Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Распространение микроорганизмов в почвах . б
Глава II. Влияние температуры на рост и развитие микро организмов 13
Глава III . Влияние влажности на рост и развитие микроорганизмов .' 24
Глава ІV. Объекты и методы .40
Объекты исследования 40
Распространение в природе исследуемых грибов 40
Методы исследования 42
Получение споровой суспензии 43
Средыі условия культивирования 43
Прорастание конидий 44
Определение радиальной скорости роста . 44
Наблюдение за циклом развития 45
Глава V . Прорастание конидий грибов 46
1. Прорастание конидий изучаемых грибов при различных температурах 47
2. Влияние осмотического потенциала на прорастание конидий 52
3. Влияние концентрации глюкозы на прорастание и лаг-период грибов при различных температурах и осмотических потенциалах 57
Глава VІ . Радиальная скорость роста изучаемых грибов 76
I. Влияние температуры на радиальную скорость роста грибов при разных концентрациях глюкозы в среде 76
2.Радиальная скорость роста у штаммов одной популяции при разных температурах 88
3. Влияние осмотического потенциала на радиальную скорость роста 101
Глава VII . Влияние температуры, осмотического потенциала, концентрации субстрата на прохождение стадий в цикле развития грибов-микромицетов 117
1. Penicillium frequentans 117
2. Aspergillus terreus 120
3. Cladosporium cladosporioides из дерново-подзолистой почвы 124
4. Cladosporium cladosporioides из серозема 127
Заключение 130
Выводы 143
Литература 145
Приложение 174
- Распространение в природе исследуемых грибов
- Наблюдение за циклом развития
- Влияние осмотического потенциала на прорастание конидий
- Влияние температуры на радиальную скорость роста грибов при разных концентрациях глюкозы в среде
Введение к работе
Одной из насущных задач современной почвенной микробиологии является разработка представлений об основных закономерностях функционирования микробных сообществ в экосистеме, изучение взаимосвязей микроорганизмов друг с другом и с окружающей средой, В число этих задач входит и изучение места и роли почвенных грибов в функционировании экосистем.
Наряду с решением общих синэкологических проблем, которые имеют целью выяснить распределение потока вещества и энергии между отдельными компонентами экосистемы, не менее актуальным представляется разработка вопросов аутоэкологии, т.е. взаимоотношения отдельных видов микроорганизмов, в том числе и грибов, с окружающей средой, выяснение того, как виды функционируют в конкретных физико-химических условиях среды, как адаптируются к этим условиям, как на них реагируют (Звягинцев и др., 1976; Мирчинк, Демкина, 1977; Пианка, І98І).
К настоящему времени для ряда почв выявлены комплексы типичных видов грибов-микромицетов. Однако отсутствуют данные о том, в каких условиях конкретные представители таких комплексов наиболее активно функционируют.
К числу наиболее значимых факторов среды, от которых зависит развитие грибов в почве можно отнести концентрацию субстрата и гидротермические факторы - температуру и влажность. В на-
- 5 -стоящее время еще мало данных, позволяющих количественно оценить реакцию почвенных грибов на изменения окружающей среды и установить для них пределы температуры и влажности.
Практически отсутствуют комплексные исследования, в которых оценивалось бы влияние гидротермических факторов на прохождение полного цикла развития грибного организма. Нет четкого представления о том, существуют ли различия в этих характеристиках между организмами из разных местообитаний.
Целью настоящей работы было в направлении изучения ауто-экологии отдельных представителей типичных комплексов микроми-цетов из контрастных почв определить границы жизнеспособности и жизнедеятельности различных видов грибов в зависимости от температуры и водного (осмотического) потенциала при различных концентрациях питательного субстрата; найти оптимумы прорастания, роста , дифференциации таллома и прохождения полного цикла развития изучаемых организмов.
Основные задачи исследования:
Определение границ жизнеспособности грибов из контрастных местообитаний в зависимости от температуры и осмотического потенциала среды.
Определение границ, в которых возможен рост мицелия изучаемых грибов.
Изучение влияния концентрации глюкозы на рост грибов в различных условиях температуры и осмотического потенциала.
