние на прорастание спор, рост вегетативного мицелия и образование плодовых тел базидиомицетов [McMeekin, 2000; Isikhuemhen and Vaugnas-Ward, 2005; Mukhopadhyay et al., 2005]. Крайне немногочисленны сведения об обнаружении ИУК и исследовании путей ее биосинтеза у ксилотрофных базидиомицетов. Сообщения об изучении синтеза индолилуксусной кислоты ксилотрофом Lentinus edodes в доступной нам литературе отсутствуют.
Большое значение для нормальной жизнедеятельности организмов имеет обеспечение необходимыми микроэлементами. Селен - эссенциальный микроэлемент для большинства живых организмов, влияющий на функциональное состояние клетки и метаболические процессы [Барабой и Шестакова, 2004; Reilly, 2006]. Экспериментальные исследования показали, что различные селеновые соединения в разных концентрациях селективно влияют на развитие, скорость роста грибов и продукцию биоактивных компонентов, либо подавляя, либо стимулируя эти процессы.
Значительное количество работ посвящено исследованию действия неорганических форм селена на биохимический состав грибов [Ogra et al., 2004; Zhao et al., 2004b; Munoz et al., 2006; Falandysz, 2008]. В то же время влияние на грибные культуры органических соединений селена и метаболические пути утилизации этих веществ остаются практически не изученными.
В последние годы в связи с наблюдающимся в ряде регионов дефицитом Se в рационе людей и животных все больше развивается производство различных селен-обогащенных продуктов как с помощью добавления селена в готовые пищевые продукты, так и путем выращивания различных сельскохозяйственных культур на обогащенных селеном средах [Combs, 2001; Whanger, 2002]. Многие виды макромицетов обладают способностью к аккумуляции селена в очень высоких концентрациях [Голубкина и др., 2000; Borovicka and Randa, 2007; Falandysz, 2008]. Поэтому исследование метаболизма селена у базидиомицетов не только имеет большое фундаментальное значение, но и может получить практическое применение для биологического синтеза низкотоксичных органических селеновых соединений (селенопротеинов и селеновых аминокислот) [Ogra et ai, 2004; Du et ai, 2007]. Перспективным направлением является также получение наночастиц элементного селена с помощью грибного мицелия [Sastry et ai, 2003; Narayanan and Sakthivel, 2010; Popescu et ai, 2010; Musarrat ef ai, 2011].
Все это обусловливает необходимость изучения индольных и селенорганических соединений, а также совместного культивирования с бактериями в связи с процессами цитодифференцировки и морфообразования грибов, выявления роли этих факторов в жизнедеятельности грибных культур. Представляло интерес сравнить действие этих разных по природе факторов между собой. Такого рода исследования могли бы быть полезны для целенаправленного отбора эффективных индукторов, повышающих стресс-устойчивость съедобных культивируемых грибов, как это имеет место у растений [Dat et ai, 1998].
Важность изучения и разнообразие эффектов биотических и абиотических факторов в онтогенезе базидиомицетов, а также разностороннее значение гриба шиитаке, ко времени начала наших исследований явно не согласовывались с недостатком сведений о роли индольных соединений и путей их трансформации, селенсодержащих органических соединений в жизнедеятельности высших грибов. Не изучалась двойная культура базидиомицета Lentinus edodes с бактериями вообще, и в частности с известными продуцентами фитогормона индольной природы - почвенными ассоциативными бактериями рода Azospihllum. На основании вышеизложенного нами было предпринято настоящее исследование.
Цель данной работы - исследование совместного культивирования ксилотрофного базидиомицета Lentinus edodes (Berk.) Sing, с бактериями Azospihllum brasilense и выявление роли индольных и селенсодержащих соединений, характеристик их биосинтеза и путей трансформации у грибной культуры.
Задачи исследования:
Оптимизировать условия совместного культивирования L edodes F-249 и A. brasilense Sp7.
Изучить влияние азоспирилл на рост, морфологические и биохимические особенности L. edodes F-249.
Исследовать воздействие экзогенной ИУК и предшественников ее биосинтеза на рост и развитие L edodes F-249.
Выявить способность L edodes F-249 к синтезу ИУК под влиянием различных индольных соединений.
Установить пути биосинтеза ИУК изучаемой культурой L. edodes F-249 при выращивании ксилотрофа в присутствии экзогенных синтетических аналогов соединений -предшественников ИУК.
Изучить влияние органического селенсодержащего соединения (ДАФС-25) на рост L edodes F-249 на жидких и твердых средах разного состава.
Определить возможные пути метаболизма селенорганического ксенобиотика ДАФС-25 у шиитаке.