Изучение особенностей цикла развития в зависимости от температуры, осмотического потенциала, концентрации глюкозы.
Часть I.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Распространение в природе исследуемых грибов
В качестве объектов исследования были использованы штаммы трех видов грибов, входящих в состав комплекса типичных микромицетов двух контрастных типов почв: дерново-подзолистой и светлого серозема (Генджиев, 1978; Озерская, 1980), а именно Penicillium frequentans Westling. " Типичный Для дерново-подзолистой почвы, Aspergillus terreus Thom. Для светлого серозема, Cladosporium cladosporioides (Pries.) de Vries. с высокой частотой встречаемости обнаруживаемый и в том и в другом типе почв. Для статистической достоверности результатов и определения разброса внутри вида было взято по 10 штаммов каждого вида и, соответственно, по 10 штаммов ci. cladosporioides как из дерново-подзолистой почвы, так и из серозема. Все изучаемые грибы относятся к классу Deuteromycetes несовершенных грибов, в цикле развития которых отсутствует половая стадия, а бесполые спороношения представлены экзогенными спорами - конидиями.
Распространение в природе исследуемых грибов Исследуемые организмы имеют различные ареалы распространения, p. frequentans встречается преимущественно в лесных кислых почвах ( Warcup І95І; Domsh et al » 1980; Soderstr dm , І975), таких как дерново-подзолистые (Сизова, Супрун, І962;
Запрометова, 1977; Озерская, 1980; Озерская, Мирчинк, 1981), подзолы (Thornton , І956), торфянисто-глеевые (Беккер, Супрун, i960). Кроме того этот вид обнаруживается в почвах более южных зон: черноземе (Московец, 1957), даже в сероземах (Оразов, 1976; Domsh et al , 1980), в тропических почвах Австралии ( Chen , Griffin , І9бба, 1966 б), но не является типичным видом для этих почв. P. frequentans выделяется с убранного зерна пшеницы (Mislives , Tuite , 1970), в филосфере растений (Кузнецова, 1773).
A. terreus в основном встречается в почвах более южных зон, по сравнению с P. frequentans. По данным, приведенным в работе Домша с соавторами ( Domsh et al , І980) A. terreus выделяется в почвах таких стран, как Израиль, Кувейт, Сирия, Египет, Либия, Испания, Франция, Италия, Турция, Греция, Гондурас, Перу, Уругвай, Бразилия, США. (южные штаты), Австралия, Индия и многие другие. На территории СССР A. terreus чаще всего встречается в различных сероземах (Беккер и др., І9біа, І96І6; Захарченко, 1966; Оразов, 1976; Генджиев, І978). Кроме того он достаточно широко распространен в пустынных почвах (Оразов, 1976; Abdel-Hafez , 198 ), тропических почвах ( Chen , Griffin І9б6а, 1966 б; Saksena , 1955; Sandhu , Sidhu , 1980; Singh , Sandhu , 198 } Grosh , Dutta , i960). A. terreus выделяется, но не являясь типичным видом, из луговых почв лесостепи Украины (Жданова, Василевская, 198 ). Поскольку A. terreus способен расти в условиях низкого водного потенциала, он выделяется даже с бумаги (Нюкша, 1977). CI. cladosporioides встречается как на растительном ма-тариале, хотя гораздо меньше, чем ci. herbarum , так и в почве различных природных ЗОН ( Hogg, Hudson , 1966; Jensen , I rc-УК Г-ЇТ::ІІ;!. : І СССР j -1974; Jorgensens , Hodges , 1970; Webster , Hudson , 1958; Watson , І974). CI. cladosporioides выделяется из арктических и субарктических почв Аляски и Диксона ( Flaganan , 1978; Сизова, Бабьева, І98І), из тундровых почв (Бабьева, Сизова, 1983), подстилок (Vesser , Parkinson , 1975; Hering , І9б5; Мирчинк, Орлова, І962; Мирчинк, Демкина, 1975, 1977; Tokumasu, 1978) и почв (Шеховцов, І98І; Еникеева и др., І970) под различными лесами; в степных почвах (Халабуда, 1948; Жданова, І963), в сероземах (Оразов, 1976; Астанов, Оразов, І977; Генд-жиев, 1978), в тропических почвах (Anilkumar , Sastry , 1980). сі. cladosporioidesMOJKeT развиваться и в филоплане растений (Кузнецова, 1973; Wildman , Parkinson , 1979), на зерне различных злаков (Pelhate , І9б8), даже на произведениях искусства (Курицина, 1976).
Таким образом, можно сказать, что несмотря на достаточно широкие ареалы распространения р. frequentans обитает преимущественно в районах умеренного климата, тогда как A, terreus - в почвах южных зон. Оба организма можно отнести к группе сте-нотопных видов, в отличие от сі. cladosporioides , который одинаково интенсивно развивается в почвах практически всех природных зон, т.е. может рассматриваться как эвритопный организм.
Методы исследования Исследуемые грибы выделяли из экспериментальной дерново-подзолистой почвы, перенесенной на территорию почвенного стационара МГУ и засаженной различными видами древесной растительности ( P. frequentans , CI. cladosporioides ) И СВЄТЛОГО серозема типичного легкосуглинистого под эфимерной растительностью Туркменской ССР ( A. terreus» CI. cladosporioides )
Посев почвенных образцов производили по общепринятой методике, используя среду Чапека. Выделенные грибы определяли на основании кулыуральных и морфологических признаков на среде Чапека по определителям Пидопличко (1972), Левкиной (1974), Рапера и Тома ( Raper , Thorn , 1949), Рапера и енелл ( Raper, Penell , 1965).
Получение споровой суспензии Для получения споровой суспензии грибы выращивались в течение 7 дней на среде Чапека в пробирке (скошенный агар), после чего производили смыв, используя Ю мл стерильной дистиллированной воды. Для удаления обрывков мицелия полученную суспензию фильтровали через двухслойную марлю. Чистоту суспензии проверяли при микроскопировании в камере Горяева.
Наблюдение за циклом развития
Известно, что температура, являясь важным фактором среды, оказывает существенное влияние на рост микроорганизмов. Существует определенная зависимость активности внутриклеточных ферментов от температуры, которая проявляется в изменении скорости роста и накоплении биомассы. Влажность наряду с температурой, также является одним из наиболее значимых факторов, определяющих местообитание микроорганизмов.
Прорастание спор грибов, которым можно охарактеризовать жизнеспособность организма, в отличие от жизнедеятельности, определяемой скоростью роста, также зависит от температуры и влажности. Известно, например, что при понижении влажности интенсивность прорастания грибных спор снижается, увеличивается лаг-период. Однако большинство работ по изучению влияния как температуры, так и влажности на прорастание грибных спор проведено на фитопатогенных организмах и почти нет сведений о почвенных сапротрофных грибах. Кроме того остается неясным вопрос о том, как эти факторы окружающей среды влияют на организмы, обитающие в разных климатических, а, следовательно, экологических условиях. Насколько однотипно реагируют на изменение температуры и влажности грибы одного вида, выделенные из разных природных зон, а также различные штаммы одной популяции. Прорастание конидий изучаемых грибов при различных температурах
При определении прорастания конидий (экзогенных спор бесполого спороношения) популяций грибов, выделенных из почв разных природных зон, было обнаружено, что они прорастали в различных интервалах температур. Конидии популяции Penicillium frequentans , входящего в состав типичного комплекса микромицетов дерново-подзолистой почвы, прорастали в интервале температур от 15 до 37 (табл.З, рис.1), причем средняя интенсивность прорастания для всех штаммов популяции незначительно изменялась при температурах от 15 до 32 (8 -85$), затем несколько снижалась к 37, оставаясь, тем не менее, достаточно высокой (72$). Как при 5, так и при 42 прорастание полностью отсутствовало у всех десяти штаммов популяции. Таким образом, для конидий P. frequentans оптимальным для прорастания является достаточно широкий температурный интервал, причем однородность реакции популяции велика при всех исследуемых температурах.