Научная новизна работы
Впервые была экспериментально подтверждена возможность, подобраны условия и показана эффективность совместного глубинного культивирования базидиомицета Lentinus edodes с бактериями Azospihllum brasilense и получения посевного мицелия на основе
промежуточной совместной культуры. Выявлены положительные эффекты совместного культивирования шиитаке и азоспирилл. Обнаружено снижение биотического влияния посторонней микрофлоры на мицелий шиитаке в условиях двойной культуры с A. brasilense Sp7, усиленное накопление маннита как биохимического предшественника подготовки к плодоношению, отсутствие увеличения лектиновой активности как один из показателей благоприятных условий роста шиитаке в присутствии азоспирилл.
Впервые обнаружена и количественно охарактеризована способность ксилотрофного базидиального гриба L. edodes к биосинтезу фитогормона ИУК и промежуточных соединений этого синтеза, а также влияние шести индольных соединений при экзогенном введении в среду на рост, морфогенез, уровень собственной продукции и конкурентные отношения триптофан-зависимого и независимого путей биосинтеза ИУК макробазидиомицетом.
Впервые выявлена индукция генеративной стадии развития шиитаке индольным производным. Установлено, что среди изученных соединений - предшественников ИУК только индолилацетамид в концентрации порядка 10"4 г/л в культуральнои жидкости L. edodes оказывает ярко выраженное стимулирующее влияние на формирование морфологической структуры - коричневой мицелиальной пленки шиитаке.
Впервые выявлено накопление элементного селена в результате трансформации селенорганического соединения высшим грибом Lentinus edodes, обнаружена стимуляция роста и развития мицелия под действием этого соединения.
Практическая значимость исследования
Научные положения работы выявляют первоочередные задачи начальных этапов изучения смешанных культур высших грибов с симбиотическими ускоряющими рост растений бактериями, функциональной роли последних в жизнедеятельности грибных культур, в адаптационных и морфогенетических процессах, расширяют и углубляют современные представления о разнообразии функций природных соединений группы индола, о физиолого-биохимических механизмах регуляции их продукции базидиомицетами; позволяют с новых позиций подойти к изучению селенорганических веществ.
В работе выявлены реальные пути оптимизации процесса получения плодовых тел ценного высшего гриба. Обнаруженное положительное влияние таких факторов, как совместное выращивание с азоспириллами и присутствие селенорганического препарата ДАФС-25, на рост и развитие грибной культуры может быть использовано для совершенствования условий культивирования шиитаке.
Материалы диссертации используются в научно-исследовательской работе ИБФРМ РАН, Института химии СГУ, лаборатории экспериментальной микологии Института микробиологии НАН Беларуси.
Основные положения, выносимые на защиту
Бактерии Azospirillum brasilense в условиях совместной культуры с базидиомицетом Lentinus edodes стимулируют рост, усиливают конкурентоспособность посевного мицелия в отношении контаминирующей микрофлоры и вызывают изменения в углеводном, жирнокислотном и белковом составе мицелия.
Культура L. edodes F-249 синтезирует соединения индольной природы при росте в условиях погруженного культивирования. Состав группы экстраклеточных индольных соединений шиитаке зависит от условий глубинного культивирования и включает в разных соотношениях следующие компоненты: L-триптофан, (З-индолил-3-уксусную кислоту, р-индолил-3-ацетальдегид, (З-индолил-3-ацетамид, индолил-3-пировиноградную кислоту, триптамин, 5-гидрокси-р-индолил-З-уксусную кислоту.
Путь биосинтеза ИУК изучаемой грибной культурой является триптофан-зависимым, однако происходит переключение на триптофан-независимый путь при выращивании ксилотрофа в присутствии экзогенного индола, а также при индуцировании биосинтеза индолил-3-уксусной кислоты ее микродобавками.
Селенорганическое соединение ДАФС-25 является экзогенным регулятором роста и развития L. edodes. В качестве одного из путей метаболизма ДАФС-25 впервые выявлено выделение элементного селена в глубинной культуре высшего гриба.
Работа выполнена в лаборатории микробиологии Учреждения Российской академии наук Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН в соответствии с плановой тематикой «Съедобные культивируемые грибы: физиология и биохимия» (№ гос. регистрации 01970008158, научный руководитель темы: д.б.н., проф. В.Е. Никитина); «Роль углеводсвязывающих гликопротеинов в процессах жизнедеятельности бактерий и грибов» (№ гос. регистрации 01200606184, научный руководитель темы: д.б.н., проф. В.Е. Никитина); «Изучение гликопротеинов и биогенных низкомолекулярных соединений в жизнедеятельности бактерий и грибов» (№ гос. регистрации 01200904389, научный руководитель темы: д.б.н., проф. В.Е. Никитина).