Конидии популяции Aspergillus terreus» входящего в состав комплекса микромицетов, типичного для светлого серозема прорастали однородно в интервале температур от 2о до 42 (табл.З, рис.1). Через 24 часа после посева в указанном интервале температур интенсивность прорастания у всех десяти штаммов достигала 100$. Однако при температуре 47 проявилась неоднородная реакция популяции на эту температуру, наряду со стопроцентным прорастанием (шт.б, 10), у двух штаммов оно практически отсутствовало (шт.4, 5) (табл.З). При температурах 15 и 52 не прорастал ни один штамм. Таким образом, популяция A. terreus так же как P. frequentans , с одинаковой интенсивностью и одно - 48 Таблица 3 Прорастание конидий грибов при разных температурах культивирования (в процентах Прорастание Конидий Penicillium frequentans (а) и Aspergillus terreus (б) при разных температурах культизированияродно прорастала в широком интервале температур, однако, в данном случае при экстремальной для роста температуре однородность прорастания нарушалась. Прорастание конидий Cladosporium cladosporioides , независимо от местообитания наступало при более низких температурах, по сравнению с вышеоописанными популяциями.
Средняя интенсивность прорастания штаммов популяции сі. cladosporioides , типичного для комплекса микромицетов дерново-подзолистой почвы, нарастала от 56$ при 5 до S7$ при 26 (табл.3, рис.2), причем гетерогенность популяции по отношению к температуре больше проявлялась при низких температурах, с возрастанием температуры реакция популяции становилась более однородной: при 5 и 15 отклонения от среднего составляли 7 и 8, соответственно, тогда как при 20 и 2б лишь 3. При 32 реакция популяции была наиболее неоднородной, при преобладающем очень низком прорастании или его полном отсутствии у двух штаммов (2,8) процент был выше 70 (табл.3). При 37 не прорастал ни один штамм. Таким образом, у популяции Cl. cladosporioides интервал жизнеспособности сдвинут в сторону более низких температур, по сравнению с P. frequentans , хотя они оба входят в состав комплекса типичных видов дерново-подзолистой почвы умеренной зоны.
Влияние осмотического потенциала на прорастание конидий
Известно, что наибольшую устойчивость к дефициту влаги организм проявляет при оптимальной для роста температуре. Поэтому мы определяли возможность прорастания конидий изучаемых популяций грибов при температурах, оптимальных для роста каждой из них:1 » frequentans - 2б, A. terreus - 37, Cl. cladosporioides - 20 (из дерново-подзолистой почвы) и 2б (из серозема).
Конидии p. frequentans прорастали как при потенциале -54 бар, так и при -III бар (табл.4, рис.3). Причем при потенциале - 54 бар средняя интенсивность прорастания конидий была такая же, как на контроле (среда с потенциалом - 2,5 бар, температура 2б), популяция реагировала однородно (отклонения от среднего 3$). При потенциале - III бар наблюдалось снижение интенсивности прорастания до 33$ в среднем, однородность реакции была ниже, чем в предыдущем случае, при этом заметно увеличивался лаг-период. Для большинства штаммов он составлял 72 часа, од Таблица № 4. Прорастание (в %) конидий грибов при различных осмотических потенциалах среды-нако три штамма прорастали через 48 часов, а один штамм из десяти - через 9б часов. Интенсивность прорастания у штаммов проросших раньше со временем не увеличивалась. Таким образом, при понижении осмотического потенциала среды возрастала неоднородность популяции p. frequentans как по интенсивности прорастания, так и по продолжительности лаг-периода.
Конидии популяции A. terreus так же как p. frequentans прорастали при обоих потенциалах (табл.4, рис.3). При потенциале - 54 бар интенсивность прорастания была достаточно высокой (94$), но все же ниже, чем на контроле (100$), больше проявлялась неоднородность популяции. При потенциале - III бар интенсивность прорастания снижалась более значительно, процент проросших конидий изменялся от 25$ до 76$. Так же как у p. frequentans при этом потенциале отчетливее проявлялась неоднородность популяции, увеличивалась продолжительность лаг-периода, однако в отличие от P. frequentans , у всех Ю штаммов A. terreus продолжительность лаг-периода равнялась 48 часам.