Работа частично поддержана грантами РФФИ-БРФФИ (РФФИ и Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследований; руководитель с российской стороны - д.б.н., проф. В.Е. Никитина): «Гликополимеры и углеводсвязывающие белки ксилотрофных базидиомицетов: функции и биологическая активность» № 06-04-81042-Бел_а (2006-2007 гг.); «Липофильные соединения мицелиальных грибов: образование, характеристика» № 08-08-90004-Бел_а (2008-2009 гг.); «Соединения фитогормональной природы в культуре базидиомицетов: биосинтез и физиологический эффект экзогенного воздействия» № 10-04-90021-Бел_а (2010-2011 гг.).
Апробация работы
Основные результаты работы были представлены на: Втором съезде Общества биотехнологов России (Москва, 13-15 октября 2004); Всерос. научно-практ. конфер. «Вавиловские чтения - 2004» (Саратов, 24-26 ноября 2004); 3-м Всерос. Конгрессе по Медицинской микологии (Москва, март 2005); 9-й Межд. Пущинскои школе-конфер. мол. ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 18-22 апреля 2005); Всерос. конфер. «Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты» (Саратов, 15-17 июня 2005); Int. Conf. "Biocatalysis—2005: Fundamentals&Applications" (St. Petersburg, 19-23 June, 2005); 4-м Всерос. Конгрессе по Медицинской микологии (Москва, 29-31 марта 2006); 10-й Пущинскои школе-конфер. мол. ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 17—21 апреля 2006); Межд. науч. конфер. «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах (памяти профессора М.В. Гусева)» (Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 16-19 мая 2006); Межд. науч. конфер. «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 1-2 июня 2006); Межд. науч. конф. «Микробные технологии», поев. 140-летию со дня рожд. Д.К. Заболотного (Одесса, Украина, 11-15 сентября 2006); III межрегион, конфер. мол. ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 10-12 октября 2006); 5-м Всерос. Конгрессе по Медицинской микологии (Москва, март 2007); VI Всерос. интерактивной конфер. мол. ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, июнь 2007); XV Congress of European Mycologists (St. Petersburg, 16-22 September 2007), Межд. научно-практ. конф., поев. 120-й годовщине со дня рожд. акад. Н.И. Вавилова «Вавиловские чтения - 2007» (Саратов, 27-30 ноября 2007); Междунар. науч. конф. «Проблемы биоэкологи и пути их решения (Вторые Ржавитинские чтения)» (Саранск, 15-18 мая 2008); Втором Съезде микологов России (Москва, 16-18 апреля 2008); IV межрегиональной конфер. мол. ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 14-16 октября 2008); Межд. научно-практ. конф. «Вавиловские чтения - 2008» (Саратов, 26-27 ноября 2008); II Всерос. с межд. участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009» (Пермь, 25-29 мая 2009); «VII Межд. Симпозиуме по фенольным соединениям: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 19-23 октября 2009); Межд. науч.-практ. конф. «Вавиловские чтения -2009» (Саратов, 25-26 ноября 2009); 14-й Пущинскои межд. школе-конф. мол. ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 19-23 апреля 2010); VII Межд. конф. «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 31 мая-4 июня 2010); V Всерос. конф. мол. ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 28 сентября-1 октября 2010); VIII Межд. конф. «Биоантиоксидант» (Москва, 4-6 октября 2010); Всерос. симпозиуме с межд. участием, поев.
85-летию со дня рожд. В.А. Кумакова «Физиолого-биохимические основы продукционного процесса у культивируемых растений» (Саратов, 13-15 октября 2010); Межд. конфер. «Биотехнология, нанотехнология и физико-химическая биология», поев. 100-летию со дня рожд. академика Т.Б. Дарканбаева (Алматы, Казахстан, 28-29 октября 2010); Межд. науч.-практ. конф. «Вавиловские чтения -2010» (Саратов, 25-26 ноября 2010); Всерос. симпозиуме с межд. участием «Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее» (Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова. Биологический факультет. 27-29 января 2011), а также на научных конференциях и семинарах ИБФРМ.
Личный вклад соискателя состоит в постановке и разработке путей выполнения всех основополагающих задач, решаемых в рамках диссертационной работы, ключевая роль на всех этапах исследования и интерпретации полученных результатов, участие в подготовке публикаций.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 28 научных работ, в том числе 6 статей в рецензируемых изданиях и 14 статей в сборниках научных трудов.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, 3 основных глав и ряда подглав, включающих обзор литературы, описание материалов и методов исследования, изложение полученных результатов и их обсуждение, заключения, выводов, списка использованных источников литературы.
Работа изложена на 169 страницах машинописного текста. Иллюстративный материал представлен 38 рисунками и 8 таблицами. Список цитируемой литературы включает 248 источников, в том числе 170 зарубежных, 116 опубликованы в XXI веке.
Похожие диссертации на Влияние внешних факторов бактериальной, индольной и селенорганической природы на рост и развитие ксилотрофного базидиомицета Lentinus edodes