Популяции сі. cladosporioides независимо от места обитания, в отличие от популяции р. frequentans и A. terreus , прорастали только при потенциале - 54 бар, при - III бар прорастание отсутствовало даже спустя 20 дней после посева (табл.4, рис.4).Средняя интенсивность прорастания была ниже у популяции, обитающей в дерново-подзолистой почве, чем в сероземе (71$ и 90$, соответственно). Популяция из дерново-подзолистой почвы была более гетерогенна, интенсивность прорастания у разных штаммов варьировала от 31$ до 87$, в то время как в популяции из серозема колебания ограничивались 72-100$.
Прорастание КОНИДИЙ ciadosporium cladosporioides из Дерно во-подзолистоіі почвы (а) и серозема (б) при разных осмотических потенциалах среды. -потенциала среды до значений, близких к экстремальным точкам (-III бар для P. frequentans , A. terreus ; -54 бар ДЛЯ С1. ciadosporioides ) обнаруживалась большая гетерогенность популяций по интенсивности прорастания, а в некоторых случаях и по продолжительности лаг-периода, Влияние концентрации глюкозы на прорастание и лаг-период грибов при различных температурах и осмотических потенциалах средыПри определении интенсивности прорастания конидий изучаемых популяций грибов была использована среда, содержащая 0.01$ глюкозы в качестве источника углерода.
Существуют противоречивые сведения относительно необходимости питательных веществ при прорастании спор различных грибов, поэтому для выяснения влияния концентрации источника углерода в среде на прорастание конидий и продолжительность лаг-периода как при различных температурных режимах культивирования, так и осмотических потенциалах среды мы определяли влияние глюкозы в среде на прорастание. Использовали следующие концентрации глюкозы: 0,001$, 0,01$, 0,1$, 1$. Из каждой популяции исследовали по I штамму.
Конидии P. frequentans после 15 часов инкубации независимо от концентрации глюкозы с одинаковой интенсивностью прорастали при температурах 20 и 26 (табл.5, рис.5а). При температуре 15 наблюдалось снижение прорастания как при очень низких концентрациях сахара (0,001$), так и при высоких (1$) (табл.5). При 32 и 37 через 15 часов конидии не прорастали, т.е. при этих температурах они имели больший лаг-период по сравнению с 15- б? Через 2ц часа прорастание происходило при о
Влияние температуры на радиальную скорость роста грибов при разных концентрациях глюкозы в среде
Выявив температурный интервал прорастания конидий изучаемых грибов как показатель жизнеспособности организм, мы использовали радиальную скорость роста в качестве показателя его жизнедеятельности. Радиальная скорость роста колонии на поверхности агаризо-ванной среды является важным параметром, характеризующим рост грибов, поскольку рост на твердых средах типичен для микроорганизмов в их естественной среде обитания (Звягинцев, 1973), кроме того, определение величины радиальной скорости роста позволяет количественно оценить степень влияния различных факторов на организм.
Радиальную скорость роста у одного штамма из каждой популяции определяли при изменении концентрации глюкозы в среде от 0,001$ до 1#, кроме того использовали среду без добавления глюкозы.Обнаружилось, что p. frequentans рос в том же интервале температур, что и прорастал (15 - 37) (рис.9, табл.13). При всех температурах скорость роста увеличивалась с возрастанием концентрации глюкозы в среде, достигая максимума при концентрации 1%. В зависимости от температуры скорость роста возрастала вплоть до 26 после чего убывала к 37 при всех использованных концентрациях глюкозы. Температура 26 являлась оптимальной для роста, тогда как при прорастании наблюдалась одинаковая интенсивность в достаточно широком интервале температур (20-32), в данном случае достигалась максимальная радиальная скорость роста для этого организма (к = 0,134 мм/ч при концентрации глюкозы 1$). С возрастанием температуры культивирования от 15 до 2б увеличивалась разница между минимальными и максимальными значениями скорости роста в зависимости от концентрации глюкозы при каждой температуре /15 - Kr(max-min) -= 0,030 мм/ч; 20 - Kr(raax-min ) = 0,041 мм/ч; 2б - Kr(max-min ) = 0,064 мм/ч/, при 32 различия уменьшались, достигая приблизительно того же уровня, что и при 20 /к (max-min) = = 0,043 мм/ч/. Наименьшая разница между максимальным и минимальным значениями скорости была при 37 (к = 0,014 мм/ч). Можно сказать, что 37 - наименее благоприятная для роста P. frequentans температура: радиальная скорость роста при этой температуре минимальна по сравнению со всеми изученными температурами, концентрация глюкозы мало влияла на изменение скорости.
Рост A. terreus , так же как p. frequentans , осуществлялся в том же интервале температур, что и прорастание (20-47). Максимальная радиальная скорость роста достигалась при концентрации глюкозы в среде 1% независимо от температуры (рис. 10, табл.14). Оптимальной для роста этого организма установлена температура 37 ( Кг от 0,008 мм/ч до 0,32 мм/ч), тогда как прорастание происходит с одинаковой интенсивностью в широком интервале температур (20-42). При увеличении температуры от 20 до 37 скорость возрастала в зависимости от концентрации -глюкозы в среде с 0,069 - 0,088 мм/ч (на среде без добавления глюкозы) до 0,184 - 0,300 мм/ч (концентрация глюкозы 1%), При температуре 26, в отличие от всех других, скорость росла в интервале концентрации глюкозы только от 0$ (среда без добавления глюкозы) до 0,005$, увеличившись с 0,151 мм/ч до 0,182 мм/ч, далее практически не изменяясь (0,182 - 0,І8бмм/ч). 32 - более подходящая для роста температура, чем 42 (32-Кг = 0,200 - 0,272 мм/ч, 42 - кр = 0,171 - 0,241 мм/ч), однако различия между минимальной и максимальной скоростью роста в зависимости от концентрации глюкозы при этих температурах одинаковы (Kr(max-min) = 0,070 мм/ч).
Наименьшая скорость роста проявлялась при 47 (к = 0,043 -- 0,070 мм/ч). При этой температуре, так же как при 20, происходило наименьшее увеличение скорости роста с возрастанием концентрации глюкозы. Таким образом, заметное возрастание радиальной скорости роста A. terreus при увеличении содержания глюкозы в среде, происходило в интервале температур от 32 - до 42, т.е. в наиболее оптимальном для роста. CI. cladosporioides , выделенный из дерново-подзолистой почвы, в отличие от предыдущих организмов, рос в более узком интервале температур (5-26),чем прорастал (5-32), т.е. интервал жизнедеятельности у него уже, чем интервал жизнеспособности. Рост отсутствовал уже при 32, тогда как прорастание при этой температуре наблюдалось, хотя процент проросших спор был невелик. При всех температурах, подходящих для роста, радиальная скорость роста изменялась однотипно с увеличением концентр-рации глюкозы в среде (рис.11, табл.15), т.е. возрастала в интервале концентраций от 0% (среда без добавления глюкозы) до
Aposphaeria pulviscula (Иванушкина, Мирчинк, 1982), так же входящие в состав типичного для дерново-подзолистой почвы комплекса микромицетов. В определенном интервале концентрации источника углерода радиальная скорость роста этих организмов оставалась неизменной. Оптимальной для роста сі. cladosporioides была температура 20 (к от 0,047мм до 0,058 мм/ч), тогда как прорастание проходило с наибольшей интенсивностью при 26. Температуры 15 и 26 занимали промежуточное положение, причем при 15 скорость роста была выше, чем при 26 (0,037 - 0,045 мм/ч и 0,015 - 0,031 мм/ч, соответственно). Наименее благоприятной для роста из всех изученных температур была 5 ( к = 0,019 - 0,022 мм/ч). Как уже отмечалось, в интервале концентраций глюкозы от 0,1$ до 1$ скорость роста уменьшалась, причем наибольшее падение скорости наблюдалось при 20, т.е. оптимальной для роста температуре.
